Name: İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Keşfedin insan hepatosit ve non-parankimal karaciğer hücrelerinin aynı donörden izolasyonu için bu protokolü. Yüksek verim ve canlılık sağlayarak in vitro karaciğer modelleri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

0315741: Biz Bu çalışma Eğitim ve Araştırma (BMBF) projesi Sanal Karaciğer Alman Federal Bakanlığı tarafından desteklenen Şekil 1&#39;de oluşturulmasında desteklerinden dolayı Jia Li Liu teşekkür etmek istiyorum.

Not: Tüm hücreler birincil ya da ikincil karaciğer tümörlerinde parsiyel karaciğer rezeksiyonu sonra kalan rezeke olmayan tümörlü insan karaciğer dokusu, izole edilmiştir. Universitätsmedizin Berlin - hastaların aydınlatılmış onam Charité etik kurallarına göre elde edilmiştir. Malzemelerin ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> izolasyon işlemi sırasında bakteri kontaminasyonu önlemek için önceden tüm enstrümanları ve malzemeleri sterilize edin. </li><li> Taze hazırlanmış Sindirime Çözüm hariç olmak üzere, karaciğer doku numunesi, hepatositler ve non-parenkimal karaciğer hücrelerinin izolasyonu işlemi ve Tablo 1 ve 2&#39;ye göre birincil insan karaciğer hücreleri yetiştirme perfüzyon için gerekli çözümler hazırlanması kullanımdan önce. Bütün çözeltiler 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir ve hazırlandıktan sonra 4 hafta içinde kullanılması önerilmektedir. </li><li> sterilize etmek0.22 mikron şişe üst filtre kullanarak tüm çözümleri. </li></ol> Perfüzyon Ekipman 2. Hazırlık <ol><li> Şekil 1A gösterildiği gibi karaciğer doku örneğinin perfüzyon ve sindirim için donatım ayarlayın. </li><li> perfüzyon ve sindirim sırasında optimum kollajenaz P aktivitesini sağlamak için 39 ° C&#39;ye kadar su banyosu sıcaklığını ayarlayın. </li></ol> Karaciğer Doku Örneği 3. perfüzyon ve Sindirim (1.5 saat) <ol><li> rezeke karaciğer dokusundan dokunulmamış Glisson kapsülü bir doku numunesi seçin. Doku örneği keserken, iyi görünür damarlar ile küçük bir kesme yüzeyi elde etmek için deneyin. taşınması ve perfüzyon kadar buz üzerinde karaciğer doku örneği ele alarak sıcak iskemi süreleri kaçının. </li><li> steril koşullar altında, doku ağırlığı alın ve laminer hava akışının bir Petri kabındaki karaciğer doku numuneyi. yeniden steril bir kompres ile doku örneğinin yüzeyini temizleyinkan isti ve tüm kanül geçirgen olmasını sağlamak için 1x Perfüzyon-Çözüm kullanıyorum kanül seti yıkayın. </li><li> Bazı büyük kan damarlarında kanüller zeytin düzeltmek için doku yapıştırıcısı kullanın. Karaciğer doku numunesi uzunluğuna ve yüzeyde damarların sayısına bağlı olarak, 3 ila 8 kanüllü ayarlanmış bir kanül kullanın. perfüzyon test ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin. doku yapıştırıcısı ile net 1x Perfüzyon-Çözüm I sızıntısı tüm yakın kan damarları. </li><li> Kendi delikli bir filtre diski (Şekil 1a) Buchner hunisi içine kanüle karaciğer doku numunesi yerleştirin. </li><li> 7.5 ml / dak ve ikinci kanül sayısına ve karaciğer dokusunda direncine bağlı olarak 14.6 ml / dk peristaltik pompa akış hızını ayarlayın. bir akım ama yavaş perfüzyon orada olduğundan emin olmak için akış hızı her zaman ayarlayın. tam kan dışarı atılırlar ama en azından 20 dk kadar doku serpmek. İyi perfusi olan alanlarda daha parlak hale doku gözlemlemeküzerinde. Not: Bazı durumlarda, plastik parçaları ile kanüller bir kelepçe gerekli olabilir ya da perfüzyon optimize etmek için, karaciğer kapsülünün karşı bir spatula ile hafifçe iterek bir alan iç basıncı artırmak için. açık kahverengimsi renkte açık sarı için tam bir renk değişikliği iyi perfüzyon gösterir. </li><li> Kollajenaz P (Tablo 1) içeren Sindirim-Çözüm perfüzyon sıvısını değiştirin. </li><li> Sindirim adımı için kurulum (Şekil 1A) yeniden düzenleyin. Bu nedenle, en fazla 15 dakika süreyle Şekil 1B uyarınca Sindirime Çözüm dairesel bir akış yapar. Not: karaciğer doku numunesi yeterince sindirilir zaman hemen perfüzyon durdurmak için kritik öneme sahiptir. İyi bir sindirim bir spatula ile itildiğinde, kapsül deformasyonların bakımı ile değerlendirilen doku elastikiyeti belirtisi gösterdiğinde, görülebilir. </li></ol> Hepatositlerin 4. izolasyonu (1 saat) <ol><li> Trahatsız peristaltik pompa urn bir cam tabak içinde karaciğer doku numuneyi. Buz Stop çözeltisi (Tablo 1), doku numunesi dışında yıkayın. karaciğer doku örneğinden kanüller çıkarın. kanüller bağlanmıştır alanının ortasında incising, karaciğer doku örneği açmak için bir neşter kullanın. Glisson&#39;s kapsül sağlam kalır dikkat tutun. </li><li> doku örneğinin içini durulayın ve sonra buz soğuk Dur-Çözüm ile tüm doku örneği kapsamaktadır. doku dışarı hücreleri serbest bırakmak için hafifçe doku sallayın. </li><li> hücre süspansiyonu toplamak ve 50 ml plastik tüplere bir bakış hunisi (gazlı kompres ile kaplı plastik huni) aracılığıyla filtre. 