Name: Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Öğrenin ekstraselüler iyon dinamiklerini ölçmek için çift namlulu ve konsantrik iyon seçici mikroelektrotların hazırlanmasını ve kalibrasyonunu. Fare hipokampal kesitlerinde potasyum ve sodyum konsantrasyon değişimlerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, uzman teknik yardım için C. Roderigo teşekkür etmek istiyorum. Biz video üretimi için yardım S. Köhler (İleri Görüntüleme Merkezi, Heinrich-Heine Üniversitesi Duesseldorf) teşekkür ederim. (MC) R01NS032123 hibe: (Ro 2327 / 8-1 CRR için DFG), (nh) Heinrich-Heine Üniversitesi Duesseldorf ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yazarın laboratuvarında araştırma Alman Araştırma Birliği tarafından finanse edilmiştir.

<ol><li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na%2B+and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li>
<li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li>
<li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate%2C+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li>
<li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li>
<li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li>
<li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li>
<li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKofuji%2C+P+%22Regulation+of+potassium+by+glial+cells+in+the+central+nervous+system%22">Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system</a>. , Springer. (2009).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+h%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li>
<li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li>
<li>Haack, N., Rose, C. R. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaack%2C+N+%22Microelectrodes%22">Microelectrodes</a>. Lei, K. F. , Nova Science Publishers. 87-105 (2014).</li>
<li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li>
<li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+astrocytic+Na+%2CK+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li>
<li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li>
<li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate%2C+AMPA%2C+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li>
<li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li>
<li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li>
<li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li>
<li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+%27in+vitro%27+hippocampal+slices+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li>
<li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li>
<li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li>
<li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Na%2B+and+Ca2%2B+in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na%2B-K%2B+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li>
<li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li>
<li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li>
<li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li>
<li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+recording+ion+specific+microelectrodes%3A+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li>
<li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Sıvı taşıyıcı bazlı, iyon seçici elektrotlar on yıllardır başarıyla birçok iyonlar için kullanılmıştır, son derece spesifik sensörleri 22-26 mevcuttur. ECS genişliği sadece yaklaşık 20-50 nm, seçici iyon çapı ise: Omurgalı beyin hazırlıkları dışı boşluk (ECS) kullanıldığında, kimse bu oldukça invaziv bir tekniktir ki, akılda tutmak gerekir Mikroelektronlar yaklaşık 1 mikron (çift namlulu elektrotlar) veya daha büyük (konsantrik elektrotlar) &#39;dir. Iyon seçici Mikroelektronlar uçları bu nedenle, sadece doku kendi kazığa oturtma sırasında dokulara zarar değil, aynı zamanda iyon geçici bir azımsanmasını lehine ECS büyütmek olacaktır. Bu tuzaklara rağmen, nöronal aktivite cevaben dışı iyon geçici bu yöntemin güvenilirliği doğrulayan farklı laboratuvarlarda 7,8 arasında belirgin tutarlıdır. Iyon seçici elektrot performansı ve uygunluğukullanılan sensor kokteyl (&quot;sıvı membran iyonofor &#39;) tarafından tanımlanan duyarlılık ve seçicilik, bağlıdır. Sensör kokteyller potasyum 27 için yüksek bir seçicilik gösterir K + -seçici mikro elektrod Valinomycin örneğin özel bir taşıyıcı molekül içerir. Rağmen, diğer iyonlar ile çapraz reaksiyon oluşabilir ve test edilmelidir. Valinomycin sonuçları değerlendirilirken göz önüne alınmalıdır amonyum için önemli çapraz reaktivite (örneğin 11,12) gösterir. Iyonoforlar gerilim-tepkisi Nernst davranışı (bakınız denklemi 1) takip ettiği başka, sinyal-gürültü oranı ve saptama eşiği ölçülecek iyonunun konsantrasyonuna bağlıdır. Böylece, ise küçük [K +] o geçici geçici çok daha zor hi karşı algılamak için vardır o alçak taban [K +] o, küçük [Na +] karşı büyük voltaj değişikliklerini uyandırmakGH bazal [Na +] o (bakınız Şekil 5 ve 6). Iyon seçici elektrot performansı büyük ölçüde elektriksel zaman sabiti tarafından yönetilir zamansal çözünürlüğü ile belirlenir. Ikinci esas olarak sensör eksenel direnci ile belirlenir ve iç çözeltiler ve dış sıvısı arasındaki pipet uzunluğu boyunca dağıtılmış kapasitans kullanılarak verilir. Iki namlulu bir yapılandırmada, direnç backfilled iyon sensörünün uzunlukta sütun nedeniyle yüksektir. (Bu durumda borosilikat cam), belirli bir yalıtkan dielektrik için, kapasite dielektrik kalınlığı ile yönetilir. Çift namlulu elektrotlar ise, dielektrik genişlik pipet cam duvarın tutarlar. Cam ucu yakın incelir gibi, dielektrik genişlik düşer ve kapasitans artar. Bu faktörler birkaç yüz milisaniye birkaç değişir tepki süreleri ile elektrotlar üretmek için bir arayasaniye olarak bu faktörler çeşitlidir. Konsantrik tasarımın en büyük avantajı eksenel direnci ve banyo kapasite hem büyük ölçüde azaltılmış olmasıdır. İpucu önce son birkaç mikrometre sadece bir kalıntısı bırakarak backfilled iyon değiştirici direnişin en konsantrik pipet şantlar. Buna ek olarak, konsantrik pipet içindeki dolgu çözümü fiziksel ölçüde kapasitansını azaltarak, iki cam duvar kalınlığı ile ayrılmış, banyo mesafeli edilir. 