Sıkıştırılmış Kolajen kıyılmış Doku: Tek aşamalı Rekonstrüktif Onarım için Cep içeren Biotransplant

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, rekonstrüktif cerrahi sırasında genişletilmesi için otolog doku nakli gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle ilgili dokudan bir biyopsi alınarak gerçekleştirilir. Ardından biyopsi küçük parçalara ayrılır ve plastik sıkıştırılmış polikaprolakton veya PCL kolajen otogrefti oluşturulur.

Ardından, 3D iskeleti oluşturmak için PCL ve otolog kıyılmış dokular entegre edilir. Bir ila altı oranında bir genişletme oranı kullandık. Sonrasında, iskelet deneğe geri nakledilir.

Nihayetinde, otogreftlenen dokunun rejenerasyonu, iskeleler ve kıyılmış doku parçacıkları içindeki hücrelerin proliferasyonu ve yeniden organizasyonunun immünohistokimyasal analizi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem bir hayvan modelinde, cilt üzerinde ve urothelium üzerinde gösterilecektir. Bu tekniğin uygulama alanı, cerrahi onarım için doku eksikliğinin şiddetli olduğu durumlarda, ağır malforme dokuların tedavisine veya travma sonrası süreçlere kadar uzanmaktadır.

Bu tekniğin, in vitro kültürleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tek aşamalı bir cerrahi prosedür olarak gerçekleştirilebilmesidir. Doku alımından transplantasyona kadar olan adımların steril koşullar altında uygulanması gerektiği için bu yöntemin görsel olarak gösterimi kritik önem taşır. Porcine mesane biyopsi örneği elde etmek için, öncelikle mesaneyi pensle kavrayın ve doku boyutlarını belirlemek için sterilize edilmiş bir mezura kullanın.

Ardından, sterilize edilmiş bir kalem kullanarak, bir ila altı kat genişleme oranı hedefleyerek, ikiye bir santimetre boyutunda elips şeklinde bir biyopsi alanı işaretleyin. Daha sonra, işaretlenen dokuyu bir skalpel ile eksize edin ve mesane biyopsi örneğini steril koşullar altında DMEM içerisine yerleştirin. Bir cilt biyopsi örneği almak için, 0,3 milimetre kısmi kalınlıkta bir örnek toplamak amacıyla bir dermatom kullanın.

Ardından, dokuyu DMEM içerisine yerleştirin ve yara bölgesini bir pansumanla kapatın. Sonrasında, mesane biyopsisini iki kez DMEM ile yıkayın ve dokuyu, mukozası yukarı bakacak şekilde steril bir diseksiyon plakasına aktarın. Disseksiyon iğneleri kullanarak numunenin bir tarafını plakaya sabitleyin; mukozal dokuyu detrusor kasından ayırmak için ince makas ve forseps kullanın.

Ardından, mukozanın üzerine bir kıyma cihazı yerleştirin ve dokunun bir ucundan diğer ucuna dikey ve yatay olarak hareket ettirerek 0.8 x 0.8 milimetrelik kıyılmış doku parçaları elde edin. Kıyma cihazının, doku üzerinde hareket ettirilirken üzerine bastırılması gerektiğini unutmayın. Plastik sıkıştırılmış kolajen otogrefti hazırlamak için, ortam yoğun sarıdan pembeye dönene kadar, kolajen tip I ile desteklenmiş 10X DMEM içine damla damla bir normal sodyum hidroksit ekleyin.

pH değerinin 7,4 ile 8 arasında olduğu onaylandıktan sonra, çözeltinin içine dikkatlice iki mililitre DMEM ekleyip karıştırın. Ardından, yaklaşık iki mililitre kolajeni 20x30x10 milimetre boyutundaki çelik dikdörtgen bir kalıbın kuyucuğuna dökün ve kolajeni on dakika boyunca inkübe edin. Kolajen donduğunda, jel halindeki kolajenin üzerine uygun hacimde PCL biyomalzeme dökün ve geri kalan altı mililitre kolajeni PCL'nin üzerine boşaltın.