500 ml&#39;lik bir nihai hacim tüketilene kadar, karaciğer doku numunesi daha Stop çözeltisi ilave edilir. </li><li> 50 x g&#39;de, 5 dakika, 4 ° C &#39;de bir hücre süspansiyonu santrifüj. Daha sonra olmayan parankimal hücre izolasyonu için süpernatant toplayın. PBS (Şekil 2 hücre pelletini yıkayınA). </li><li> 50 x g&#39;de, 5 dakika, 4 ° C sıcaklıkta tekrar hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatant toplayın ve Hepatosit Kuluçka ortamı pelet (Tablo 2, Şekil 2B) yeniden askıya. </li><li> Tripan mavi boya ile elde edilen hücre süspansiyonu, hücre sayısı ve canlılığı belirler. Bir Neubauer sayım odasında canlı ve ölü hücreleri saymak. Aşağıdaki formüller kullanılarak PHH hücre sayısı, canlılığı ve verim hesaplayın. hücre süspansiyonu (ml) verimi (hücreler sayılır) = sayılan hücre x seyreltme faktörü x hacim 10.000 x Verim (hepatositler / (g karaciğer doku örneği)) = (hücre süspansiyonu (mi) verimi (hepatositler / (ml ortamı)) x hacim) / (karaciğer doku numunesinin ağırlığı (g)) canlılığı (%) =% 100 x (canlı hücre sayısı) / (toplam hücre sayısı) </li></ol> Hepatositlerin 5. saflaştırma (1 saat) Not: canlılığı, bu saflaştırma aşaması önerilir% 70 daha düşüktür. <ol><li> Buz üzerinde tüm adımları uygulayın. 5 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve yoğunluk dereceli santrifüj 15 ml PBS karıştırılarak% 25 yoğunluk gradient hazırlayın. </li><li> Her iki tabakada arasında net bir ayrım (Şekil 2C) elde edilmesini sağlamak için% 25 yoğunluk gradyan tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde yavaş yavaş, hepatosit zengin hücre süspansiyonu üzerinden toplam 50 Milyon hücre fazla koyun. 1250 xg, 20 dakika, frensiz 4 ° C (Şekil 2B) de santrifüj ve santrifüj içine dikkatlice tüpleri koyun. </li><li> Kalan hücre süspansiyonu ve interfaz ölü hücreleri aspire. yağ içeriği biri bağlı da yoğunluk gradyan-çözüm aspire olabilir. Not: PHH düşük lipit içerikli yoğun pelet ve yoğunluk gradyan tamamen aspire edilebilir oluştururlar. yüksek lipit içerikli PHH pelet yukarıdaki yoğunluk gradyan çözeltisi içinde kalabilir, daha yaygın pelet ve canlı hücrelerin bir sürü oluşturur. </li><li>50 xg, 5 dakika, 4 ° C&#39;de tekrar PBS ve santrifüj ile hepatosit pelet yeniden askıya. pelet Havuz, PBS ile tekrar yıkayın ve Hepatosit Kuluçka ortamında saflaştırılmış PHH yeniden askıya. Adım 4.6 açıklandığı gibi hücre sayımını yapın. </li></ol> Hepatositlerin 6. Yetiştirme <ol><li> Örnek fare kuyruk kolajeni (kolajen tip I), bir hücre-dışı matris ile kaplanarak PhH tohumlanmasından hücre kültür kaplarına hazırlayın. Rajan ve arkadaşları tarafından kurulan protokole göre sıçan kuyruğu kollajen hazırlayın. 17 </li><li> sıçan kuyruğu kollajen stok solüsyonu 1 seyreltilir: 200 PBS içinde. Tüm yüzeyi kaplı kültür kaplarına transferi 100 ul / cm 2 sıçan kuyruğu kollajen çözüm, dikkat çekici. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hücre kültürü plastik inkübe edin. Kalan sıçan kuyruğu kollajen çözüm aspire. </li><li> Kültür dishe ilgili Hepatosit inkübasyon ortamı içinde tohum 15 x 10 4 hepatositler / cm2fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış s. En az 4 saat süreyle 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücrelerin kültive edilmesi. 4 saat sonra hepatositler yapıştırılır ve orta değiştirilebilir. </li><li> deney düzeneği bağlı soruşturmaları gerçekleştirin. 