10 Daha önce gösterildiği gibi, daha az direnç ve kapasitans birleşik etkisi, iki büyük kertesine zamansal çözünürlüğü bir gelişmedir. Eş-Ca 2 + ve pH Mikroelektronlar halinde,% 90 tepki süreleri gibi düşük msn 10-20 olarak 10 idi. Eş-tasarımın bir avantajı, ilgili düşük ses seviyesi (bakınız Şekil 8). Herhangi bir Ambien gelen, büyük ölçüde azaltılmış direnci gerilim transientler sayesindet gürültü en aza indirilmiştir. Ayrıca, bu tür geçici kurtarma çünkü hızlı zaman sabitinin, hızlıdır. Bu tür eserler, bu nedenle küçük ve hızlı, ve fizyolojik kayıtları (bakınız Şekil 8) üzerinde daha az yıkıcı bir etkiye sahiptir. Eş-tekniğin dezavantajları da vardır. İlk olarak, bunların montajı daha karmaşık ve zaman alıcı bir iştir. İkinci bir dezavantaj, ayrı bir mikromanipülatör veya özel bir çift manipülatör ya kullanımını gerektirmeyen, kendi ucu ile ayrı bir referans mikroelektrot yer ihtiyacıdır. Son olarak, iki namlulu Mikroelektronlar konsantrik elektrotlar için mümkün değildir, aynı zamanda 28, iki farklı iyon türü tespitine olanak sağlayan, üçlü namlulu tasarım uzatılabilir. En yaygın tuzaklar Verimsiz silanizasyon. Herhangi bir sıvı-sens imalatında en önemli adım, ve asıl engelya göre iyon seçici mikroelektrot silanizasyon işlemdir. Elektrotlar spesifik iyon konsantrasyonuna değişikliklere yanıt, ya da bir alt Nernst cevabı (on kat konsantrasyon farkı başına, yani iyi az 58 mV) ile yanıt başarısız olduğunda, silanizasyon kötü etkinliği genellikle nedenidir. Atmosferik nem yaz veya kış yükseklikte koşulları tipik, çok yüksek veya çok düşükse Bizim tecrübelerimize göre, bu sırasıyla oluşabilir. Oda nem üzerinde bir miktar kontrol uygulamak için mümkün değilse, bu sorunlar aşılabilir. Elektrot direnci çok yüksektir. Gerekirse, iyona duyarlı bir kovanın direnci Kaynak ağzı azaltılabilir. Bu amaçla, bir kaç saniye için su içinde süspansiyon haline getirilmiş, bir aşındırıcı maddenin kuvvetli jet olan ucu maruz. Bu, upmost ucu kırmak ve istenen değere daha düşük direnci neden olur. Tuz köprüler. Tuziyon ve referans varil arasında köprüler zayıf ya da hiç tepki vermeyen elektrotlar neden ve dolayısıyla da büyük ölçüde kalibrasyon performanslarını karıştırabilir. (Nokta 1.6 bkz.) Yukarıda da belirttiğimiz gibi, bu çift namlulu teta cam seçilir bir sorun esas olmakla birlikte, burada açıklanan ofset, bükülmüş varil tekniğini kullanırken nadir görülen bir durumdur. Akılda imalat kolaylığı sayesinde, Lux 29 orijinal çift namlulu tasarım genellikle karlı kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda ucu ile, iyon değiştirici katılmasıyla, aşağıdaki, tuz çözeltileri, ucu olan emme ve çıkarma ile silan çözeltisine hızlı bir pozlama ile iyonu ve referans varil ön doldurma kullanır (30,31 bakınız) . Bu elektrotlar yaklaşık 10 dakika içinde imal, ama onların uç boyutu genellikle 4 mm veya daha fazla ve onlar bir deney sırasında başarısız daha yatkındır edilebilir. Bunun aksine, bu silanizasyon yöntemleri silan buhar ve ısı maruz kalınmasınıing küçük günler süren ipuçları ve bazen haftalık elektrotları üretebilir. Birlikte ele alındığında, birçok protokoller vardır ve iyon seçici Mikroelektronlar hazırlamak için nasıl yaklaşır. Burada, yakın% 100 genel başarı oranı ile, bizim laboratuarlarımızda iyi ve güvenilir çalışması bükümlü namlulu çift olarak konsantrik Mikroelektronlar imalatı için iki ana süreçleri de tarif etmiştik. Önemli olarak, bu teknikler, pH veya kalsiyum iyonları da dahil olmak üzere, diğer türler, ölçülmesi de aktarılabilir, ve aynı zamanda, genel olarak sıvı ile dolu boşlukların veya sıvıları da dahil olmak üzere beyinde dışında preparatlar için de geçerli olacaktır. Son fakat en az değil, iyon seçici Mikroelektronlar hücrelerin içinde iyon konsantrasyonlarının tespitine imkan. Nispeten büyük bir uç boyutu (~ 1 mm) arasında olduğundan, bu, bununla birlikte, omurgasız preparasyonlar 28,32 bulunan gibi yalnızca örneğin büyük bir hücre gövdesi, hücrelerde mümkün.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Beyindeki elektriksel sinyalizasyon, iyonların plazma zarları boyunca akmasına dayanır. Hücre dışı boşluğa giren ve çıkan ana iyon hareketlerine sadece voltaj kapılı iyon kanallarından geçiş değil, aynı zamanda postsinaptik iyonotropik reseptörler ve iyon taşıyıcıları da aracılık eder. Bu nedenle nöronal aktiviteye, tüm ana iyonların hücre dışı konsantrasyonundaki karmaşık değişiklikler eşlik eder 1. Örneğin, uyarıcı aktivite sırasında nöronlara sodyum akışının, hücre dışı sodyum konsantrasyonunda ([Na+]o) 2 bir azalmaya neden olduğu gösterilmiştir. Aynısı hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu için de geçerlidir, çünkü kalsiyum iyonları hızla hem pre- hem de postsinaptik yapılara girer 3. Aynı zamanda, potasyum ters yönde hareket eder ve bu, düşük mM aralığında 4,5 hücre dışı potasyum konsantrasyonunda ([K+]o) bir artışa aracılık eder. Sinaptik aktivite ayrıca, intraglial pH 6,7'yi değiştiren eşlik eden glial membran akıları tarafından kısmen hafifletilen hücre dışı pH'da değişikliklere neden olur. Hücre dışı iyon konsantrasyonlarındaki bu aktiviteye bağlı değişikliklerin önemli fonksiyonel sonuçları vardır. Örneğin, [K +]o'daki küçük artışlar bile nöronları ve glial hücreleri depolarize eder, böylece nöronal uyarılabilirliği değiştirir ve fazla potasyumu uzaklaştırmak için çeşitli mekanizmalar mevcuttur 8. Bunların başarısızlığı, nöronların epileptiform aktivitesine veya depresyonun yayılması gibi olaylara neden olabilir 1. 
