Name: Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin çözücü destekli lipid çift katman yöntemiyle katı yüzeylerde desteklenmiş membran üretimini. Bu teknik, lipit özelliklerini ve membran proteinlerini incelemek için biyofizik ve malzeme bilimi araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar NJC Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK -NRFF2011-01 ve NRF2015NRF-POC0001-19), Ulusal Medikal Araştırma Konseyi (NMRC / CBRG / / 2012 0005) ve Nanyang Technological University gelen destek için teşekkürlerimizi sunarız

Bir Hidrofilik Katı Destek Desteklenen çift katlı lipid 1. oluşumu <ol><li> 10 mg / ml 1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin lipid stok çözelti hazırlayın (DOPC) ve 1 mg / ml 1,2-dioleoil-sn -glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - (lisamin rodamin B ilgili lipid tozlar çözülmesiyle sülfonil) (Rh-PE) (uygun şekilde izopropanol çözeltisi içinde bir analitik kitle balansı) ile daha önce tartılmış. </li><li> Seyreltilir ve nihai konsantrasyonda istenilen lipid karışımı hazırlamak için izopropanol içindeki stok çözeltileri karıştırın. Floresans mikroskobu ve sıkı bağlamak deneyler için,% 0.5 ağırlık Rh-PE lipit karışımı içinde dahil edilmelidir. </li><li> Dolana kadar o mikroakışkan kanal içine izopropanol lipid karışımı enjekte edilir. </li><li> Yaklaşık 10 dakika boyunca bir cam yüzeyi üzerinde, lipid karışımı inkübe edin. </li><li> Yavaş yavaş çok düşük bir akış hızında, bir peristaltik pompa kullanılarak, su veya tampon solüsyonu ile lipid çözeltisi yerine(10-50 ul / dakika). Seçenek olarak ise, tekrar pipetleme lipit karışımı değiştirin. </li><li> Kalıntı izopropanol çıkartmak için aşırı tamponu ile iyice kanal durulayın. </li></ol> Kolesterol zenginleştirilmiş Desteklenen Membran 2. oluşumu Not: Katı yüzeyi (SiO 2) vezikül füzyon destekler, ancak kolesterol zenginleştirilmiş kesecikler yüksek sertliği 30 bükme çünkü membran bileşimi (yüksek kolesterol) vezikül füzyon engeller. <ol><li> İlk izopropanol ilgili tozların eritilmesi ile 10 mg / ml lipid DOPC, 10 mg / ml kolesterol ve 1 mg / ml Rh PE ihtiva eden bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> Yineleyin adımda 2.1 hazırlanan stok solüsyonları kullanılarak 1.2-1.6 adımları tekrarlayın. </li></ol> 3. Membran Akışkanlık Testi <ol><li> 10 dakika boyunca, sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi (% 1) içinde cam slayt bırakın. </li><li> Deiyonize su ile iyice yıkayın slaytlar ve zekâ durulamah etanol. </li><li> Darbe-kuru hafif bir azot akımı kullanılarak slaytlar. </li><li> Oksijen plazma odasına maksimum radyofrekans gücünde 30 saniye boyunca oksijen plazma slaytlar Açığa. </li><li> Dipsiz ticari mikroakışkan odası (Şekil 1A) koruyucu film kaplamayı bir cımbız kullanarak çıkartın ve bölmenin (Şekil 1B) yapışkan yüzüne cam slayt takın. </li><li> Odasının giriş ve çıkış pozisyonlarına içine konnektörleri ve tüp monte edin ve mikroskop sahne (Şekil 1C) üzerine mikroakışkan kanal yerleştirin. </li><li> Mikroakışkan kanal bir floresan etiketli desteklenen lipid çift Form [istenen lipit bileşimi kullanılarak tekrar aşama 1 (örneğin, 0.5 mg / ml DOPC) 0.5 ağırlık% Rh-PE organik bir çözücü de dahil olmak üzere]. </li><li> Görüntü yakalamak için 60X yağa batırılmış objektif (NA 1.49) ile iki tabakalı uçağı bulun. </li><li> İki ön ağartıcı görüntüleri çekmek, daha sonra 30 foto-ağartıcı1; a 532 nm, 100 mW lazer ışını ile geniş dairesel nokta m. Onun yoğunluğu dengeli hale gelene kadar photobleaching önce, lazer ısınmak. Hemen photobleaching sonra, ağartılmış noktada floresan kurtarma takip etmek amacıyla 2 dakika süreyle her 1 sn görüntüleri bir dizi yakalamak. </li></ol> 4. Kolesterol Ölçümü Testi <ol><li> Oksijen plazma odasına maksimum radyofrekans gücünde 30 saniye boyunca oksijen plazma silikon dioksit kaplı kuvars kristal sensör çipi Açığa. Odasından çipini çıkarın ve hemen ölçüm odasında çip monte edin. </li><li> Deneyden önce, ilk olarak uygun bir şekilde monte edilebilmesini sağlamak için hava içinde sensör yongasının sıklığı ve dağılımı elde. <ol><li> Ticari Q-Sense E1 veya E4 QCM-D enstrüman için, Q-Soft yazılım programı çalıştırın ve &quot;Toplama&quot; linkine tıklayın ve &quot;Kurulum Ölçüm&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Görüntülenen Yeni penceresinde, 3, 5, 7 çek, 9, 11 ve 13 imalar ardından bulun ve rezonans spektrumları kontrol etmek için çalıştırın tıklayın. 24 sıcaklık ayarlama ° C. Kişinin ya da daha fazla rezonans frekansları beklenen değerlerle kabul etmiyorsanız, montaj çip kontrol edin ve bir anlaşmaya ulaşılana kadar bu adımı tekrar gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Peristaltik pompayı 100 ul / dakikalık bir akış hızında ölçüm haznesine tampon çözeltisi (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) akar. </li><li> Yazılım programında, &quot;Toplama&quot; linkine tıklayın ve rezonans frekansı ve enerji sönümleme sinyallerini kaydetmek için &quot;Yeniden Ölçümü&quot; seçeneğini seçin. Istikrarlı bir temel frekans ve dağıtma vardiya için elde edilene kadar bu adımı yineleyin. Not: zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir edilebilir ilave frekans ve enerji kaybı değişimleri olacak bundan sonra adımlar için. </li><li> 10 dakika boyunca (lipid) olmadan izopropanol enjekte edilir. </li><li> En DOPC lipid / kolesterol karışımı enjekte10 dakika boyunca, izopropanol içinde 0.5 mg / ml&#39;lik bir