48 saat bir kültür süresi hücreleri izolasyon sürecinden kurtarmak için izin önerilir. </li></ol> Sigara parankimal karaciğer hücrelerinin 7. izolasyonu (1.5-2 saat) <ol><li> Santrifüj 72 x g&#39;de, 5 dakika, 4 ° C &#39;de toplanan süpernatan (aşama 4,5 4.6) geri kalan eritrosit ve hepatositleri elemek için kullanılan. süpernatantlar havuzu ve iki hücre pelletleri elde etmek için iki kez santrifüj: 300 xg, 5 dk, HSC, LEC ve kısmen KC 650 xg, 7 dakika, kalan KC çökmesi için 4 ° C sedimantasyon 4 ° C. </li><li> Havuz topakları hem HBSS onları yeniden askıya. % 25 ve yoğunluk gradyan Santrifüj için karıştırma yoğunluk gradyan çözeltisi ve PBS tarafından% 50 yoğunlukta renk geçişlerini hazırlayınugation (% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi: 5 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve 15 ml PBS,% 50 yoğunluk gradyan çözeltisi: 10 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve 10 ml PBS, bakınız Şekil 2). % 50 yoğunluk gradyan çözeltisi tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi yerleştirin. </li><li> Her iki tabakada arasında net bir ayrım elde edilir şekilde% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde yavaş yavaş NPC süspansiyon koyun. </li><li> Santrifüj 1800 xg, 20 dakika, frensiz 4 ° C (Şekil 2.2) yoğunluk gradyanı üzerinde hücre süspansiyonu. </li><li> Aspire ölü hücreler ve üst tabakadan hücre enkaz. NPC% 25 ve% 50 yoğunluk gradyan tabaka (Şekil 2) arasında arayüz içinde yer almaktadır. HBSS ve santrifüj ile yukarıda açıklanan çift santrifüj adımı uygulayarak hücre süspansiyonu yıkayın, NPC toplayın (adım 7.2.). </li></ol> Kupffer hücrelerinin 8. Ayırma (bağlılıkAyırma Aşaması) (1 saat) <ol><li> Adım 4.6 açıklandığı gibi NPC fraksiyonu KC için bir hücre sayımı gerçekleştirin. (Süspansiyon KC&#39;nin görünüm için Şekil 3B). Santrifüj, yukarıda tarif edilen çift santrifüj leme, aşama (aşama 7.2) NPC Kupffer hücre ekim ortamı (Tablo 2) yeniden askıya NPC fraksiyonu. </li><li> 5 x 10 5 KC / cm2 &#39;lik bir yoğunlukta plastik hücre kültür kaplarına KC içeren fraksiyonu tohumu. 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 20 dakika için KC kültürleri inkübe,% 5 CO2. İlköğretim KC kısa bir süre (Şekil 2.3) içinde hücre kültürü plastik üzerine yapışır. </li><li> başta LEC ve HSC oluşan değil yapıştırılır NPC içeren süpernatant toplayın. LEC sonraki ayrılması için süpernatantlar Havuz (bölüm 9) ve HSC (bakınız bölüm 10). HBSS ile yapışık KC yıkayın ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO de Kupffer hücre kültür aracı maddesi (Tablo 2) &#39;de onları yetiştirmekNemli bir kuluçka makinesi içinde 2. </li></ol> Endotel Hücreleri 9. Ayırma (1.5 saat) <ol><li> Santrifüj 300 x g&#39;de 5 dakika, 4 ° C &#39;de toplanan süpernatan (aşama 8,5).. PBS ile pelet yıkayın. 300 x g&#39;de 5 dakika, 4 ° C Stellat hücre / endotel hücre ayırma ortamı hücrelerin yeniden askıya ve adım 4.6 de tarif edildiği gibi geri kalan hücreler için bir hücre sayımı gerçekleştirmek santrifüjlemeden sonra. </li><li> Immunolabeling için Mac-kitinden bloke etme çözeltisi 20 ul ve CD31 Micro Beads 20 ul, 1 ml Stellat hücre / endotel hücre ayırma ortamı içinde, 1 x 10 7 Mio hücrelerin yeniden askıya ve 4 ° C&#39;de 15 dakika için sonuçtaki süspansiyon inkübe ° C sıcaklık (Şekil 2.4). </li><li> Manyetik aktif hücre sıralama sistemi MACS (Şekil 2.5) için imalatçının protokol açıklandığı gibi HSC ayırın LEC. manyetik muhafaza CD31-pozitif LEC Zehir ve Stellate C askıyaell / endotel hücre kültür ortamı (Tablo 2). </li><li> Adım 4.6 açıklandığı gibi LEC için sayma hücre gerçekleştirin. 1.25 x 10 5 hücre fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış hücre kültürü damarlarda / cm2 yoğunluğunda Tohum LEC (adım 6.1). Nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de hücrelerin kültive edilmesi. </li></ol> Stellat Hücreleri 10. Ayırma (0.5 saat) <ol><li> Etiketsiz HSC MACS işlemi sırasında ayırma sütunu geçmektedir. HSC fraksiyonu (Şekil 2.5 adım 9.5) toplayın. Adım 4.6 açıklandığı gibi hücre sayımını yapın. </li><li> Fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış hücre kültür kaplarında 5 x 10 4 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunlukla tohum HSC Stellat hücre / endotel hücre kültür ortamında (Tablo 2) (aşama 6.1) ve 37 ° C&#39;de,% 5 onları yetiştirmek nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde CO2. </li></ol><img alt= &quot;Tablo 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; Tablo 1: Perfüzyon ve izolasyon çözümü. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> Tablo 2: Kültür ve izolasyon ortamı.

