İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü
30 Mart 2016
İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.
Bu yöntem, hepatoloji ve toksikoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve bize yeni in vitro ko-kültür ve doku mühendisliği karaciğer modellerinin geliştirilmesi için fırsat sunabilir. Bu yeni tekniğin avantajı, tüm karaciğer hücresi popülasyonlarını aynı donörden ve aynı küçük karaciğer dokusu parçasından izole etmektir. Bu prosedüre başlamak için, yeni diseke edilmiş karaciğer dokusunu stile koşulları altında tartın ve karaciğer dokusu örneğini laminer hava akımı başlığına yerleştirin.
Daha sonra kanı doku örneğinin yüzeyinden temizleyin. Daha sonra, 1X perfüzyon solüsyonu bir kullanarak kanülleri yıkayın. Kanüllerin zeytinlerini daha büyük kan damarlarına sabitlemek için doku yapıştırıcısını kullanın.
Ardından perfüzyonu test edin ve kanüllerde sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Daha sonra, 1X perfüzyon solüsyonunu sızan tüm kan damarlarını doku tutkalı ile kapatın. Bundan sonra, kanüllü karaciğer dokusu örneğini Buchner hunisine yerleştirin.
Ardından, kullanılan kanül sayısına ve karaciğer dokusunun direncine bağlı olarak peristaltik pompanın akış hızını dakikada 7,5 ila 14,6 militer arasında ayarlayın. Tam kan en az 20 dakika ve en fazla 30 dakika boyunca dışarı atılana kadar dokuyu perfüze edin. Bazı durumlarda, perfüzyonu optimize etmek için kanüllerden birini plastik klemplerle klemplemek veya bir spatula ile karaciğer kapsülüne yumuşak bir şekilde bastırarak bir alanın iç basıncını artırmak gerekebilir.
Kahverengimsi kırmızıdan açık kahverengiye veya açık sarıya tam bir renk değişimi, iyi bir perfüzyonu gösterir. Daha sonra, perfüzyon sıvısını kollajenaz P içeren sindirim çözeltisine değiştirin. Ardından, sindirim adımı için kurulumu yeniden düzenleyin. Daha sonra, 15 dakikaya kadar dairesel bir sindirim çözeltisi akışı gerçekleştirin.
Perfüzyonu periyodik olarak durdurun ve sindirim derecesini kontrol edin. Karaciğer dokusu örneği yeterince sindirildiğinde sindirim solüsyonu ile perfüzyonun derhal durdurulması önemlidir. Hazır olduğunuzda karaciğeri cihazdan çıkarın ve bir cam tabağa koyun.
Doku örneğinin dışını buz gibi soğuk Durdurma Solüsyonu ile durulayın. Kanülleri karaciğer dokusu örneğinden çıkarın. Ardından, kanüllerin takıldığı alanın ortasını keserek karaciğer dokusu örneğini açmak için bir neşter kullanın ve Glisson kapsülünün sağlam kaldığından emin olun.
Doku örneğinin içini durulayın ve ardından tüm doku örneğini Durdurma Çözeltisi ile kaplayın. Ardından, hücreleri serbest bırakmak için dokuyu hafifçe sallayın. Ardından, hücre süspansiyonunu toplayın ve bir gazlı bez hunisinden 10 adet 50 mililitrelik plastik tüpe süzün.
500 mililitrelik son hacim tüketilene kadar karaciğer dokusu örneğine daha fazla Durdurma Çözeltisi ekleyin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin, daha sonra NPC izolasyonu için süpernatanı toplayın ve hücre peletlerini 250 mililitrelik plastik tüplere toplayın. Daha sonra, hücre peletlerini PBS ile yıkayın.
Bunun için hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın, peletleri bir araya getirin ve peleti hepatosit inkübasyon ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, Tripan mavisi boyamayı kullanarak elde edilen hücre süspansiyonundaki hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
Parankimal olmayan karaciğer hücrelerini izole etmek için, kalan eritrositleri ve hepatositleri ortadan kaldırmak için toplanan süpernatanı santrifüjleyin. Süpernatanları toplayın ve HCS, LEC, kısmen KC ve kalan KC'nin çökeltilmesi için hücre peletlerini elde etmek üzere iki kez santrifüjleyin. Sonraki, HBSS'deki peletleri yeniden askıya alın. Ardından, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için yoğunluk gradyan çözeltisini ve PBS'yi karıştırarak %25 ve %50 yoğunluk gradyanı hazırlayın.
