İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Bu yöntem, hepatoloji ve toksikoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve yeni in vitro ko-kültür ile doku mühendisliği karaciğer modellerinin geliştirilmesi için bize fırsat sunar. Bu yeni tekniğin avantajı, tüm karaciğer hücre popülasyonlarının aynı donörden ve aynı küçük karaciğer dokusu parçasından izole edilmesini sağlamasıdır. Bu prosedüre başlamak için, taze diseke edilmiş karaciğer dokusunu steril koşullar altında tartın ve karaciğer dokusu örneğini laminer hava akımlı kabine yerleştirin.

Ardından kanı doku örneğinin yüzeyinden temizleyin. Sonra kanülleri 1X perfüzyon çözeltisi bir ile yıkayın. Kanüllerin zeytin uçlarını daha geniş kan damarlarına sabitlemek için doku yapıştırıcısı kullanın.

Ardından, perfüzyonu test edin ve kanüllerde sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sonrasında, berrak 1X perfüzyon solüsyonu sızdıran tüm kan damarlarını doku yapıştırıcısı ile kapatın. Bundan sonra, kanüllenen karaciğer doku örneğini Buchner hunisine yerleştirin.

Ardından, kullanılan kanül sayısına ve karaciğer dokusunun direncine bağlı olarak, peristaltik pompanın akış hızını dakikada 7,5 ile 14,6 mililitre arasında ayarlayın. Tüm kan temizlenene kadar dokuyu en az 20 dakika ve en fazla 30 dakika boyunca perfüze edin. Bazı durumlarda, perfüzyonu optimize etmek için kanüllerden birini plastik klemplerle sıkıştırmak veya bir spatula ile karaciğer kapsülüne hafifçe bastırarak bir bölgenin iç basıncını artırmak gerekebilir.

Kahverengimsi kırmızıdan açık kahverengiye veya açık sarıya doğru gerçekleşen tam bir renk değişimi, iyi bir perfüzyonu gösterir. Ardından, perfüzyon sıvısını collagenase P içeren sindirim solüsyonu ile değiştirin. Daha sonra, sindirim adımı için düzeneği yeniden düzenleyin. Sonrasında, sindirim solüsyonu ile 15 dakikaya kadar dairesel bir akış gerçekleştirin.

Perfüzyonu periyodik olarak durdurun ve sindirimin derecesini kontrol edin. Karaciğer doku örneği yeterince sindirildiğinde, sindirim çözeltisi ile yapılan perfüzyonun derhal durdurulması esastır. Hazır olduğunda karaciğeri cihazdan çıkarın ve cam bir kaba yerleştirin.

Doku örneğinin dış kısmını buz gibi soğuk Durdurma Çözeltisi ile durulayın. Kanülleri karaciğer doku örneğinden çıkarın. Ardından, kanüllerin takılı olduğu bölgenin ortasını bir skalpel ile keserek karaciğer doku örneğini açın ve Glisson kapsülünün sağlam kaldığından emin olun.

Doku örneğinin içini durulayın ve ardından tüm doku örneğini Stop Solution ile kaplayın. Daha sonra, hücrelerin dokudan ayrılmasını sağlamak için dokuyu nazikçe sallayın. Ardından, hücre süspansiyonunu toplayın ve bir gazlı bez huni aracılığıyla 10 adet 50-mililitre plastik tüpe filtreleyin.

500 mililitre nihai hacme ulaşana kadar karaciğer doku örneğine daha fazla Stop Çözeltisi ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu santrifüj edin, daha sonra NPC izolasyonu için üst fazı toplayın ve hücre peletlerini 250 mililitrelik plastik tüplerde birleştirin. Sonrasında, hücre peletlerini PBS ile yıkayın.

Bunun için hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın, peletleri birleştirin ve peleti hepatosit inkübasyon ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, Trypan mavisi boyama kullanarak elde edilen hücre süspansiyonundaki hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.

Non-parenkimal karaciğer hücrelerini izole etmek için, geri kalan eritrositleri ve hepatositleri uzaklaştırmak amacıyla toplanan süpernatantı santrifüjleyin. Süpernatantları toplayın ve HCS, LEC, kısmen KC ve geri kalan KC'lerin çöktürülmesi için hücre peletlerini elde etmek üzere iki kez santrifüjleyin. Ardından, peletleri HBSS içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, yoğunluk gradyanlı santrifüj için yoğunluk gradyanı çözeltisini ve PBS'yi karıştırarak %25 ve %50'lik yoğunluk gradyanları hazırlayın.