Kritik önemleri nedeniyle, hücre dışı iyon konsantrasyonlarının kantitatif tayini, fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında sinir ağlarının işlevini ve işlev bozukluğunu anlamak için genellikle gereklidir ve gereklidir. Onlarca yıldır, çift namlulu iyon seçici mikroelektrotların beyin dokusunda bu tür ölçümler için mükemmel araçlar olduğu kanıtlanmıştır 9. Birçok iyon için, diğer iyonlar için düşük çapraz reaktiviteye sahip oldukça spesifik sensörler mevcuttur. Klasik çift namlulu elektrotlara ek olarak, konsantrik elektrotlar da yakın zamanda tanıtıldı. İkincisi üstün bir zaman çözünürlüğü sağlar, ancak 10'u oluşturmak için biraz daha fazla zaman ve çaba gerektirir. 
Aşağıda, bu iki tip iyon seçici mikroelektrotun hazırlanmasını ve kalibrasyonunu açıklayacağız. Daha sonra bu elektrotların, ilaçların banyo ve basınç uygulaması da dahil olmak üzere farklı stimülasyon paradigmalarını takiben uyarıcı aktivitenin neden olduğu [K +] o veya [Na +] o'daki değişikliklerin ölçümü için beyin dilimi hazırlıklarında nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>Aşındırıcı&nbsp; &nbsp;</td><td>Mikro Lehçe&nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>A.dest</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal</td> damarlarda çözülmüş <td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>Uygulaması pipeti; 75 mm x 2 mm, duvar kalınlığı 0,3 mm</td></tr><tr><td>Filamentli borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Elektromedikal Aletler, Harvard Aparatı</td><td>Çift namlulu mikroelektrotların sensörü için&nbsp;</td></tr><tr><td>Filamentli borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Elektromedikal Aletler, Harvard Aparatı</td><td>Çift namlulu mikroelektrotların referansı için&nbsp;</td></tr><tr><td>Filamentli borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>Bilim Ürünleri</td><td>Konsantrik, dış kanal. OD 2.0 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Filamentli borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>GB-120TF-10</td><td>Bilim Ürünleri</td><td>Konsantrik, iç kanal. OD 1.2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td></td> ile elektrometre amplifikatörü <td>Özel yapım</td><td>Rin = 10 T&Omega; ve Ibias=50 fA-1pA (ticari olarak temin edilebilir&nbsp; alternatifler: örn. Dagan IX2-700, headstage ile (10 Gig geri besleme direnci) veya EPMS-07, NPI, Tamm, Almanya)</td></tr> <tr><td>Deney odası</td><td></td><td>Ismarlama</td><td>Ticari olarak temin edilebilir örn. &nbsp; Warner Instruments, ABD; &nbsp; Scientifica, İngiltere</td></tr><tr><td>Fırını</td><td></td><td>Heraeus</td><td>200 °C'de sabit kalmalıdır; C</td></tr><tr><td>Sert yapışkan balmumu / diş balmumu&nbsp;</td><td>Deiberit 502&nbsp;</td><td>Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak plaka</td><td></td><td>Özel yapım</td><td>40 ° C'de sabit kalmalıdır; C</td></tr><tr><td>Pleksiglastan</td><td></td> yapılmış mikroelektrot tutucu <td>Özel yapım</td><td>Çift namlulu: OD &nbsp; kılcal damarlar 1,5 mm, konsantrik: O.D.&nbsp; kılcal damarlar 2 mm</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Leitz</td><td></td>Mikromanipülatör <td></td></tr><tr><td></td><td>MD4R</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>M205C</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Objektif Planı</td><td>0.8xLWD</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Pipet çektirme</td><td>Modeli PP-830</td><td>Narishige</td><td>Konsantrik mikroelektrotlar&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipet çektirme</td><td>Modeli P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td>Konsantrik mikroelektrotların sensörü&nbsp;</td></tr><tr><td>Pnömatik ilaç çıkarma sistemi</td><td>Picospritzter Tip II</td><td>General Valve TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Seyahat kırlangıç kuyruğu aşaması</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>İki bileşenli yapıştırıcı</td> <td>ve nbsp; Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>Kılcal damarları birbirine yapıştırmak için küçük bir alüminyum folyo şeridi de kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>Gümüş tel</td><td>%99,9&nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>Dilimleyici / Vibratom Mikrom</td><td>HM 650 V</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td></tr><tr><td>Yazılım</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Dikey çektirme&nbsp;</td><td>Tip PE-2</td><td>Narishige Bilimsel Aletler</td> Çift <td>namlulu mikroelektrotlar için döner aynalı</td></tr><tr><td>x/y çeviri aşaması</td><td></td><td>Ismarlama</td><td></td></tr><tr><td>1 (S), 9 (R) - (& eksi;)-Bicuculline methiodide</td><td>Sigma aldrich</td><td>14343</td><td>GABAA reseptörlerinin rekabetçi antagonisti (ışığa duyarlı); DİKKAT: toksik</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA / kainat reseptör antagonisti; DİKKAT: toksik</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA reseptör antagonisti; DİKKAT toksik</td></tr><tr><td>Heksametildisilazan (HMDS)</td> <td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td>DİKKAT: Yanıcı, akut toksisite (oral, dermal, soluma) ve metaller ve cilt için aşındırıcıdır</td></tr><tr><td>L-Aspartik asit</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>NMDA'yı ve NMDA olmayan ve EAAT'leri aktive eder</td></tr><tr><td>L-Glutamik asit monosodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1626</td><td>NMDA-R, AMPA-R, QA-R ve KA-R'yi aktive eder), &nbsp; mGluR'ler ve EAAT'ler</td></tr><tr><td>Potasyum iyonofor I - kokteyl B</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>60403</td><td>Valinomisin bazlı; DİKKAT toksik</td></tr><tr><td>Sodyum iyonofor II - kokteyl A</td><td>Fluka&nbsp; &nbsp;</td><td>71178</td><td>ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055'e</td> göre <td>Gerilime bağlı Na+ kanallarının inhibitörü; DİKKAT toksik</td></tr><tr><td>Su, ultra saf</td><td>Sigma aldrich</td><td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