<ol><li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , Maywood. (2014).</li>
<li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+and+development+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li>
<li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li>
<li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes%2C+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity%2C+cell+signaling+and+ADME%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li>
<li>Gómez-Lechón, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man%3A+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li>
<li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li>
<li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li>
<li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li>
<li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li>
<li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G. The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussler%2C+AK+%22Strategies+in+Regenerative+Medicine%22">Strategies in Regenerative Medicine</a>. Santin, M. , Springer. New York. 1-38 (2009).</li>
<li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes%2C+Kupffer+cells%2C+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li>
<li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li>
<li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li>
<li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver%3A+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li>
<li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li>
<li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li>
<li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832(2013).</li>
<li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li>
<li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation%2C+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li>
<li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis%3A+results+of+a+2-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

yayınlanan protokol aynı zamanda insan karaciğer dokusunda aynı örnekten yüksek kalitede ve saflıkta, saf PHH ve NPC, yani KC, HSC ve LEC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Karaciğer hücre izolasyonları ile ilgili yayınlar çoğunluğu sadece insan dokusu ile gerçekleştirildi, bu hücre popülasyonu 18-20 ve izolasyon prosedürlerinin biri 21 (Damm ve ark., Tarafından) nadirdir kapsamaktadır. İnsan karaciğer hayvan dokusu (örneğin, sıçan karaciğer) ile oluşturulan yöntemlerin adapta...