%25'lik yoğunluk gradyanı çözeltisini, %50'lik yoğunluk gradyanı çözeltisi katmanının üzerine dikkatlice yerleştirin. Ardından, her iki katman arasında net bir ayrım sağlamak için NPC süspansiyonunu %25'lik yoğunluk gradyanı çözeltisi katmanının üzerine dikkatli ve yavaşça ekleyin. Hücre süspansiyonunu yoğunluk gradyanında kesintisiz olarak santrifüjleyin.

NPC'ler, %25 ve %50 yoğunluk gradyan tabakaları arasındaki ara fazda yer alır. En üst tabakadaki ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını aspire edin ve ara fazı dikkatlice toplayın. Çift santrifüjasyon sonrası, KC ve MPC fraksiyonu için hücre sayımı gerçekleştirin.

Ardından, NPC fraksiyonunu daha önce açıklanan çift santrifüj adımıyla santrifüjleyin ve NPC'leri Kupffer hücresi ekim ortamında yeniden süspande edin. KC içeren fraksiyonu, santimetrekare başına 5 x 10⁵ KC yoğunluğunda plastik hücre kültürü kaplarına ekleyin. KC kültürlerini, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 20 dakika boyunca inkübe edin.

Birincil KC'ler kısa bir süre içinde hücre kültürü plastiklerine yapışmalıdır. Ardından, temel olarak LEC ve HSC'den oluşan yapışmamış NPC'leri içeren süpernatantı toplayın. LEC'leri HSC'lerden ayırmak için süpernatantın santrifüj işlemiyle başlayın.

Ardından, pellet PBS ile yıkayın. İkinci santrifüjden sonra, hücreleri stellat hücre endotelyal hücre ayırma ortamında yeniden süspande edin ve kalan tüm hücreler için hücre sayımı gerçekleştirin. Sonrasında, 10 milyon hücreyi bir mililitre stellat hücre endotelyal hücre ayırma ortamında yeniden süspande edin.

Ardından, MAX kitinden 20 µL bloklama çözeltisi ve immünolabeling için 20 µL CD31 mikroboncukları ekleyin ve elde edilen süspansiyonu 4 °C sıcaklıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, manyetik olarak aktive edilmiş hücre ayırma sistemi max için üretici protokolünde belirtildiği şekilde LEC'leri HSC'lerden ayırın ve HSC fraksiyonunu toplayın. Manyetik olarak tutulan CD31 pozitif LEC'leri elüye edin ve bunları stellate hücre endotel hücre kültür ortamına süspande edin.

Burada, bu görüntüler izolasyon işleminin hemen ardından faz kontrast mikroskobu görünümündeki farklı izole karaciğer hücresi popülasyonlarını göstermektedir. Bu görüntü seti, 24 saatlik kültürleme sonrası izole edilmiş ve kültüre edilmiş hücreleri sunmaktadır. Farklı hücre fraksiyonlarının immünofloresan tabanlı karakterizasyonu burada gösterilmiştir.

PHH, izolasyondan 24 saat sonra hepatosit belirteci CK18 için pozitif sinyaller göstermiştir; KC, izolasyondan 24 saat sonra CD68 belirteci için pozitif çıkmıştır; LEC, izolasyondan 72 saat sonra vimentin için pozitif sinyaller göstermiş ve HSC, izolasyondan 72 saat sonra GFAP için pozitif çıkmıştır. Bu prosedürü uygularken, başarılı bir izolasyonun karaciğer doku örneğinin optimal sindirimine bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, prosedürün kritik adımları olan sindirimin nasıl kontrol edileceği ve yoğunluk gradyanı ayırmanın nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, tıbbi araştırma alanındaki araştırmacıların, yeni oluşturulmuş in vitro hücre kültürlerinde ve doku mühendisliği ile üretilen karaciğer modellerinde hepatik fonksiyonları ve hastalıkları incelemelerinin önünü açmıştır.