beyin dokusu Ölçme ekstraselüler ion sinyalleri için Çift namlulu ve konsantrik mikroelektronlar

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Beyindeki elektriksel aktiviteye, zarlar boyunca önemli iyon akışları eşlik eder ve bu da tüm ana iyonların hücre dışı konsantrasyonunda karmaşık değişikliklere neden olur. Bu iyon kaymaları önemli fonksiyonel sonuçlar doğurduğundan, fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında sinir ağlarının işlevini ve işlev bozukluğunu anlamak için genellikle nicel tayinleri gereklidir. Bu çalışmada, beyin dokusunda bu tür ölçümler için mükemmel araçlar olduğu kanıtlanmış çift namlulu iyon seçici mikroelektrotların üretimini ve kalibrasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca, farklı tasarımlarına dayanarak, hızlı iyon değişikliklerinin çok daha iyi bir zamansal çözünürlüğünü sunan "eşmerkezli" iyon seçici mikroelektrotlar da açıklanmaktadır. Daha sonra bu elektrotların fare hipokampusunun akut beyin dilimi preparatlarında nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Çift namlulu, potasyum seçici mikroelektrotlar kullanılarak, glutamat reseptör agonistlerinin eksojen uygulamasına yanıt olarak veya epileptiform aktivite sırasında hücre dışı potasyum konsantrasyonundaki ([K+]o) değişiklikler gösterilmiştir. Ayrıca, sodyuma duyarlı, çift namlulu ve konsantrik elektrotların tepki özelliklerini gösteriyoruz ve ilaçların banyo veya basınç uygulamasıyla uyandırılan hücre dışı sodyum konsantrasyonundaki ([Na+]o) değişikliklerin tespitini karşılaştırıyoruz. Bu ölçümler, tepki genlikleri benzer olsa da, eşmerkezli sodyum mikroelektrotların, çift namlulu tasarıma kıyasla üstün bir sinyal-gürültü oranı ve tepki süresi gösterdiğini göstermektedir. Genel olarak, gösterilen prosedürler, pH veya kalsiyum dahil olmak üzere diğer iyon türlerinin ölçümüne kolayca aktarılabilir ve ayrıca diğer preparatlara da uygulanabilir olacaktır.

