Üretim ve Darbeli Düşük Frekanslı Ultrason Kantitatif Analiz neoplastik Hücreler Tedavi edilmeyen Sonic Duyarlılık belirleyin ve Tedavi için

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kolesterol azaltıcı bir ajanın varlığında veya yokluğunda, düşük frekanslı darbeli ultrasonun insan lösemi hücresi popülasyonlarına zarar verme etkinliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmektir. Bu, sonikasyon sisteminin temizlenmesi ve stabilitesinin değerlendirilmesiyle sağlanır. Ardından, insan lösemi hücrelerine metil beta siklodekstrin varlığında ve yokluğunda sonikasyon uygulanır.

Ardından, hücre canlılığını ve sonikasyon ile kolesterol tükenmesinin etkilerini değerlendirmek için otomatik hücre sayıcılar kullanılır. Lösemi hücrelerinin mitokondriyal aktivitesi XTT testi ile değerlendirilir. Sonuç olarak veriler, düşük frekanslı ultrasonun malign hücrelere zarar vermek için kullanılabileceğini ve bunun kolesterol tükenmesine neden olan bir ajan kullanımıyla güçlendirildiğini göstermektedir.

Laboratuvarımız, ultrasonun anti-neoplastik etkilerini, sonik etkileri artırmak için kullanılan özel ajanlarla birleştiren yeni bir terapötik modalite olan sonar namp terapisi ile ilgilenmektedir. Protokolümüz, daha fazla preklinik araştırmayı gerektiren potansiyel ano kemoterapötik yaklaşımları belirlemek amacıyla hem neoplastik hem de normal hücrelerin sonik hassasiyetini değerlendirmektedir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, cihazların nasıl optimize edileceğini öğrenmek zaman alabildiğinden, so sisteminin stabilitesini değerlendirmek için kullanılan ekipmanlarla ilgili zorluklar yaşayabilirler.

Temizlik ve stabilizasyon prosedürleri, sonikasyon sistemini değerlendirmek için zorunlu olduğundan ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik önem taşıdığından, bu yöntemin görsel gösterimi büyük önem taşımaktadır. Bir deneye başlamadan önce, horn ile konvertör arasındaki bağlantı noktasını temizlemek için kloroform ve pamuklu çubuk kullanın. Ardından, horn ve konvertörün dişlerine hafif bir yağ uygulayın.

Kalan metal talaşlarını, pası veya oksidasyon birikintilerini tamamen temizlemek için, ardından birleşim yerindeki yağı ve diğer tüm kontaminantları daha fazla kloroform ile temizleyin ve hornu dönüştürücüye yeniden takın. Sistemi doğru şekilde torklamak için, hornu kabın altından dışarı çekin ve dönüştürücünün üst kısmına yakın üç küçük delikten birinin içine bir kanal anahtarı yerleştirin. Şimdi, yarım inçlik ayaklı anahtar takılı bir tork anahtarını hornun kanallı kısmına konumlandırın ve torkmetre 39.99 foot pounds değerini gösterene kadar standart saat yönünde sıkın.

Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, dönüştürücü ve boynuzu tekrar kaba yerleştirin ve parçaları dik konumda bir halka standa monte edin, dönüştürücüyü güç kaynağına yeniden bağlayın ve ardından sistemi darbeli dozajlama için ayarlayın. Nabızlar arasında bir saniye olacak şekilde bir saniyelik sonikasyon kullanarak, sauna Fire sisteminin yoğunluğunu ve işlevini değerlendirmek için sistemi istenen genliklere ayarlayın. Kavitasyon ölçerini 1,5 santimetre uzaklıkta tutarak başlayın ve ölçer probunun yüzeyinde hiç kabarcık bulunmadığından emin olun.

Sistemin uygun yoğunlukta çalıştığını onaylamak için kavitasyon ölçer ekranını okuyun. Ardından, hidrofon sensörünü 12,5 millilitersu içeren bir örnek tüpüne tamamen daldırın ve hidrofonu askıya almak için halka standını kullanın. Dalga formu özelliklerinin stabilitesini onaylamak için hidrofonu osiloskop girişine bağlayın ve net bir sinüs dalgasının varlığını doğrulayın; çünkü anormal dalgalar sistemin frekansını değiştirebilir.

Hücreleri sonikasyona hazırlamak için öncelikle, taze hazırlanmış besiyeri kullanarak 25 cm²'lik bir flaska mililitre başına 4 x 10⁴ hücre olacak şekilde ekim yapın. Trypan mavi dışlama yöntemiyle canlı hücre sayısını belirledikten sonra, kültür istenen konsantrasasyona ulaşana kadar 37 °C ve %5 CO₂ ortamında inkübe edin. Hücreler sonikasyon için hazır olduğunda, belirli bir hacimdeki deiyonize distile suyu gazdan arındırmak için vakum ve Büchner flaskı kullanın.

Ardından, kap boynuzunu üst kısmın 15 milimetre üzerine kadar doldurmak için suyu kullanın. Sistemi Degas suyu ile yaklaşık yedi dakika boyunca çalıştırın. Daha sonra, üç mililitre hücreyi 20 mililitrelik cam bir sintilasyon şişesine aktarın ve şişeyi tutucuya sabitleyin.