İnsan karaciğer dokusu son derece karmaşık ve iki farklı hücre varlıklar, parankimal hücreler ve non-parankimal hücreler (NPC) oluşur. Parenkimal karaciğer hücreleri hepatositleri ve cholangiocytes bulunmaktadır. Hepatositler toplam karaciğer hücrelerinin 60 70% temsil eden ve metabolik karaciğer fonksiyonlarının çoğu için hesap, örneğin, safra asidi ve faktör sentezi, metabolizma ve enerji metabolizmasını 2,3 tamamlayacak. Daha küçük NPC fraksiyonu toplam karaciğer hücrelerinin% 30-40 oluşturmaktadır. NPC farklı hücre popülasyonlarının, yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücrelerini (LEC) ve hepatik stellat hücreler (HSC) içerir. Bu heterojen hücre fraksiyonu karaciğer fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, NPC örneğin ilaç kaynaklı karaciğer hasarı (Dili) ve kronik karaciğer yaralanması, siroz 4 gibi akut karaciğer hasarı, aracılık katılabilir. Son yıllarda, Human karaciğer hücreleri karaciğer hastalıklarında daha önemli araştırma ve ilaç testleri, ilaç geliştirme ve yeni bir biyokimyasal yolların belirlenmesi gelişiminde olmuştur. İn vitro testler için PHH monokültürleri, hala &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir 5. Mevcut homotipik karaciğer modellerinde ana sınırlama birkaç gün 4 içinde farksızlaşma ve hepatositler fonksiyon kaybıdır. 3 boyutlu (3D) kültür teknikleri saptanması, bu sınırlama 4,6 telafi edilebilir olduğunu göstermiştir. Ancak, hatta modern 3D kültür teknikleri eylemlerin 7&#39;nin tüm hepatotoksik modlarını görüntülemek mümkün değildir. Mevcut in vitro modellerde eksik NPC popülasyonları in vivo duruma Bu farklılığın olası bir nedeni olarak tartışılmıştır. Aynı zamanda pathophy farklı karaciğer hücre popülasyonları arasında hücre-hücre iletişim fizyolojik homeostazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştirsiologic 8 işler. Bu nedenle bilimsel ilgi NPC ve hücre-hücre etkileşimleri üzerinde daha fazla duruluyor. Ko-kültür ve doku mühendisliği sistemlerindeki maksatlı kullanım mümkün olduğunca in vivo duruma kadar yakın, in vitro karaciğer modellerinin 8,9 yüksek talep için bir çözüm olabilir. Şu anda temel zorluk PHH ve NPC açıkça tanımlanmış bölümlerini içeren standart bir insan karaciğeri ko-kültür modeli, geliştirilmesidir. Sonuç olarak, çok heterojen karaciğer hücreleri için izolasyon teknikleri gerekli ve bu saf hücre popülasyonlarının kazanmak için optimize edilmiş olması vardır. PHH izolasyonu için standart protokoller 10 varken, insan NPC standartlaştırılmış izolasyon hala geliştirilme aşamasındadır. En yayınlanan NPC izolasyon protokolleri olmayan insan hücreleri 11,12 ile deneylere dayanmaktadır. Sadece birkaç yayınlar insan NPC izolasyon işlemini açıklar ve çoğu sadece kapakTek bir hücrenin izole edilmesi için yöntemler 11-16 yazın. Hücre ayrılması için kullanıldı edilmiştir en önemli hücre özelliklerinin boyutu, yoğunluğu, bağlanma davranışı ve yüzey proteinleri ifadesidir. Bu özellikleri temelinde biz Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 daha önce yayımlanan PHH, KC, LEC ve HSC, izole etmek basitleştirilmiş bir protokol geliştirmiştir. Çünkü bu teknikle geniş ilgi, bu makalenin amacı daha kolay tekniği üreten sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu. Protokol de verim ve canlılığının değerlendirilmesi için ve belirli immunostainings kullanılarak kimlik ve saflık değerlendirmesi için bir kalite kontrol yöntemleri içerir.

<table><tbody><tr><td>Genel Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetleri</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatör</td><td>Bağlayıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İdrar Beher</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>perfüzör şırınga 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>Şişe Üstü Filtre</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Polipropilen Konik Boru</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Polipropilen Konik Boru</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü plakası</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td><td>24 kuyulu</td></tr><tr><td>serolojik pipetler</td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td>pipet uçları</td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &mikro; l, 200 ve mikro; l, 1.000 ve mikro; l</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>İzolasyon Ekipmanları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>su banyosu</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltik pompa</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dolaşım termostat</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ince teraziler</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>standı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chner hunisi</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastik huni</td><td></td><td></td><td></td>zeytin</tr> uçlu <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>silikon tüp<td>kanüller</td></tr><tr><td>cam çanak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>neşter</td><td>Tüy</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer sayma odası</td><td>Optik Emek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hücresi kaldırıcı</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Örtü</td><td>Charit&eacute; Üniversite&auml; tsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>kompres</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr> steril <tr><td>cerrahi eldiven</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>Doku yapıştırıcısı</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>cam şişe</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Ayırma Solüsyonu</td><td>Biochrom</td><td>L6145</td><td>Yoğunluk 1.124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur içermez&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49.361.000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media Equipment&nbsp; < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Düşük Glikoz (1 g / L) (L-Glutamin olmadan)</td></tr> <tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi 1 &nbsp; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>L-Glutamin</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>olmadan GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözüm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>%0.4William</td></tr><tr><td>' s E&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX ve ticaret ile;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg / 2 ml</td></tr><tr><td>İnsan-İnsülin</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 IE / ml</td></tr><tr><td>N-Asetil sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu (FCS)</td> <td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Adı</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>İmmün Boyama Ekipmanları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>Ar-Ge D Sistemleri, ABD</td><td></td><td>monoklonal</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>poliklonal</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>monoklonal</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoklonal</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoklonal</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit %4</td> <td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