<html> Izlemek için [K +] o ve oluşan değişimler uyarıcı aktiviteye karşılık olarak, iki namlulu bir potasyum seçici mikroelektrot CA1 stratum radiatum sokulmuştur. Birkaç dakika Impalement sonra elektrot iyon seçici varil yaklaşık 2,8 mM, kullanılan ACSF [K +] yakın bir değere (o kadar [K +] tekabül eden, kararlı bir taban çizgisi (Şekil 7A) ulaşıldığında 2,5 mM). 10 sn için 0,5 mM glutamata Banyo uygulaması ~ 0.7 mM (Şekil 7A) tutarında taban altında undershoot, sonra, 4 mM o [K +] bir döner artışa neden. 0.4, 0.3, glutamat konsantrasyonunun azaltılması, ve 0.2 mM geçici bir artış ve [K +] o (Şekil 7A) içinde undershoot iki genliği karşılık gelen bir azalmaya yol açtı. OAD / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Şekil uyarıcı aktiviteye karşılık olarak 7. Hücre dışı potasyum geçici. (A): [K +] o geçici, gösterildiği gibi 10 sn için glutamat farklı konsantrasyonlarda banyo uygulaması ile uyarılan taban altında undershoot ardından bir artış, aşağıdakilerden oluşan. (B) glutamat reseptör blokerleri ile perfüzyon Etkisi (CNQX, 100 uM; APV, 100 uM) ile tetrodotoksine (TTX 0.5 uM) [K +] o geçici 10 sn için 0,5 mM glutamat banyo uygulaması ile uyarılan. 0mg 2 + / BIC varlığında (C) kendiliğinden [K +] o geçişler. Ac gösterilen deneyler çift namlulu elektrotlar kullanılarak yapıldı. Gösterim amacıyla, izleri Sawitzky-Golay filtresi (genişlik 20) ile düzeltti bulundu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Cl Lütfen</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya ick. Daha önce deneyler glutamat kaynaklı [K +] o sinyalleri belirgin TTX uygulama sırasında değişmiş olmadığını göstermiştir ve dolayısıyla voltaj kapılı sodyum kanalları ve nöronal aksiyon potansiyeli nesil 15,16 açılması büyük ölçüde bağımsız olması. Glutamata karşılık olarak gözlenen [K +] o değişikliklerin altında yatan mekanizmaları incelemek için, glutamat reseptör blokerleri, yani CNKX (100 uM; AMPA alıcılarının engelleyici) uygulanmış ve APV (100 uM; NMDA reseptörlerinin bloke) varlığında, TTX (0.5 uM). (Şekil 7B, örneğin 17), bu bloker banyo perfüzyon üzerine, glutamat kaynaklı [K +] değişikliklerden o önce bildirildiği gibi iyonotropik glutamat reseptör kanallarının açılması bağımlılığını teyit neredeyse mülga idi. Bundan başka t göstermek içinhücre-dışı üretimi için glutamaterjik uyarma o ilgisi [K +] sinyalleri, dilimler nominal Mg2 + içermeyen salin 10 uM bicuculline metiyodid (0mg 2 + / BIC) içeren perfüze edildi. Bu NMDA reseptörlerinin voltaja bağımlı Mg2 + -blok azaltır ve (örneğin 18,19) ağ spontan tekrarlayan epileptiform activity neden GABA A reseptörleri bloke ederek inhibe azaltır. Beklendiği gibi 20, kendiliğinden, tekrarlayan [K +] o geçici, yaklaşık 1.5 mM tutarında 0mg 2 + / BIC salin (Şekil 7C) &#39;de tespit edilmiştir. 0.2 bir ortalama amplitüdü olan, bu tepkiler arasında, daha küçük bir [K +] o geçici olarak mM (Şekil 7C) oluştu. Deneylerin ikinci setinde, biz uygulanması ile uyarılmış [Na +] o değişiklikleri belirlemek için [Na +] -duyarlı Mikroelektronlar kullanılanglutamat agonistleri. Burada, biz de iki farklı uygulama paradigmaları kullanan çift namlulu ve konsantrik Mikroelektronlar tepki özelliklerini karşılaştırdık. [Na +] -duyarlı Mikroelektronlar yaklaşık 50 uM&#39;lik bir derinlikte stratum radiatum içine yerleştirilmiştir. Stabil bir temel çizgisi elde edildikten sonra, glutamat agonistinin L-aspartat (2,5 ml / dakika ile 10 mM, 120 saniye, Banyo perfüzyonu) Banyo perfüzyonu başına uygulanmıştır. Daha önce 21 gözlendiği gibi, aspartat uygulama yaklaşık 5 dakika sürmüş ve daha sonra taban çizgisine geri (Şekil 8A) kurtarmak için başladı yaklaşık 15 mM ile o [Na +] yavaş bir düşüşe neden olmuştur. Her iki elektrot ile belirlenir: [Na +] o sinyalleri zirve amplitüdleri ve kinetiği bu koşullar altında hemen hemen aynı ise Özellikle, konsantrik elektrotlar daha stabil bir taban çizgisi ve gürültü seviyesini azaltır (Şekil 8A) arzetmiştir. R test etmek için<html> Daha hızlı bir uygulama paradigma altında farklı elektrot özelliklerini esponse biz iyon seçici mikroelektrot ucundan 20-40 um&#39;lik bir mesafe stratum radiatum yerleştirilmiş ince bir cam pipet ile glutamat uygulanan basınç. 