%25 yoğunluklu gradyan çözeltisini dikkatlice %50 yoğunluklu gradyan çözelti katmanının üzerine yerleştirin. Ardından, her iki katmanın net bir şekilde ayrılmasını sağlamak için NPC süspansiyonunu dikkatli ve yavaş bir şekilde %25 yoğunluklu gradyan çözelti katmanının üzerine yerleştirin. Yoğunluk gradyanı üzerindeki hücre süspansiyonunu kesintisiz olarak santrifüjleyin.
NPC, %25 ve %50 yoğunluk gradyan katmanları arasındaki ara fazda bulunur. Ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını en üst tabakadan aspire edin ve interfazı dikkatlice toplayın. İkili santrifüjlemeden sonra, KC ve MPC fraksiyonu için bir hücre sayımı yapın.
Ardından, NPC fraksiyonunu daha önce açıklanan ikili santrifüjleme adımı ile santrifüjleyin ve NPC'yi Kupffer Hücre tohumlama ortamında yeniden süspanse edin. KC içeren fraksiyonu, plastik hücre kültürü kapları üzerinde, santimetre kare başına beş çarpı 10 ila 5. KC yoğunluğunda tohumlayın. KC kültürlerini 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde 20 dakika inkübe edin.
Birincil KC, hücre kültürü plastiklerine kısa bir süre içinde yapışmalıdır. Ardından, esas olarak LEC ve HSC'den oluşan yapışmamış NPC'yi içeren süpernatanı toplayın. LEC'yi HSC'den ayırmak için, süpernatantın santrifüjlenmesiyle başlayın.
Sonra, peleti PBS ile yıkayın. İkinci santrifüjlemeden sonra, hücreleri yıldız hücresi endotel hücre ayırma ortamında yeniden askıya alın ve kalan tüm hücreler için bir hücre sayımı yapın. Daha sonra, bir mililitre yıldız hücreli endotel hücre ayırma ortamında 10 milyon hücreyi yeniden askıya alın.
Daha sonra, immüno-etiketleme için MAX kitinden 20 mikrolitre bloke edici solüsyon ve 20 mikrolitre CD31 mikro boncuk ekleyin ve elde edilen süspansiyonu dört santigrat derece sıcaklıkta 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama sistemi max için üreticinin protokolünde açıklandığı gibi LEC'yi HSC'den ayırın ve HSC fraksiyonunu toplayın. Manyetik olarak tutulan CD31 pozitif LEC'yi elute edin ve bunları yıldız hücre endotel hücre kültürü ortamında askıya alın.
Burada, bu görüntüler, faz kontrast mikroskobu görünümünde izolasyon işleminden hemen sonra farklı izole karaciğer hücresi popülasyonlarını göstermektedir. Bu görüntü seti, 24 saatlik ekimden sonra izole edilmiş ve ekili hücreleri sunar. Farklı hücre fraksiyonlarının immünofloresan tabanlı karakterizasyonu burada gösterilmiştir.
PHH, izolasyondan 24 saat sonra hepatosit belirteci CK18 için pozitif sinyaller gösterdi, KC, izolasyondan 24 saat sonra belirteç CD68 için pozitifti, LEC, izolasyondan 72 saat sonra vimentin için pozitif sinyaller gösterdi ve HSC, izolasyondan 72 saat sonra GFAP için pozitifti. Bu prosedürü denerken, başarılı bir izolasyonun karaciğer dokusu örneğinin optimal sindirimine bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bu prosedürün kritik adımları olan sindirimi nasıl kontrol edeceğinizi ve yoğunluk gradyan ayrımını nasıl yapacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, tıbbi araştırma alanındaki araştırmacıların yeni oluşturulan in vitro hücre kültürlerinde ve doku mühendisliği yapılmış karaciğer modellerinde karaciğer fonksiyonlarını ve hastalıklarını keşfetmelerinin yolunu açtı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, aynı donörden insan hepatositler ve non-parenkimal karaciğer hücrelerini izole etmek için bir tekniği açıklar. Yöntem, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için gerekli olan karaciğer hücrelerinin yüksek verim ve canlılığı elde etmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hepatoloji
- Toksikoloji
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- Karaciğer hücrelerinin izolasyonu, araştırma ve terapötik uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler, tek bir donörden tüm karaciğer hücre popülasyonlarını verimli bir şekilde elde etmeyebilir.
