Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar

Bu prosedürün genel amacı, beyin dokusunun hücre dışı alanındaki iyon dinamiklerini saptamak ve analiz etmektir. İyon geçici durumlarının ölçümü, çift namlulu veya konsantrik tasarıma dayalı olarak hazırlanabilen iyon seçici mikroelektrotlar kullanılarak gerçekleştirilir. İlk adım olarak, mikroelektrotlar deneysel banyoda kalibre edilir.

Ardından, hücre dışı iyon kaymalarını uyarmak için elektrotlar akut fare hipokampal dilimlerine yerleştirilir ve nörotransmitter glutamat veya bir glutamat agonisti uygulanır. Glutamat, postsinaptik dikenlerdeki ionotropik reseptörlere bağlanarak onları açar; bu da sodyumun hücre içine girişine ve potasyumun hücre dışına çıkışına olanak tanır. Nihayetinde bu durum, iyon seçici mikroelektrotlar tarafından tespit edilen hücre dışı sodyumda azalma ve hücre dışı potasyumda artışla sonuçlanır.

Bu yöntem, beyindeki hücre dışı iyon düzenlemesini ve aktiviteyle indüklenen demir geçişlerini incelemek için kullanılır. Burada, iki tip iyon seçici mikro elektrodun hazırlanmasını ve kalibrasyonunu açıklıyoruz. Bu elektrotların, nörotransmitter uygulamasına yanıt olarak hücre dışı potasyum veya sodyumdaki değişimleri ölçmek için akut beyin doku dilimlerinde nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Prosedür, laboratuvarımdan Nicole Hark ve Simon tarafından gösterilecektir. Bu prosedüre başlamak için, iyon hassasiyetli gövde olarak kullanılacak filamentli bir bor silikat cam kılcal bor ve daha sonraki referans gövde için bir tane daha hazırlayın. Ardından, uzun ve kısa kılcal borları her iki uçtan birbirine sabitlemek için iki bileşenli yapıştırıcı veya küçük bir alüminyum folyo şeridi kullanın.

Kalıntı nemi gidermek için çift kılcal boruyu bir fırında 60 °C'de bir saat boyunca ısıtın. Ardından, elektrotları kullanıma kadar bir desikatörde saklayın; çift kılcal boruyu döner başlık mekanizmalı dikey bir çekiciye yerleştirin. Kılcal borunun uzamasını önlemek için bir tebeşir kullanın.

Cam, revolverin yatay olarak döndürülmesine izin verecek kadar yumuşayana dek bobini nazikçe tutun. Soğumadan sonra 180 derece döndürün ve mekanik kırıcıyı çıkarın. İki adet keskin çift kanallı kılcal boru elde etmek için kılcal boruyu çekmek üzere ikinci bir ısıtma protokolü uygulayın.

Çift kılcal borunun uç çapı bir mikrona yakın olmalıdır. Kolonizasyonu önlemek için referans haznesini ucuna kadar distile su ile doldurun. İzleyen prosedürde, çift kanallı bir kılcal boruyu ucu yukarı bakacak şekilde özel yapım bir tutucuya yerleştirin.

Ardından bu tutucuyu, önceden ısıtılmış HMDS içeren geniş ağızlı şişenin üzerine yerleştirin ve 70 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, kapileri metal bir standa aktarın. Daha sonra, kolonizasyondan sonra her iki boruyu kurutmak için kapileri iki saat boyunca önceden ısıtılmış fırında bekletin ve kullanım zamanına kadar kapileri desikatörde kuru tutun.

Deney gününde, silikonlanmış gövdenin ucunu iki ila üç mikrolitre iyon seçici sensör ile doldurarak iyon seçici elektrodu hazırlayın. Ardından, sodyuma duyarlı bir mikro elektrot için 100 milimolar sodyum klorür veya potasyuma duyarlı bir mikro elektrot için 100 milimolar potasyum klorür salini ile gövdeyi geri doldurun. Bu işlem sırasında ek hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.

Eğer iyonizasyon başarılıysa ve sensör düzgün şekilde doldurulmuşsa, sensör yüzeyi arka dolguya karşı net bir şekilde görülebilen konkav bir yüzey olarak görünmelidir. Ardından, referans kanalını doldurun, sonra klorürlü gümüş telleri her iki namluya yerleştirin ve her bir namluyu diş mumu ile mühürleyin. Bu prosedürde, kısa bir koniklik ve dört mikron uç çapı elde etmek için yatay çekicide iki milimetrelik bir kapiler çekin.

Kullanımdan hemen önce, silikonize kılcal boruyu 0,2 µL sensör ile doldurun. İç kılcal boruyu hazırlamak için, uzun konikli ve sivri uçlu iki kılcal boru elde edecek şekilde küçük çaplı bir kılcal boruyu çekin. Ardından bunları 100 mM sodyum klorür veya 100 mM potasyum klorür salini ile doldurun.