21 Beklendiği gibi, 200 ms için glutamat uygulama (10 mM) [Na +] o (Şekil 8B) bir düşüşe neden oldu. [Na +] o düşüş zirve genlikleri elektrotların her iki tip için de aynı aralıkta idi (:;: 19.1 mM, n = 15 - - 2,0 konsantrik 13.5 mM, n = 14 4.5 çift namlulu). Ancak yavaş Banyo perfüzyonu (yukarıya bakınız), sinyal-gürültü oranı değil, aynı zamanda iki elektrot tip tespit [Na +] o sinyallerinin zaman tabii sadece elde edilen sonuçların aksine önemli ölçüde farklılık göstermiştir. Zirveye ortalama süre konsantrik Mikroelektronlar için namlulu çift ve sadece 1,3 saniye 3.5 saniye idi. ve_content &quot;&gt; Bu nedenle, bu sonuçlar, ve genel eş çift namlulu Na + -seçici Mikroelektronlar hızlı tepki kinetikleri onaylamak (bakınız Şekil 6C ve 8B), aynı zamanda Ca + 2 ve not edildi pH-seçici muadilleri 10 . Kısa patlama sinaptik stimülasyonu hızlı sinaptik kaynaklı iyon transientleri uyandırmak için yapıldığı eski çalışmada, aksine, sadece bir eğilim, ama bizim uygulama ile konsantrik ve çift namlulu elektrotlar arasındaki ortalama pik amplitüdlerinde anlamlı bir fark yoktu paradigması. Bu nedeni muhtemelen sonuç olarak iki (20-40 um) &#39;in bir faktör ile farklılık iyon seçici mikroelektrot ucu ve uygulama pipet mesafe, hedef bölgede maksimum glutamat konsantrasyonu zirve amplitüdlerinde varolan herhangi bir fark tıkayan, farklı deneylerde aynı değildi. (A) Üst izleri: volta DeğişimBir çift namlulu elektrodun (siyah noktalı iz) ve banyo Na + konsantrasyonu değişikliklere tepki olarak konsantrik elektrot (gri iz) referans varil (V ref) ve ge ([Na +] b) gösterildiği gibi. Her iki elektrot voltaj tepkileri hemen hemen aynı olduğuna dikkat edin. Alt izleri: iki namlulu bir elektrot (siyah iz) ve [Na +]; b değişikliklere karşılık olarak bir eş-elektrot (gri iz) Na + -potansiyel (V Na +) gerilim değişiklikler. Her iki elektrot V Na + karşısında B (b) [Na +], yan-logaritmik çizimleri. Verilerin Lineer araziler her iki elektrot için yaklaşık 48 mV eğim ortaya koymaktadır. 70 mM 152 mM ila b çift namlulu (siyah iz) V Na + (C) Müdahale ve [Na +] hızlı bir değişime konsantrik elektrot (gri iz). Konsantrik elektrodun tepki süresi önemli ölçüde fas olduğunu unutmayınter. Gösterim amacıyla, izleri Sawitzky-Golay filtre ile düzeltti edildi (genişlik 20). <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Şekil 8: çift namlulu ve konsantrik elektrotlar ile tespit edilen hücre dışı sodyum geçici. (A) Geçici V ref değişiklikler ve [Na +] bar belirtildiği gibi o 120 saniye boyunca 10 mM aspartat ile banyo perfüzyon tarafından uyarılan. Üst izleri iki namlulu bir elektrot ile gerçekleştirilen bir kayıt, düşük değerli izleri eşmerkezli elektrot kullanılarak kaydedildi göstermektedir. (B) ok ile gösterilen şekilde 0.2 sn için 10 mM glutamat yerel basınç uygulaması ile uyarılan o V ref ve [Na +] Geçici değişir. Üst izleri iki namlulu bir elektrot ile gerçekleştirilen bir kayıt, düşük değerli izleri eşmerkezli elektrot kullanılarak kaydedildi göstermektedir.Noktalı kırmızı çizgiler onun maksimum sinyal başlangıcı arasındaki dönemde doğrusal uyuyor temsil etmektedir. Eşmerkezli elektrot yanıt süresi bu koşullar altında çok daha hızlı olduğunu not edin. Gösterim amacıyla, izleri Sawitzky-Golay filtresi (genişlik 20) ile düzeltti bulundu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Beyin dokusundaki iyon konsantrasyonlarının ölçümü için iki tip iyon seçici mikroelektrotun (çift namlulu ve eş merkezli) üretimini, kalibrasyonunu ve özelliklerini gösteriyoruz. Bunlar daha sonra uyarıcı aktivitenin hem hücre dışı potasyum hem de sodyum konsantrasyonlarını değiştirdiğini göstermek için fare hipokampal dilim hazırlığında kullanılır.

Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Bu prosedürün genel amacı, beyin dokusunun hücre dışı alanındaki iyon dinamiklerini saptamak ve analiz etmektir. İyon geçici durumlarının ölçümü, çift namlulu veya konsantrik tasarıma dayalı olarak hazırlanabilen iyon seçici mikroelektrotlar kullanılarak gerçekleştirilir. İlk adım olarak, mikroelektrotlar deneysel banyoda kalibre edilir.Ardından, hücre dışı iyon kaymalarını uyarmak için elektrotlar akut fare hipokampal dilimlerine yerleştirilir ve nörotransmitter glutamat veya bir glutamat agonisti uygulanır. Glutamat, postsinaptik dikenlerdeki ionotropik reseptörlere bağlanarak onları açar; bu da sodyumun hücre içine girişine ve potasyumun hücre dışına çıkışına olanak tanır. Nihayetinde bu durum, iyon seçici mikroelektrotlar tarafından tespit edilen hücre dışı sodyumda azalma ve hücre dışı potasyumda artışla sonuçlanır.Bu yöntem, beyindeki hücre dışı iyon düzenlemesini ve aktiviteyle indüklenen demir geçişlerini incelemek için kullanılır. Burada, iki tip iyon seçici mikro elektrodun hazırlanmasını ve kalibrasyonunu açıklıyoruz. Bu elektrotların, nörotransmitter uygulamasına yanıt olarak hücre dışı potasyum veya sodyumdaki değişimleri ölçmek için akut beyin doku dilimlerinde nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.Prosedür, laboratuvarımdan Nicole Hark ve Simon tarafından gösterilecektir. Bu prosedüre başlamak için, iyon hassasiyetli gövde olarak kullanılacak filamentli bir bor silikat cam kılcal bor ve daha sonraki referans gövde için bir tane daha hazırlayın. Ardından, uzun ve kısa kılcal borları her iki uçtan birbirine sabitlemek için iki bileşenli yapıştırıcı veya küçük bir alüminyum folyo şeridi kullanın.Kalıntı nemi gidermek için çift kılcal boruyu bir fırında 60 °C'de bir saat boyunca ısıtın. Ardından, elektrotları kullanıma kadar bir desikatörde saklayın; çift kılcal boruyu döner başlık mekanizmalı dikey bir çekiciye yerleştirin. Kılcal borunun uzamasını önlemek için bir tebeşir kullanın.Cam, revolverin yatay olarak döndürülmesine izin verecek kadar yumuşayana dek bobini nazikçe tutun. Soğumadan sonra 180 derece döndürün ve mekanik kırıcıyı çıkarın. İki adet keskin çift kanallı kılcal boru elde etmek için kılcal boruyu çekmek üzere ikinci bir ısıtma protokolü uygulayın.Çift kılcal borunun uç çapı bir mikrona yakın olmalıdır. Kolonizasyonu önlemek için referans haznesini ucuna kadar distile su ile doldurun. İzleyen prosedürde, çift kanallı bir kılcal boruyu ucu yukarı bakacak şekilde özel yapım bir tutucuya yerleştirin.Ardından bu tutucuyu, önceden ısıtılmış HMDS içeren geniş ağızlı şişenin üzerine yerleştirin ve 70 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, kapileri metal bir standa aktarın. Daha sonra, kolonizasyondan sonra her iki boruyu kurutmak için kapileri iki saat boyunca önceden ısıtılmış fırında bekletin ve kullanım zamanına kadar kapileri desikatörde kuru tutun.Deney gününde, silikonlanmış gövdenin ucunu iki ila üç mikrolitre iyon seçici sensör ile doldurarak iyon seçici elektrodu hazırlayın. Ardından, sodyuma duyarlı bir mikro elektrot için 100 milimolar sodyum klorür veya potasyuma duyarlı bir mikro elektrot için 100 milimolar potasyum klorür salini ile gövdeyi geri doldurun. Bu işlem sırasında ek hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.Eğer iyonizasyon başarılıysa ve sensör düzgün şekilde doldurulmuşsa, sensör yüzeyi arka dolguya karşı net bir şekilde görülebilen konkav bir yüzey olarak görünmelidir. Ardından, referans kanalını doldurun, sonra klorürlü gümüş telleri her iki namluya yerleştirin ve her bir namluyu diş mumu ile mühürleyin. Bu prosedürde, kısa bir koniklik ve dört mikron uç çapı elde etmek için yatay çekicide iki milimetrelik bir kapiler çekin.Kullanımdan hemen önce, silikonize kılcal boruyu 0,2 µL sensör ile doldurun. İç kılcal boruyu hazırlamak için, uzun konikli ve sivri uçlu iki kılcal boru elde edecek şekilde küçük çaplı bir kılcal boruyu çekin. Ardından bunları 100 mM sodyum klorür veya 100 mM potasyum klorür salini ile doldurun.Sensörle doldurulmuş kılcal tüp ile salinle doldurulmuş kılcal tüpü, lamelden yapılmış özel bir durdurucu üzerine birbirleriyle doğrudan aynı hizaya gelecek şekilde yerleştirin. Küçük kılcal tüpü, büyük kılcal tüpün içine kısmen yerleştirin. Ardından, kılcal tüpleri başka bir lamel üzerine sabitleyin.Modelleme kili kullanarak kılcalları bir mikroskobun tablasına aktarın ve 100 x büyütmede görüntüleyin. Bir mikro manipülatöre monte edilmiş cam çubuk yardımıyla, uçları arasındaki mesafe yaklaşık beş mikron olana kadar dış kılcallı iç kılcallın üzerine doğru yavaşça ilerletin. Dış kılcallın açık ucunu diş mumu kullanarak iç kılcalla sabitleyin ve gümüş tel yerleştirin.Referans elektrodu hazırlamak için, dikey bir çekicide filamentli bir kılcal boru çekin, üst pipeti atın, ardından alt tutucuyu açın ve alt pipeti yaklaşık beş milimetre yukarı kaldırın. Tutucuyu tekrar kapatın ve alt elektrodun ucunun ısıtma bobininin yaklaşık beş milimetre üzerinde konumlanacağı noktaya kadar yükseltin. Ardından bobini ısıtın ve bir pens yardımıyla ucu yana doğru yaklaşık 45 derece bükün.Ucu tekrar ana şafta paralel olacak şekilde yaklaşık eksi 45 derece bükün. Ardından referans varili HEPES tamponlu salin ile doldurun. İçine klorürlenmiş gümüş tel yerleştirin ve varili diş mumu ile mühürleyin.Bu adımda, hem iyon hassas elektrodu hem de referans elektrodunu mikro manipülatörlere sabitleyin ve bunları A CSF perfüze edilmiş bir deney odasına indirin. Stereo mikroskop altında, klorürlü gümüş telleri diferansiyel amplifikatörün kafa ünitesindeki ilgili girişlere bağlayın. Ardından elektrot dirençlerini belirleyin.Ardından, voltaj sinyallerini sıfıra ayarlayın ve kalibrasyon için kayda başlayın. Kararlı bir baz hattı elde ettikten sonra, ölçülecek iyonun tanımlanmış konsantrasyonlarını içeren saline çözeltisine geçiş yapın. Şimdi, 250 mikron kalınlığında bir hipokampus kesitini deney haznesine aktarın ve bir ızgara ile sabitleyin.Kalibre edilmiş iyon seçici mikro elektrodu dilim yüzeyine indirin. Ardından elektrodu, CA1 bölgesinin stratum radiatum tabakasına yaklaşık 50 mikron kadar daha indirin. Transmitter agonisti uygulamak için, uygulama pipetini 0.5 millimolar glutamat ile doldurun.Pipeti bir mikromanipülatöre takın ve bir basınç uygulama cihazına bağlayın. Ardından, uygulama pipetini dokunun içine indirin ve iyon seçici mikro elektrodun ucuna yakın bir yere dikkatlice yerleştirin. Basınç uygulamasını 40 millibar ile başlatın.Burada, banyo sodyum konsantrasyonundaki değişikliklere yanıt olarak çift namlulu bir elektrodun ve konsantrik bir elektrodun referans namlularındaki voltaj değişimi gösterilmektedir. Bunlar da banyo sodyum konsantrasyonundaki değişikliklere yanıt olarak çift namlulu bir elektrodun ve konsantrik bir elektrodun sodyum potansiyeli voltajındaki değişikliklerdir. Bu şekil, banyo sodyum konsantrasyonuna karşı her iki elektrodun sodyum potansiyeli voltajının yarı logaritmik grafiğini göstermektedir.Lineer grafikler, her iki elektrot için de yaklaşık 48 milivoltluk bir eğim olduğunu göstermektedir. Burada, banyodaki sodyum konsantrasyonunun 152 milimolar'dan 70 milimolar'a hızlı değişimi karşısında çift namlulu ve konsantrik bir elektrodun yanıtı verilmiştir.Konsantrik elektrodun yanıt süresinin önemli ölçüde daha hızlı olduğuna dikkat edin. Bu şekil, çift namlulu ve konsantrik elektrotlar tarafından tespit edilen hücre dışı sodyum geçişini göstermektedir; referans namluların voltajındaki geçişli değişimler ve hücre dışı sodyum konsantrasyonu, çubukla belirtildiği üzere 120 saniye boyunca 10 milimolar aspartat ile banyo perfüzyonu yapılarak indüklenmiştir. Bu şekilde ise, referans namluların voltajındaki geçişli değişimler ve hücre dışı sodyum konsantrasyonu, 0,2 saniye boyunca 10 milimolar glutamat ile yerel basınç uygulaması yapılarak indüklenmiştir.Bu koşul altında konal elektrodun yanıt süresinin önemli ölçüde daha hızlı olduğuna dikkat edin. Bu prosedürü uygularken, uygun sessizleştirmenin demir seçici mikro elektrotların başarılı üretimi için kilit adım olduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, beyin dokusundaki hücre dışı demir geçişlerini saptamak için bu elektrotların nasıl hazırlanacağı ve kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Ekstrasellüler sırasında nöral agonistleri ve antagonistleri...