İlköğretim İnsan hepatositlerin İzolasyonu ve non-parankimal karaciğer hücrelerinin binbaşı popülasyonları İlgili protokolü

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

paren-kimal hepatositlerden yanında, karaciğer dışı parankimal hücreler (NPC), yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücreleri (LEC) ve hepatik yıldız şeklinde hücreler (HSC) oluşur. Birincil insan hepatosit (PHH) iki boyutlu (2D) kültürü hala ilaç metabolizması ve hepatotoksisite in vitro test için &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir. Bu PHH 2D monokültür, farklılaşmadan ve fonksiyon kaybına uğrar çok iyi bilinmektedir. Son zamanlarda karaciğer NPC karaciğer (pato-) fizyoloji merkezi bir rol ve PHH fonksiyonları bakım oynadığı gösterilmiştir. Mevcut araştırma 2D monokültürlere sınırlamaları aşmak için 3B ve ko-kültür modellerinde in vivo doku mimarisinin yeniden odaklanır. Daha önce insan karaciğer hücreleri izole etmek için bir yöntem yayınlanmıştır ve Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 hücre kültürlerinde kullanımları için bu hücrelerin uygunluğunu incelenmiştir. Bu te geniş ilgi dayalıBu yazının amacı chnique bu tekniğin kolay bir üreme sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu. Insan karaciğer hücreleri, iki aşamalı bir EGTA / kolajenaz P perfüzyon tekniği ile cerrahi müdahalelerin insan karaciğer doku örneklerinden izole edilmiştir. PHH 50 x g bir ilk santrifüj ile NPC ayrılmıştır. Yoğunluk gradyan santrifüj adımları ölü hücrelerin çıkarılması için kullanılmıştır. Bağımsız karaciğer hücre popülasyonları özel hücre özellikleri ve hücre sıralama prosedürleri kullanarak zenginleştirilmiş NPC fraksiyondan izole edilmiştir. PHH izolasyon yanında biz daha fazla ekimi için KC, LEC ve HSC ayırmak için başardık. Birlikte ele alındığında, sunulan protokol bir donör doku örneğinden yüksek kalite ve miktar PHH ve NPC izolasyonu sağlar. Saflaştırılmış karaciğer hücre popülasyonlarının erişim insan li gibi in vivo oluşturulmasına izin verebilirver modelleri.

yapışma özellikleri ve MACS kullanımı ile birlikte temizlik prosedürü olarak yoğunluk gradyan santrifüj kullanarak bir parankimal ve non-parankimal fraksiyonu içine ayrılık, başarılı PHH ve NPC izolasyona yol açar. PHH ve NPC yüksek kalite ve miktarda izole edilebilir. 1 karaciğer perfüzyon ve sindirim için ekipman temsilcisi kurulumunu göstermektedir. proteazlar proteolitik aktivitesini azaltmak ve karşılığında kolajenaz p aktivitesinin dengelenmesi içi...