Ardından, tutucu düzeneği kap boynuzunun üst kısmına takın ve sürgülü mekanizmayı kullanarak tutucu düzeneği, su yüzeyindeki boynuzun üst kısmından 15 milimetre yüksekliğe ayarlayın. Şimdi hücreleri, %33 ve %50 genlikte, her bir nabız arasında bir saniyelik boşluk olacak şekilde üç adet bir saniyelik ultrason nabzı kullanarak sonike edin ve sonikasyon sonrası hücre canlılığını tripan mavisi dışlama yöntemiyle değerlendirin. Hücre hasarını değerlendirmek için, bir Z2 partikül analizörünün açıklığını izotonik salin ile en az iki kez yıkayın.

Ardından, sonike edilmiş hücrelerden 100 µL'yi 20 mL izotonik saline içerisine ekleyin ve hücre örneğini sayıcı tutucuya aktarın. Daha sonra platformu açıklığa kadar kaldırın ve hücre hasarını, canlılığını ve döküntüleri üretici talimatlarına göre analiz edin. Sonike edilmiş hücrelerin canlılığını XTT testi ile değerlendirmek için, hücreleri bir ile üç arasında bir aralık kullanarak sonike edin.

XTT kitinin değerlendirebileceği bir hasar yelpazesi oluşturmak için bir saniye aralıklı bir saniyelik darbeler uygulayın, ardından hücreleri santrifüjleyin ve peletleri taze hazırlanmış büyüme ortamında mililitre başına 1 × 10⁵ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Daha sonra, her bir kuyuya 100 µL hücre gelecek şekilde düz tabanlı 96 kuyucuklu mikrotitrasyon plakalarına ekim yapın; boş absorbans okumaları için sadece 100 µL tam büyüme ortamı içeren üç kontrol kuyucuğu dahil olmak üzere üç tekrarlı (triplikkat) olarak hazırlayın.

Hücreleri analiz sabahı 24 saat boyunca inkübe edin; 37 °C'ye ısıtılmış XTT ve aktivasyon reaktiflerini, çözeltiler berraklaşana kadar hafifçe çalkalayarak karıştırın. Ardından, 5 mL'lik bir XTT reaktifi miktarına 0,1 mL aktivasyon reaktifi ekleyin. Sonrasında, aktive edilmiş XTT çözeltisinden 50 µL'yi U 9 37 ve THP 1 ekilmiş plakaların her bir kuyucuğuna ekleyin ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.

İki saat sonra, pozitif kuyucuklardaki turuncu boyayı eşit şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın ve bir mikroplaka okuyucu ile 450 ve 500 nanometre arasında absorbansı ölçün. Son olarak, tüm assay kuyucuklarının absorbansını 630 ve 690 nanometre arasında tekrar ölçün. Beklendiği üzere, %50 genlikte sonike edilen hücre popülasyonunda, %33 genliğe kıyasla daha kapsamlı hücre hasarı gözlemlenir.

Ancak %33 genlik, ajanlar uygulandığında daha fazla hasarın tespit edilmesine olanak tanır. Kolesterol tüketen ajan metil beta siklodekstrinin doz bağımlı etkilerinin, U 9 37 hücrelerinin ultrasonik hassasiyetini artırma üzerindeki etkilerinin değerlendirildiği bu deneyde olduğu gibi.

Metil beta siklodekstrin ile işlem görmemiş hücrelerin canlılığı, işlem görmemiş kontrol hücreleriyle benzer olsa da, birer saniyelik üç puls halinde 40 kHz ultrason uygulandıktan sonra canlılık belirgin şekilde düşmüştür. Ayrıca, sonikasyondan sonraki canlılık azalmasının doz bağımlı olduğu görülmektedir; XTT analizi ile değerlendirildiğinde, kolesterol tüketen ajanın 5 mM konsantrasyonu hücre sayısında en büyük düşüşü sağlamış, bunu metil beta siklodekstrinin 1 mM ve 0,5 mM'lık işlemleri izlemiştir. THP-1 hücreleri U937 hücrelerine göre sonikasyona karşı biraz daha dirençli görünse de, her iki insan lösemi hücre hattı da doz bağımlı bir şekilde zarar görmüştür.

Ek olarak, yüksek konsantrasyonlardaki metil beta siklodekstrinin daha fazla sayıda ultrason darbesiyle birleştirilmesi, hem U 9 37 hem de THP one hücreleri için XTT'nin çözünür, parlak turuncu renkli bir türeve indirgenmesini en düşük seviyeye indirmiş olup, bu durum her iki hücre hattı için daha düşük hücre canlılığı ve mitokondriyal aktiviteye karşılık gelmektedir. Bu prosedürün ardından, hücre iskeletini hedefleyen veya reaktif oksijen türleri üreten ajanlar gibi diğer sonik duyarlaştırıcı ajanların, sonik duyarlılığı artırma potansiyelleri değerlendirilebilir ve böylece preklinik etkinliği araştırılabilecek yeni terapötik yaklaşımlar geliştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, TC ve Z iki sayaçlarından elde edilen SON verilerinin uygun şekilde düzenlenmesi önemlidir; çünkü bu veriler, kaybolabilecek tedavi protokolü etkinliğine dair ayrıntılı bilgiler sağlamaktadır.

Herhangi bir lojistik şema kullanılmadığında, bu videoyu izledikten sonra, potansiyel terapötik faydalarını değerlendirmek amacıyla preklinik in vitro modellerde düşük frekanslı ultrasonun potansiyel ano sensitizerlar ile birlikte nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.