Name: İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Keşfedin farelerde stres direnci genlerini ortaya çıkarmak için ES hücrelerde yüksek verimli bir tarama yöntemini. Bu teknik, uzun ömür çalışmaları için fenotipik fare modelleri oluşturmayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PiggyBac transpozon ve piggyBac transpozaz hediyeleri için Wellcome Trust Sanger Enstitüsü'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, Colorado Kasap hibesi ve NIH R01 AG041801 (WSC) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+also+mediate+increased+resistance+to+stress+and+prevent+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease.</a> J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).</li>
<li>Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+stress+resistance+in+cells+from+long-lived+dwarf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice.</a> Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).</li>
<li>Perez, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+overexpression+of+major+antioxidant+enzymes+does+not+extend+the+lifespan+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice.</a> Aging Cell. 8, 73-75 (2009).</li>
<li>Martin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+mice+to+test+the+oxidative+damage+theory+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging.</a> Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).</li>
<li>Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+mutant+phenotypes+from+ES+cells+to+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice.</a> Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).</li>
<li>Ramirez-Solis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+microextraction%3A+a+method+to+screen+numerous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.</a> Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).</li>
<li>Uren, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+splinkerette-PCR+method+for+the+isolation+and+sequencing+of+retroviral+insertion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites.</a> Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).</li>
<li>Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+piggyBac+transposon-based+genome-wide+library+of+insertionally+mutated+Blm-deficient+murine+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells.</a> Genome Res. 19, 667-673 (2009).</li>
<li>Chick, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+stress-resistance+mutations+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening for stress-resistance mutations in the mouse.</a> Front Genet. 5, 310(2014).</li>
<li>Salmon, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+cell+lines+from+young+adult+mice+of+long-lived+mutant+strains+are+resistant+to+multiple+forms+of+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36, 543-544 (2015).</li>
<li>Baker, K. E., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+terminating+erroneous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression.</a> Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).</li>
<li>Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+nonsense-mediated+mRNA+decay+permits+unbiased+gene+trapping+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).</li>
<li>Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+mouse+mutations+in+embryonic+stem+cells+by+use+of+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling.</a> Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

İleri genetik analiz, belirli bir fenotipten sorumlu genler için genomun tarafsız bir şekilde sorgulanmasına izin verir. Bu yöntem, yeni gen fonksiyonlarını ortaya çıkarmak için çok güçlüdür. Alt organizmalarda yaygın olarak kullanılmıştır, ancak fare gibi memelilerde, esas olarak gerektireceği altyapı ve lojistikle ilişkili son derece yüksek maliyet nedeniyle kullanılmamıştır. Burada, genetik tarama sürecini ES hücre kültürü platformuna taşıyarak mutantların üretilmesinde ve mutasyonların tanımlanmasında verimliliği ...