toplam lipid konsantrasyonu, istenen mol oranı. </li><li> 100 ul / dakikalık bir akış oranında 20 dakika boyunca tampon enjekte edilir. </li><li> Tampon maddesi (oran 100 ul / dakika akış) frekans sinyalinin stabil bir değere ulaşıncaya kadar hazırlanan 1 mM metil-β-siklodekstrin (MβCD) ihtiva eden bir çözelti enjekte edilir. </li><li> MβCD muamele aşamasından kaynaklanan görece olumlu frekans değişimleri ölçün ve [Δm = Sauerbrey denklemi kullanarak toplu değerlere kadar taşınmış cho ve mesafe kadar taşınmış DOPC değerleri dönüştürerek kolesterol ve DOPC lipidlerin kütlesi hesaplamak - (C / n) × mesafe kadar taşınmış, burada C = 17,7 ng / cm 2, n: overtone]. </li><li> Dikkate DOPC lipid (786,1 g / mol) ve kolesterol (386.6 g / mol) molekül ağırlıklarına alarak SLB içinde kolesterol mol fraksiyonu hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+Scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: Scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+of+lipid+membranes+analyzed+with+high-resolution+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry.</a> Science. 313, 1948-1951 (2006).</li>
<li>Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+proteins+to+specific+target+sites+in+membranes+measured+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).</li>
<li>Bally, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII.+4+Virus-like+Particles+Recognize+Galactosylceramides+in+Domains+of+Planar+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).</li>
<li>Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+biosensor+with+single+virus-particle+sensitivity+based+on+fluorescent+vesicle+labels+and+equilibrium+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis.</a> Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).</li>
<li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+in+studies+on+immune+cell+adhesion+and+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication.</a> Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.</li>
<li>Mager, M. D., Melosh, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Bilayer+Deposition+and+Patterning+via+Air+Bubble+Collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse.</a> Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).</li>
<li>Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+of+Heterogeneous+Supported+Phospholipid+Multilayer+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns.</a> Small. 3, 71-75 (2007).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+solid-supported+lipid+bilayers+by+spin-coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+planar+bilayers+by+fusion+of+vesicles+to+supported+phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers.</a> Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).</li>
<li>Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution%3A+influence+of+surface+chemistry%2C+vesicle+size%2C+temperature%2C+and+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).</li>
<li>Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Driven+assembly+of+various+supported+lipid+platforms%3A+A+comparative+study+on+silicon+oxide+and+titanium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide.</a> Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).</li>
<li>Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+pathway+of+formation+of+supported+lipid+bilayers+of+DMPC+by+varying+the+sodium+chloride+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration.</a> Thin Solid Films. , 495-4246 (2006).</li>
<li>Stanglmaier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+anionic+phospholipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).</li>
<li>Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+osmotic+pressure+on+adhesion+of+lipid+vesicles+to+solid+supports%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports.</a> Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).</li>
<li>Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+titanium+dioxide+and+phosphatidyl+serine-containing+liposomes%3A+formation+and+patterning+of+supported+phospholipid+bilayers+on+the+surface+of+a+medically+relevant+material%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material.</a> Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).</li>
<li>Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+an+amphipathic+viral+peptide+to+create+a+lipid+bilayer+on+Au+and+TiO2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).</li>
<li>Hardy, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+supported+lipid+bilayers+with+high+cholesterol+content+formed+by+%5Bsmall+alpha%5D-helical+peptide-induced+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion.</a> Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).</li>
<li>Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-induced+formation+of+a+tethered+lipid+bilayer+membrane+on+mesoporous+silica%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica.</a> European Biophysics Journal. , 1-10 (2014).</li>
<li>Coutable, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+tethered-lipid+bilayers+on+gold+surfaces+for+the+incorporation+of+integral+membrane+proteins+synthesized+by+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression.</a> Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).</li>
<li>Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AH+peptide-mediated+formation+of+charged+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).</li>