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Bu yöntem, hepatoloji ve toksikoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve yeni in vitro ko-kültür ile doku mühendisliği karaciğer modellerinin geliştirilmesi için bize fırsat sunar. Bu yeni tekniğin avantajı, tüm karaciğer hücre popülasyonlarının aynı donörden ve aynı küçük karaciğer dokusu parçasından izole edilmesini sağlamasıdır. Bu prosedüre başlamak için, taze diseke edilmiş karaciğer dokusunu steril koşullar altında tartın ve karaciğer dokusu örneğini laminer hava akımlı kabine yerleştirin.Ardından kanı doku örneğinin yüzeyinden temizleyin. Sonra kanülleri 1X perfüzyon çözeltisi bir ile yıkayın. Kanüllerin zeytin uçlarını daha geniş kan damarlarına sabitlemek için doku yapıştırıcısı kullanın.Ardından, perfüzyonu test edin ve kanüllerde sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sonrasında, berrak 1X perfüzyon solüsyonu sızdıran tüm kan damarlarını doku yapıştırıcısı ile kapatın. Bundan sonra, kanüllenen karaciğer doku örneğini Buchner hunisine yerleştirin.Ardından, kullanılan kanül sayısına ve karaciğer dokusunun direncine bağlı olarak, peristaltik pompanın akış hızını dakikada 7,5 ile 14,6 mililitre arasında ayarlayın. Tüm kan temizlenene kadar dokuyu en az 20 dakika ve en fazla 30 dakika boyunca perfüze edin. Bazı durumlarda, perfüzyonu optimize etmek için kanüllerden birini plastik klemplerle sıkıştırmak veya bir spatula ile karaciğer kapsülüne hafifçe bastırarak bir bölgenin iç basıncını artırmak gerekebilir.Kahverengimsi kırmızıdan açık kahverengiye veya açık sarıya doğru gerçekleşen tam bir renk değişimi, iyi bir perfüzyonu gösterir. Ardından, perfüzyon sıvısını collagenase P içeren sindirim solüsyonu ile değiştirin. Daha sonra, sindirim adımı için düzeneği yeniden düzenleyin. Sonrasında, sindirim solüsyonu ile 15 dakikaya kadar dairesel bir akış gerçekleştirin.Perfüzyonu periyodik olarak durdurun ve sindirimin derecesini kontrol edin. Karaciğer doku örneği yeterince sindirildiğinde, sindirim çözeltisi ile yapılan perfüzyonun derhal durdurulması esastır. Hazır olduğunda karaciğeri cihazdan çıkarın ve cam bir kaba yerleştirin.Doku örneğinin dış kısmını buz gibi soğuk Durdurma Çözeltisi ile durulayın. Kanülleri karaciğer doku örneğinden çıkarın. Ardından, kanüllerin takılı olduğu bölgenin ortasını bir skalpel ile keserek karaciğer doku örneğini açın ve Glisson kapsülünün sağlam kaldığından emin olun.Doku örneğinin içini durulayın ve ardından tüm doku örneğini Stop Solution ile kaplayın. Daha sonra, hücrelerin dokudan ayrılmasını sağlamak için dokuyu nazikçe sallayın. Ardından, hücre süspansiyonunu toplayın ve bir gazlı bez huni aracılığıyla 10 adet 50-mililitre plastik tüpe filtreleyin.500 mililitre nihai hacme ulaşana kadar karaciğer doku örneğine daha fazla Stop Çözeltisi ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu santrifüj edin, daha sonra NPC izolasyonu için üst fazı toplayın ve hücre peletlerini 250 mililitrelik plastik tüplerde birleştirin. Sonrasında, hücre peletlerini PBS ile yıkayın.Bunun için hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın, peletleri birleştirin ve peleti hepatosit inkübasyon ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, Trypan mavisi boyama kullanarak elde edilen hücre süspansiyonundaki hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.Non-parenkimal karaciğer hücrelerini izole etmek için, geri kalan eritrositleri ve hepatositleri uzaklaştırmak amacıyla toplanan süpernatantı santrifüjleyin. Süpernatantları toplayın ve HCS, LEC, kısmen KC ve geri kalan KC'lerin çöktürülmesi için hücre peletlerini elde etmek üzere iki kez santrifüjleyin. Ardından, peletleri HBSS içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, yoğunluk gradyanlı santrifüj için yoğunluk gradyanı çözeltisini ve PBS'yi karıştırarak %25 ve %50'lik yoğunluk gradyanları hazırlayın.%25'lik yoğunluk gradyanı çözeltisini, %50'lik yoğunluk gradyanı çözeltisi katmanının üzerine dikkatlice yerleştirin. Ardından, her iki katman arasında net bir ayrım sağlamak için NPC süspansiyonunu %25'lik yoğunluk gradyanı çözeltisi katmanının üzerine dikkatli ve yavaşça ekleyin. Hücre süspansiyonunu yoğunluk gradyanında kesintisiz olarak santrifüjleyin.NPC'ler, %25 ve %50 yoğunluk gradyan tabakaları arasındaki ara fazda yer alır. En üst tabakadaki ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını aspire edin ve ara fazı dikkatlice toplayın. Çift santrifüjasyon sonrası, KC ve MPC fraksiyonu için hücre sayımı gerçekleştirin.Ardından, NPC fraksiyonunu daha önce açıklanan çift santrifüj adımıyla santrifüjleyin ve NPC'leri Kupffer hücresi ekim ortamında yeniden süspande edin. KC içeren fraksiyonu, santimetrekare başına 5 x 10⁵ KC yoğunluğunda plastik hücre kültürü kaplarına ekleyin. KC kültürlerini, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 20 dakika boyunca inkübe edin.Birincil KC'ler kısa bir süre içinde hücre kültürü plastiklerine yapışmalıdır. Ardından, temel olarak LEC ve HSC'den oluşan yapışmamış NPC'leri içeren süpernatantı toplayın. LEC'leri HSC'lerden ayırmak için süpernatantın santrifüj işlemiyle başlayın.Ardından, pellet PBS ile yıkayın. İkinci santrifüjden sonra, hücreleri stellat hücre endotelyal hücre ayırma ortamında yeniden süspande edin ve kalan tüm hücreler için hücre sayımı gerçekleştirin. Sonrasında, 10 milyon hücreyi bir mililitre stellat hücre endotelyal hücre ayırma ortamında yeniden süspande edin.Ardından, MAX kitinden 20 µL bloklama çözeltisi ve immünolabeling için 20 µL CD31 mikroboncukları ekleyin ve elde edilen süspansiyonu 4 °C sıcaklıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, manyetik olarak aktive edilmiş hücre ayırma sistemi max için üretici protokolünde belirtildiği şekilde LEC'leri HSC'lerden ayırın ve HSC fraksiyonunu toplayın. Manyetik olarak tutulan CD31 pozitif LEC'leri elüye edin ve bunları stellate hücre endotel hücre kültür ortamına süspande edin.Burada, bu görüntüler izolasyon işleminin hemen ardından faz kontrast mikroskobu görünümündeki farklı izole karaciğer hücresi popülasyonlarını göstermektedir. Bu görüntü seti, 24 saatlik kültürleme sonrası izole edilmiş ve kültüre edilmiş hücreleri sunmaktadır. Farklı hücre fraksiyonlarının immünofloresan tabanlı karakterizasyonu burada gösterilmiştir.PHH, izolasyondan 24 saat sonra hepatosit belirteci CK18 için pozitif sinyaller göstermiştir; KC, izolasyondan 24 saat sonra CD68 belirteci için pozitif çıkmıştır; LEC, izolasyondan 72 saat sonra vimentin için pozitif sinyaller göstermiş ve HSC, izolasyondan 72 saat sonra GFAP için pozitif çıkmıştır. Bu prosedürü uygularken, başarılı bir izolasyonun karaciğer doku örneğinin optimal sindirimine bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, prosedürün kritik adımları olan sindirimin nasıl kontrol edileceği ve yoğunluk gradyanı ayırmanın nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, tıbbi araştırma alanındaki araştırmacıların, yeni oluşturulmuş in vitro hücre kültürlerinde ve doku mühendisliği ile üretilen karaciğer modellerinde hepatik fonksiyonları ve hastalıkları incelemelerinin önünü açmıştır.