Ömür stres direnci ile samimi bir ilişki vardır. Genel olarak, uzun ömürlü türler genellikle hidrojen peroksit paraquatın (PQ), UV, ısı ve ağır metaller 1,2 gibi birden stres, doğru direncin artmasına işlemini göstermektedir. Bunun aksine, strese karşı artan hassasiyet, kısalmış ömür ve / veya daha fazla hastalık eğilimli fenotipi tahmin etmek eğilimindedir. Anti-oksidanın, tutucu yolu uzun hayvana gerilme direnci veren önemli bir rol oynadığı tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, birkaç istisna dışında, çeşitli anti-oksidan enzimler (örneğin, akciğer), manipülasyonlara sahip transgenik hayvanların çeşitli çalışmalar, oksitleyici kirleticilerin alınmasına yönelik enzim düzeyi artan yaşam süresi ya da sağlık aralığı 3 arttırmadığını gösterir. Bu veriler sürekli olarak uzun ömürlü hayvanlarda gözlenen stres direnç özelliği henüz ortaya için diğer hücresel yolların aracılık ettiğini göstermektedir. Biz tarafsız bir ileriye aldıGenetik mutasyona uğramış bir yaklaşım üzerine, kültürlü embriyonik kök (ES) hücrelerde stres direnci fenotipi olabilir genleri tanımlamak için. ES hücreleri Bu çalışmada iki ana avantaj sağlar: (1) sofistike genetik manipülasyonlar ES hücrelerinin genomunun modifiye edilmesi için kullanılabilir; ve (2) ekranında elde herhangi bir strese karşı ES hücreleri ile doğrudan ömrü, sağlık yayılma ölçmek için bütün hayvan çalışmalarında içine hızlı şekilde çevrilmesine izin veren fare üretimi için de kullanılabilir. Bu yazıda Blm alleller bir tetrasiklin duyarlı eleman tarafından kontrol altına bulundukları C9 ES hücre hattı kullanımını tarif. Doksisiklin (Ortodoks) tedavisi geçici kardeş kromatid değişimi artan olaya lider BLM ifadesini kapalı. Bu kısa vadeli Blm knock-out heterozigot nüfus içerisindeki homozigot mutasyon üretimi için izin stres direnci için çekinik mutasyonlar tarama sürecinde yakalanan olabilir ki. BizAyrıca rastgele genom genlerin mutasyona bir poli-A tuzak kaseti (PB-UPA) eklemek için mutajen olarak piggyBac (PB) transpozonun kullanımını tarif. Poli-A tuzağı ile bir gen bozulması olan hücreler, G418 dirençli hale ve gen-trap mutantlar (gen trap kütüphanesi) oluşan bir koleksiyon yapılmış ve daha sonra, karşı stres olan mutant klonları için tarandı olabilir, böylece elde edilebilir. Seçim kurtarıldı Stres dirençli klonlar eklemeleri sayısı (qPCR) arasında bağlamda moleküler tekniklerle oldukça hızlı karakterize edilebilir, ekleme site (splinkerette PCR), bozulmuş gen (ŞOK) kimliği ve onun ifade seviyesi ( RT-qPCR). PB yerleştirme Yabani tür bir DNA dizisini ve bu nedenle geri stres direnci kaybını test klonu MPB transpozazın geçici ifade yolu ile remobilized edilebilir. Bunlar önce yapılmalıdır mutasyon nedenselliğini onaylamak için güçlü yollar vardırpahalı bir fare üretimi. Önceki çalışmalar stres maruz kalan hücreler pluripotency 4,5 kaybettiklerini gösterdi. Böylece, bu protokolde, stres ile tedavi olmaz mutant hücreler kümesi bir yineleme, korunması başarılı fare üretimi için kritik öneme sahiptir. Bizim laboratuvar hem istek üzerine diğer araştırmacılar için kullanılabilir, C9 ES hücre hattı ve PB-UPA vektörü tasarladı. Burada rapor edilen protokol, stres dayanıklı klonların (Şekil 1B) izole etmek için replika plaka ve stres seçimi, ardından PB-UPA (Şekil 1A) gen tuzak ES hücreleri, de novo arşivinin oluşturulması yoluyla başlar. Biz paraquat, hücreler içinde güçlü bir serbest kök üretici madde ile noktası göstermiştir. Hemen hemen, örneğin herhangi bir sitotoksik bileşik veya toksin, ER stres (örneğin, thapsigargin ve tunikamisin), nöronal oksitleyici (örneğin, MPP +, 6-hidroksi dopamin ve rotenon), ısı ve ağırmetaller (örneğin, Cd, Se), ilgili dirençli mutantların seçmek için bir yöntem adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Vector</td></tr><tr><td>PB-UPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBase</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBasePuro<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Tissue Culture</td></tr><tr><td>500-ml Stericup filtreleri</td><td>EMD Millipore SCGPU05RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250-ml Stericup filtreleri</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Steriflip-GV filtreleri</td><td>EMD Millipore SE1M179M6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KO DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Doku Kültürü Biyolojikleri</td><td>104</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Edilmiş FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Metil Viologen diklorür ( Paraquat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit Hybri-MAX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMAX %0.1 jelatin</td><td>EMD Millipore</td><td>ES006B</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modifiye</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>T25 Şişe</td><td>Corning</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>T75 şişesi</td><td>Corning</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>100 mm & nbsp; plaka</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>150 mm & nbsp; plaka</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu ve nbsp; plaka</td><td>Corning</td><td>3585</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu U-alt plaka</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>50 ml hazne&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>15 ml'lik tüpler</td><td>VWR International, LLC</td><td>82050-276</td><td></td></tr><tr><td>Birincil Fare Embriyonik Fibroblastları</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-NL</td><td></td></tr><tr><td>DR4 Fare Embriyonik Fibroblastları</td><td>Uygulanan Kök Hücre</td><td>ASF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td></td><td></td>BP25312</tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Fisher BiyoReaktifleri&nbsp;</td><td></td><td></td>BP26531</tr><tr><td>Kriyotüpler</td><td>Termo Bilimsel</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüjü&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Santrifüj 5702</td><td></td></tr><tr><td>TC10 hücre sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sayma Slaytları (TC10 için)</td><td>Bio-Rad</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electroporation</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Bio-Rad</td><td>1652611</td><td></td></tr><tr><td>Gen Pulser Küvetleri (4&#160; mm boşluk)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Molecular Biology</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercylcer ep Gradient&nbsp; S</td><td></td></tr><tr><td>Puregene Çekirdek kiti B</td><td>Qiagen</td><td>158745</td><td></td></tr><tr><td>Topo-TA Klonlama kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA sentez kiti</td><td></td><td>NaCl Fisher</td> BioReagents 4368814 <td></td>Uygulamalı</tr><tr><td></td><td>Biyosistemler&nbsp;</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>%100 etanol</td><td>Decon Laboratuvarları, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Çift İşlenmiş Doku Kültürü Su</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Sau3A1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0169L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><> güçlü96 kuyulu Lizis Tamponu (Ramires-Solis et al. 1992)</ güçlü ></td></tr><tr><td>Trizma Baz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit Fisher</td><td>BioReagents&nbsp;</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5777</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz-K</td><td>Fisher BiyoReaktifleri&nbsp;</td><td>BP1700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electrophoresis</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4469EDU</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose&nbsp;</td><td>GeneMate</td><td>E3120500</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür&nbsp;</td><td>Fisher BiyoReaktifleri&nbsp;</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Merdiveni</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb DNA Merdiveni</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>2 günlük DNA Merdiveni</td><td>New England BioLabs</td><td>N3200L</td><td></td></tr></tbody></table>