<li>Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+adhesion+and+rupture+on+silicon+oxide%3A+Influence+of+freeze%E2%80%93thaw+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment.</a> Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).</li>
<li>Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Bilayer+Formation+on+Silicon+Dioxide+and+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold.</a> Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).</li>
<li>Hohner, A., David, M., Rädlera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+solvent-exchange+deposition+of+phospholipid+membranes+onto+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces.</a> Biointerphases. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly+at+Hydrophilic+Surfaces%3A+Factors+Influencing+the+Formation+of+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes.</a> Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).</li>
<li>Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Charged+Membranes+by+the+Solvent-Assisted+Lipid+Bilayer+%28SALB%29+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Method+on+SiO2+and+Al2O3.+Physical+Chemistry+Chemical+Physics.%2C+doi%3A10.1039%2FC5CP01428J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation.</a> Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. , (2015).</li>
<li>Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+Formation+of+Lipid+Bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Coatings+on+Bare+Aluminum+Oxide%3A+Overcoming+the+Force+of+Interfacial+Water.+ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer.</a> Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).</li>
<li>Keller, C., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+specific+kinetics+of+lipid+vesicle+adsorption+measured+with+a+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance.</a> Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).</li>
<li>Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+phase+separating+lipids+on+supported+lipid+bilayer+formation+at+SiO2+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).</li>
<li>Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance+with+dissipation+monitoring+of+supported+lipid+bilayers+on+various+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates.</a> Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).</li>
<li>Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+cholesterol+extraction+from+lipid+membranes+by+methyl-%CE%B2-cyclodextrin%E2%80%94A+surface+plasmon+resonance+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).</li>
<li>Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+evidence+for+lipid-domain+formation+in+the+transition+region+of+phospholipid+bilayers+by+two-probe+fluorescence+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer.</a> Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).</li>
<li>Okonogi, T., McConnell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+inversion+in+the+epifluorescence+of+cholesterol-phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers.</a> Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).</li>
<li>McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensed+complexes+of+cholesterol+and+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Condensed complexes of cholesterol and phospholipids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).</li>
<li>Tabaei, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Cholesterol-Rich+Supported+Membranes+Using+Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly.</a> Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).</li>
<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+Stripe+Superstructure+in+the+%CE%B2-Two-Phase+Coexistence+Region+of+Cholesterol%E2%80%93Phospholipid+Mixtures+in+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).</li>
<li>Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+molecular+organization+of+self-assembled+lipid+bilayers+on+solid+substrates+monitored+by+surface+plasmon+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 1195-11267 (1994).</li>
<li>Yuan, C., Johnston, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+evolution+in+cholesterol%2FDPPC+monolayers%3A+atomic+force+microscopy+and+near+field+scanning+optical+microscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies.</a> Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).</li>
<li>Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+image+contrast+mechanisms+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).</li>
<li>Tamm, L. K., Tatulian, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+spectroscopy+of+proteins+and+peptides+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+reviews+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers.</a> Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).</li>
<li>Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biological+thin+films+at+the+solid-liquid+interface+by+X-ray+reflectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity.</a> Physical Review Letters. 94, 238104(2005).</li>
<li>Koenig, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+reflectivity+and+atomic+force+microscopy+studies+of+a+lipid+bilayer+in+water+adsorbed+to+the+surface+of+a+silicon+single+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal.</a> Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak rakip mali çıkarları yoktur.