Sensörle doldurulmuş kılcal tüp ile salinle doldurulmuş kılcal tüpü, lamelden yapılmış özel bir durdurucu üzerine birbirleriyle doğrudan aynı hizaya gelecek şekilde yerleştirin. Küçük kılcal tüpü, büyük kılcal tüpün içine kısmen yerleştirin. Ardından, kılcal tüpleri başka bir lamel üzerine sabitleyin.

Modelleme kili kullanarak kılcalları bir mikroskobun tablasına aktarın ve 100 x büyütmede görüntüleyin. Bir mikro manipülatöre monte edilmiş cam çubuk yardımıyla, uçları arasındaki mesafe yaklaşık beş mikron olana kadar dış kılcallı iç kılcallın üzerine doğru yavaşça ilerletin. Dış kılcallın açık ucunu diş mumu kullanarak iç kılcalla sabitleyin ve gümüş tel yerleştirin.

Referans elektrodu hazırlamak için, dikey bir çekicide filamentli bir kılcal boru çekin, üst pipeti atın, ardından alt tutucuyu açın ve alt pipeti yaklaşık beş milimetre yukarı kaldırın. Tutucuyu tekrar kapatın ve alt elektrodun ucunun ısıtma bobininin yaklaşık beş milimetre üzerinde konumlanacağı noktaya kadar yükseltin. Ardından bobini ısıtın ve bir pens yardımıyla ucu yana doğru yaklaşık 45 derece bükün.

Ucu tekrar ana şafta paralel olacak şekilde yaklaşık eksi 45 derece bükün. Ardından referans varili HEPES tamponlu salin ile doldurun. İçine klorürlenmiş gümüş tel yerleştirin ve varili diş mumu ile mühürleyin.

Bu adımda, hem iyon hassas elektrodu hem de referans elektrodunu mikro manipülatörlere sabitleyin ve bunları A CSF perfüze edilmiş bir deney odasına indirin. Stereo mikroskop altında, klorürlü gümüş telleri diferansiyel amplifikatörün kafa ünitesindeki ilgili girişlere bağlayın. Ardından elektrot dirençlerini belirleyin.

Ardından, voltaj sinyallerini sıfıra ayarlayın ve kalibrasyon için kayda başlayın. Kararlı bir baz hattı elde ettikten sonra, ölçülecek iyonun tanımlanmış konsantrasyonlarını içeren saline çözeltisine geçiş yapın. Şimdi, 250 mikron kalınlığında bir hipokampus kesitini deney haznesine aktarın ve bir ızgara ile sabitleyin.

Kalibre edilmiş iyon seçici mikro elektrodu dilim yüzeyine indirin. Ardından elektrodu, CA1 bölgesinin stratum radiatum tabakasına yaklaşık 50 mikron kadar daha indirin. Transmitter agonisti uygulamak için, uygulama pipetini 0.5 millimolar glutamat ile doldurun.

Pipeti bir mikromanipülatöre takın ve bir basınç uygulama cihazına bağlayın. Ardından, uygulama pipetini dokunun içine indirin ve iyon seçici mikro elektrodun ucuna yakın bir yere dikkatlice yerleştirin. Basınç uygulamasını 40 millibar ile başlatın.

Burada, banyo sodyum konsantrasyonundaki değişikliklere yanıt olarak çift namlulu bir elektrodun ve konsantrik bir elektrodun referans namlularındaki voltaj değişimi gösterilmektedir. Bunlar da banyo sodyum konsantrasyonundaki değişikliklere yanıt olarak çift namlulu bir elektrodun ve konsantrik bir elektrodun sodyum potansiyeli voltajındaki değişikliklerdir. Bu şekil, banyo sodyum konsantrasyonuna karşı her iki elektrodun sodyum potansiyeli voltajının yarı logaritmik grafiğini göstermektedir.

Lineer grafikler, her iki elektrot için de yaklaşık 48 milivoltluk bir eğim olduğunu göstermektedir. Burada, banyodaki sodyum konsantrasyonunun 152 milimolar'dan 70 milimolar'a hızlı değişimi karşısında çift namlulu ve konsantrik bir elektrodun yanıtı verilmiştir.

Konsantrik elektrodun yanıt süresinin önemli ölçüde daha hızlı olduğuna dikkat edin. Bu şekil, çift namlulu ve konsantrik elektrotlar tarafından tespit edilen hücre dışı sodyum geçişini göstermektedir; referans namluların voltajındaki geçişli değişimler ve hücre dışı sodyum konsantrasyonu, çubukla belirtildiği üzere 120 saniye boyunca 10 milimolar aspartat ile banyo perfüzyonu yapılarak indüklenmiştir. Bu şekilde ise, referans namluların voltajındaki geçişli değişimler ve hücre dışı sodyum konsantrasyonu, 0,2 saniye boyunca 10 milimolar glutamat ile yerel basınç uygulaması yapılarak indüklenmiştir.

Bu koşul altında konal elektrodun yanıt süresinin önemli ölçüde daha hızlı olduğuna dikkat edin. Bu prosedürü uygularken, uygun sessizleştirmenin demir seçici mikro elektrotların başarılı üretimi için kilit adım olduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, beyin dokusundaki hücre dışı demir geçişlerini saptamak için bu elektrotların nasıl hazırlanacağı ve kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.