İleri genetik yaklaşım farelerde stres direnci genler ortaya çıkarmak için - es hücrelerde bir yüksek verim ekranı

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Farelerde fenotip güdümlü genetik taramalar, gen fonksiyonlarını ortaya çıkarmak için güçlü bir tekniktir, ancak genellikle potansiyelini ciddi şekilde sınırlayan aşırı yüksek maliyetler tarafından engellenir. Burada, fare embriyonik kök (ES) hücrelerinin, ilgilenilen bir fenotipi taramak için vekil hücreler olarak kullanımını ve daha sonra bu hücreleri, fenotipi taşıyan canlı bir fareye dönüşmek üzere bir konakçı embriyoya sokmayı açıklıyoruz. Bu yöntem (1) memeli hücrelerinde genetik tarama için uygun maliyetli, yüksek verimli bir platform sağlar; (2) mutasyona uğramış genleri tanımlamanın ve nedenselliği doğrulamanın hızlı bir yolu; ve (3) tüm hayvan çalışmaları için doğrudan bu seçilmiş ES hücrelerinden fare mutantları geliştirmek için bir kısayol. Dirençli mutantları seçmek ve oksidatif stres direnci sağlayan mutasyonları tanımlamak için paraquat (PQ) kullanımını gösterdik. Diğer stresörler veya sitotoksik bileşikler, çeşitli hücresel stres direncinin yeni genetik belirleyicilerini ortaya çıkarmak için dirençli mutantları taramak için de kullanılabilir.