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İlköğretim hepatositler bir fizyolojik ilgili deneysel sistem biyokimyasal, moleküler ve metabolik fonksiyonlarını değerlendirmek için değerli bir araç sağlar. Biz sürekli to1.0 × 10 kadar yaşayabilir hepatositler üretir yerinde karaciğer perfüzyon, sıçan için güvenilir bir protokol...

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

İnsan hepatositlerinin izole edilmesi için bir modifiye edilmiş iki aşamalı bir kolajenaz perfüzyon prosedür tarif edilmektedir. Bu yöntem, aynı zamanda, diğer memeli karaciğerinden uygulanabilir. Izole hepatositler onları böyle karaciğer rejenerasyonu, farmakokinetik ve toksikoloji gibi alanlarda bilimsel araştırmalar için uygun bir model yapma, yüksek verim ve canlılığı mevcuttur.

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Bu protokol, özel bir intravenöz kateter, standartlaştırılmış steril tek kullanımlık tüp, gerçek zamanlı izleme ile tamamlanan sıcaklık kontrolü ve izole primer sıçan hepatositlerinin yaşayabilirliği, verimi ve işlevselliğindeki tutarlılığı artırmak için iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için bir alarm sisteminin kullanımını detaylandırmaktadır.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Lipid yüklü hepatositler karaciğer rejenerasyonuna özgüdür, ancak genellikle yoğunluk gradyan santrifüjleme ile kaybolurlar. Burada, steatotik hepatositleri tutan ve farelerde parsiyel hepatektomi sonrası rejenere hepatositlerin temsili popülasyonlarını veren optimize edilmiş bir hücre izolasyon protokolü sunuyoruz.

Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Bu protokol, bir sıçan modelinde optimize edilmiş iki aşamalı kollajenaz karaciğer perfüzyon tekniği sunar ve in vitro uzun süreli 3D organoid kültürü için izole hepatositlerin kullanımını gösterir.

Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür

Keşfedin insan hepatosit ve non-parankimal karaciğer hücrelerinin aynı donörden izolasyonu için bu protokolü. Yüksek verim ve canlılık sağlayarak in vitro karaciğer modelleri geliştirmeye yardımcı olur.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Daha fazla video keşfet