- Hücre canlılığının ve verimin iyileştirilmesi in vitro modelleri geliştirebilir.
- Bu teknik, mevcut izolasyon yöntemlerindeki sınırlamaları ele almaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Tek bir karaciğer dokusundan tüm karaciğer hücre popülasyonlarını izole etmek için bir yöntem geliştirmek.
- İzole edilen karaciğer hücrelerinin canlılığı ve verimini artırmak.
- Yeni in vitro ko-kültür sistemlerinin geliştirilmesini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Taze olarak diseke edilmiş karaciğer dokusunun tartılması.
- Dokunun yüzeyindeki kanı temizlemek.
- Perfüzyon solüsyonu ile kanülleri yıkamak.
- Dokunun kan damarlarında kanülleri sabitlemek için doku yapıştırıcısı kullanmak.
Ana Sonuçlar
- Teknik, birden fazla karaciğer hücre tipini başarılı bir şekilde izole etmiştir.
- Hücrelerin yüksek verimi ve canlılığı elde edilmiştir.
- İn vitro karaciğer modellerinin geliştirilmesi potansiyeli gösterilmiştir.
- Yöntem, karaciğer fonksiyonu ve toksisitesinin çalışılmasını sağlar.
Sonuçlar
- Bu yöntem, araştırma için karaciğer hücreleri elde etmek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Toku mühendisliği ve ilaç testi için yeni yollar açar.
- Gelecekteki çalışmalar bu tekniği çeşitli uygulamalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Access to purified primary human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from a single donor enables the reconstruction of physiologically relevant human liver models for drug metabolism and toxicity testing. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a disease-relevant system that maintains hepatocyte function through paracrine signaling from Kupffer cells, liver endothelial cells, and hepatic stellate cells. The method enhances predictive confidence in lead identification by reducing the biological variability associated with dedifferentiated monocultures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a multicellular liver microenvironment that reflects in vivo patho-physiology.
- Operational Value: Provides a renewable source of phenotypically stable hepatocytes and NPCs for consistent target engagement assays.
- Scientific Value: Supports functional validation of targets involved in drug-induced liver injury through co-culture models that capture cell-cell communication.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers qualified biological systems with defined cellular composition for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Generates quantitative outputs such as albumin secretion, urea production, and CYP450 activity for reliable compound evaluation.
- Scientific Value: Facilitates phenotypic screening in 3D or co-culture formats that better predict clinical hepatotoxicity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system for studying liver pathophysiology and evaluating therapeutic candidates in a human context.
- Operational Value: Enables translational biomarker discovery by correlating in vitro readouts with clinical outcomes.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating the contribution of individual cell populations to liver injury pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated cell populations integrate into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical safety assessment, providing a continuous source of human liver biology for iterative model refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling functional readouts in co-cultures that mimic the liver sinusoid.
- Screening: Delivers assay-ready cells with high viability and standardized isolation for reproducible compound screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements such as metabolite formation, reactive oxygen species, and cytokine release for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through a scalable source of primary human liver cells that maintain key functional markers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform that reduces dependency on variable tissue sources and supports cross-project consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hepatotoxicity assessment by maintaining hepatocyte differentiation and function through NPC co-culture.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability of liver cell production from single donor samples, reducing batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant safety data that reduces late-stage attrition due to liver toxicity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mechanistic liver liability profiles derived from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in perfusion techniques, density gradient centrifugation, and cell sorting procedures.
- Dependent on access to fresh human liver tissue and specialized equipment such as peristaltic pumps and magnetic cell separators.
- Necessitates cross-team standardization of isolation protocols to ensure consistent cell quality and viability across sites.
- Involves adaptation considerations when scaling from small tissue samples to larger-scale production for multi-well screening formats.
- Practical limitations include tissue donor variability and the time-sensitive nature of cell isolation post-resection, which must be managed through standardized SOPs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Perfusion and Digestion of Liver Tissue Sample
2:36
Isolation of Hepatocytes
3:56
Isolation of Non-parenchymal Liver Cells
5:16
Separation of Kupffer Cells, Endothelial Cells, and Stellate Cells
7:07
Results: Morphology of Human Parenchymal and Non-parenchymal Liver Cells in Suspension and After Adherence
7:57
Conclusion