Tipik bir mutajenez deneyde, transfeksiyon PB-UPA ve MPB transpozaz ile 3 x 10 7 ES hücrelerinin toplam oluşur. Iki bağımsız deneyin üretilen gen tuzak ES hücre sayısı, Tablo 1 &#39;de özetlenmiştir. Gen tuzak etkinliği, yaklaşık 0.04%&#39; dir. Kombine gen tuzak kütüphaneleri 22400 bağımsız mutantlar, fare genomu hakkında tam bir kapsama (23.000 kodlayan genlerin) içerirler. Aşırı kapsama tekrarlanan mutasyon yoluyla daha mutantlar üreten ve / veya süreci ölçekleme elde edilebilir. <p cl...

Stres direnci uzun ömürlü özelliklerinden biridir ve genetik yönetilmeye bilinmektedir. Burada, uzun ömürlü çalışmaları için fare modelleri geliştirmek için hangi ES hücreleri stres direnci kazandıran mutasyonlar taranması için tarafsız bir yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Bu yöntemin genel amaçları, strese dayanıklı mutant embriyonik kök hücreleri verimli bir şekilde seçmek, ilgili genleri hızla tanımlamak ve maliyet etkin bir şekilde uygulanabilir fare modelleri oluşturmaktır. Bu yöntemler, memelilerde stres direnci ile sağlık süresinin ve yaşam süresinin artırılmasında rol oynayan genleri tanımlamamıza olanak tanıyarak yaşlanma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla, bu tekniğin bir avantajı, yeni mutantların maliyet etkin bir şekilde seçilmesine ve bir vekil model olarak embriyonik kök hücre taramasının ardından fenotipik fare modellerinin oluşturulmasına imkan tanımasıdır.ES hücrelerini kültüre etmeye başlamak için, öncelikle ES hücresi kültüründe feeder hücre olarak kullanılacak olan, mitomisin C ile aktive edilmiş bir viyal birincil fare embriyonik fibroblastını (P MFS) 37 °C'lik su banyosunda çözün. Hücreleri 5 mL ES hücre besiyerine aktarın ve 100 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 30 mL ES hücre besiyerinde yeniden süspande edin.Hücreleri iki adet 100 milimetrelik plakaya ve iki adet T 25 flaskına dağıtın. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında 24 saat boyunca inkübe

forward-genetic-approach-to-uncover-stress-resistance-genes-mice-high

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Ca2+ yüksekliğine dayalı ileri genetik ekran, bitkilerde kalsiyuma bağımlı sinyal yollarında yer alan genetik bileşenlerin tanımlanmasına yol açar.

İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için

Nöropsikiyatrik bozuklukların patogenezinde yakın zamanda keşfedilen hastalıkla ilişkili genlerin rolü belirsizliğini korumaktadır. Modifiye edilmiş bir in utero elektroporasyon tekniği, büyük nöron popülasyonlarında gen transferine ve gen ekspresyon değişikliklerinin sosyal davranış üzerindeki nedensel etkilerinin incelenmesine izin verir.

Kemirgen Davranışı Üzerindeki Genetik Etkileri Sorgulamak için İkili İn Utero Elektroporasyonunu Kullanan Bir Boru Hattı

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Keşfedin farelerde stres direnci genlerini ortaya çıkarmak için ES hücrelerde yüksek verimli bir tarama yöntemini. Bu teknik, uzun ömür çalışmaları için fenotipik fare modelleri oluşturmayı sağlar.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Daha fazla video keşfet