Kalıbı tekrar inkübatöre yerleştirin ve 20 dakika daha bekletin. Ardından, steril bir yüzey üzerine kalın bir gazlı bez tabakası üst üste yerleştirin. Daha sonra, gazlı bezin üzerine 400 micron kalınlığında paslanmaz çelik bir ağ, ardından 110 micron kalınlığında bir naylon ağ tabakası yerleştirin.

Kolajen jeli nazikçe naylon ağ üzerine aktarın ve dikdörtgen çelik kalıbı dikkatlice çıkarın. Doğranmış dokuyu kolajen üzerine aktarın. Burada, bire bir ile altı kat arasında bir genişleme oranı hedefliyoruz.

Ardından, kolajen jel ve dokunun üzerine yeni bir naylon ağ tabakası yerleştirin, naylon ağın üzerine ikinci bir çelik ağ yerleştirin ve son olarak üzerine minimum 120 gram ağırlığında bir yükleme plakası koyun. Beş dakika sonra, ağırlığı, çelik ağları ve naylonu otogreftten çıkarın. Otogreftin in vitro kültürü için, önce inceltilmiş yapıyı 12 kuyucuklu plakalara sığacak kadar küçük parçalara ayırın.

Ardından, her kuyucuğa bir mililitre keratinosit medyumu ekleyin ve dokuları üç ila altı hafta boyunca inkübe edin. Kıyılmış mesane mukozası içeren bir otogrefti domuz mesanesine nakletmek için grefti DMEM ile nemlendirin. Daha sonra, konstrüktü ince sürekli monofilaman sütürlerle sağlıklı dokuya greftleyin.

Yerleştirilmiş üriner kateter aracılığıyla mesaneyi salin ile doldurarak greftin su sızdırmaz olduğunu doğrulayın. Kıymış deri epidermisi içeren bir otogrefti tam kat bir yaraya nakletmek için, grefti DMEM ile nemlendirin. Ardından, otogreftin köşelerinden ve orta kısmından ayrı dikişler kullanarak, konstrüktü deri tam kat yarasının tabanına sabitleyin.

Son olarak, nemli tutmak için yaranın üzerini plastik bir pansumanla kapatın. Parçalanmış cilt ototransplantının bu görüntüsünde gözlemlendiği üzere, kompozit biyogreft tutmaya, sütüre etmeye ve cerrahi işleme dayanıklıdır. In vitro kültür sırasındaki farklı zaman noktalarında yapılan immünohistokimya, hücrelerin çoğaldığını, göç ettiğini ve hücre fenotipine özgü tipik bir mikroarkitektüre sahip sürekli bir epitelyuma dönüştüğünü ortaya koymaktadır.

Örneğin, iki haftalık sürede, deri otogreftinin yüzeyindeki hücre tabakası yaklaşık iki katman kalınlığındadır. Sağda, aynı kültür süresi sonunda mesane epitelyumu yaklaşık sekiz katman kalınlığındadır. Beş ila altı hafta sonra, hem kıyılmış deri epitelyumu hem de kıyılmış mesane mukozası otogreftlerinde sürekli epitel yaklaşık sekiz ila on hücre katmanı kalınlığındadır.

İn vitro doku genişletmeyle karşılaştırıldığında, bu yöntem hızlıdır, daha az iş gücü gerektirir ve gelişmiş laboratuvar kaynaklarına ihtiyaç duymaz. Ayrıca, tüm parçalar FDA onaylıdır ve bu da standart cerrahi ortamda kullanılmalarına olanak tanır. Bu prosedür uygulanırken, jelin, biyotransplantların ve otolog dokuların steril koşullar altında hazırlanmasının hatırlanması önemlidir.

Hücre proliferasyonu ve diferansiyasyonu hakkındaki ek soruları yanıtlamak için bu prosedür ve hücrelerin in vitro kültürü gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, rejeneratif tıp alanındaki araştırmacılar için yeni yollar açabilir. Bu yöntemlerle, ciltteki veya üriner sistemdeki ağır malformasyonlar otolog doku mühendisliği transplantları ile tedavi edilebilir.