Için Multibarrel Elektrodları Üretim ve Piggy-back kullanma<em&gt; In vivo</emSinir Cevaplarının&gt; Farmakolojik Çarpıtmalar

Bu video, elektrik sinyallerini ölçmek ve karşılaştırmak için iyon seçici ve iyontoforez mikroelektrotları kullanarak bir beyin dilimindeki hücre dışı boşluğun nasıl karakterize edileceğini gösterir. Bu işlem, boşluğun hacim fraksiyonunu ve bükülme derecesini belirlemeye yardımcı olur.

İyon Seçici ve İyontoforez Mikroelektrotları Kullanılarak Bir Beyin Dilimindeki Hücre Dışı Boşluğun Karakterize Edilmesi

Hücre zarlarındaki taşıyıcılar, iyonların hücre zarları veya hücre katmanları boyunca diferansiyel ayrışmasına izin verir ve doku fizyolojisi, onarımı ve patolojisi sırasında çok önemli roller oynar. Tek hücrelerde ve dokularda spesifik iyon akışlarının in vivo olarak ölçülmesine izin veren iyon seçici kendinden referanslı mikroelektrotu açıklıyoruz.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Uyanık farelerde hücre dışı nöral aktiviteyi aynı anda kaydetmek ve kayıt bölgelerinin yakınında birden fazla nöroaktif madde salmak için elektrotların yapımı için yöntemler sunuyoruz. Bu teknik, ilgilenilen nörona varsayılan yerel sinaptik girdilerin ayrıntılı analizine izin verir.

Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

Bu iletişim kuralı ortak yerelleştirilmiş elektroansefalografi (EEG) ve multi-Laminer yerel alan bir imzalat köstebeğiyle potansiyel eşzamanlı kayıt için basit bir yöntem açıklanır. Bir elektrot yerleştirilmesi için kafatası delinen burr deliği EEG sinyal önemsiz bozulma üretmek için gösterilir.

Co yerelleştirilmiş elektroansefalografi ve yerel alan potansiyel kemirgen eşzamanlı kayıt

Potasyum iyonları hücre istirahat membran potansiyelini katkıda bulunmak ve ekstraselüler K+ konsantrasyon hücresel uyarılabilirlik çok önemli bir düzenleyicisidir. Biz nasıl yapmak, kalibre ve monopolar K+tarif-seçici microelectrodes. Böyle elektrotları kullanarak elektriksel olarak uyarılmış K+ konsantrasyon dynamics yetişkin Hipokampal dilimleri içinde ölçüm sağlar.

Yapma, test etme ve yetişkin beyin doku dilimler halinde potasyum iyon seçici Microelectrodes kullanma

Burada, in vivo microdialysis EEG kayıtları ile birlikte epileptik ve sigara-epileptik sıçan ventral hipokampus glutamat ve aspartat sürümde analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ekstraselüler glutamat ve aspartat konsantrasyonu hastalık farklı aşamalarında ile ilişkili.

Microdialysis fareler serbestçe hareket EEG kayıtları sırasında eksitatör Amino asit

Bu iletişim kuralı mikrosıvısal aygıtlarla çalışmak için nöronal kültürler iletimde Aksiyon potansiyeli vitro elektrot dizilerin nasıl göstermek amaçlamaktadır. Veri analizi, yani algılama ve karakterizasyonu Aksiyon potansiyelleri, yayma, gerçekleştirilen yeni bir kullanarak gelişmiş, henüz Kullanıcı dostu ve serbestçe kullanılabilir, hesaplama aracı.

Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik

Bu protokol, birden fazla beyin bölgesinden fare(Mus musculus)ve gelincikte(Mustela putorius furo) kronik ve akut in vivo elektrofizyolojik kayıtlar için karbon fiber mikroelektrod dizileri oluşturmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Mikroelekrod dizisi implantasyonuna ham karbon fiberlerin satın alınmasını takiben atılan her adım, mikroelekrod dizisi yapımına vurgu yaparak ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Kronik ve Akut In Vivo Kayıtlar için Karbon Fiber Mikroelekrod Dizilerinin yapımı ve uygulanması

Mevcut protokol, aynı anda birden fazla beyin yapısından in vivo olarak yerel alan potansiyellerini kaydetmek için özel yapım mikroelektrot dizilerinin yapımını açıklamaktadır.

Aynı Anda Birden Çok Beyin Yapısından İn vivo Kayıtlar için Yerel Alan Potansiyeli Mikroelektrotlarının İnşası

Fare beyninin in vivo transkraniyal manyetik uyarımını sağlamak için milimetre büyüklüğünde bir bobin ile birleştirilmiş düşük maliyetli bir elektroensefalografik kayıt sistemi önerilmektedir. Özel yapım, esnek, çoklu elektrot dizisi substratına sahip geleneksel vidalı elektrotlar kullanılarak, transkraniyal manyetik stimülasyona yanıt olarak fare beyninden çok bölgeli kayıt gerçekleştirilebilir.

Fare Beynini In Vivo'da Transkraniyal Olarak Uyarmak için Milimetre Boyutlu Bir Bobin ile Birleştirilmiş Düşük Maliyetli Elektroensefalografik Kayıt Sistemi

Öğrenin ekstraselüler iyon dinamiklerini ölçmek için çift namlulu ve konsantrik iyon seçici mikroelektrotların hazırlanmasını ve kalibrasyonunu. Fare hipokampal kesitlerinde potasyum ve sodyum konsantrasyon değişimlerini inceleyin.

Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar

Daha fazla video keşfet