Bu çalışmada, bir çözücü-değişimi protokolü, bir katı destek ile inkübe edilir alkol (izopropanol, etanol veya n-propanol), hangi lipidler içinde sunulmaktadır ve daha sonra alkol, bir dizi kumanda etmek üzere, sulu bir tampon solüsyonu ile yavaş yavaş değiştirilir Faz geçişleri sonunda katmanlı fazlı çift katlı lipit katmanını 24 üreten. Bu yöntem, vezikül füzyon yöntemine dirençli olan altın gibi yüzeyler üzerinde desteklenen lipid iki katmanlı imalatım mümkün olduğu gösterilmiştir. Optimal bir lipid konsantrasyonu aralığı (0,1-0,5 mg / ml) Şimdiye kadar test edilen standart deneysel biçimleri tam çift katlı bir oluşum için tespit edilmiştir. Iki katmanlı 0.1 mg / ml arasında, ayrı ayrı, mikroskopik yamalar aşağıdaki lipit konsantrasyonlarında kurdu. Diğer taraftan, 0.1 mg / ml&#39;nin üzerindeki konsantrasyonlarda ve daha az daha 0,5 mg / ml, tam ve düzgün bir iki katmanlı oluşturulmaktadır. Bu aralığın üstüne lipit konsantrasyonlarında, iki katmanlı bir sıvı hala doğrulanmadan olarak elde edildiFRAP analizi ile ed Ancak, floresan mikroskobu çift katmanı üstüne ilave lipit yapıların varlığını gösterir. QCM-D analizi ile belirlendiği gibi, çarpıcı bir biçimde, bu ek de lipit yapıların morfolojisi, inkübasyon kademesi sırasında kullanılan alkolün bağlıydı. Etanol olması durumunda, nispeten yüksek Δ F ve Δ D kaymalar bir adsorbe vezikül tabakası için elde edilen QCM-D imza benzer. Izopropanol ya da n-propanol yerine kullanıldığı zaman Δ D kayda değer ölçüde daha yüksek iken, Δ f bir iki katmanlı (-30 Hz -40 arasında nihai Δ f) için tahmin edilen değerden biraz daha yüksek olmuştur. Bu tür QCM-D yanıtları (bazı durumlarda flüoresans mikroskopi ile görünür gibi) membran yüzeyinden dışarı doğru çıkıntı yapan uzun bir lipit yapıların (örneğin, solucan benzeri miseller) için beklenir. Çözücü değişimine oranı espec, kritik öneme sahip bir başka önemli parametredirAlt lipid konsantrasyonları (örneğin, 0,1 mg / ml) kullanılmıştır selülazlar olduğunda. Düşük lipid konsantrasyonunda hızlı solvent alış veriş eksik çift tabakaların oluşmasına yol açar. Bu yazıda QCM-D ölçümlerinin (Q-Sense E4 ölçüm odası), yaklaşık 100 ul / dk akış oranları için kullanılan standart ölçüm odasında, yüksek tekrarlanabilir tam iki katmanlı oluşumuna uygun idi. Diğer geometriler ve hacim ile akış hücreleri için, uygun bir akış hızı değişebilir ve ampirik olarak burada önerilen adımları göre belirlenmelidir. Vezikül füzyon dirençli olan yüzeyler üzerinde desteklenen lipid ikili katlar oluşturacak ek olarak, SALB böylece kompleks bileşimleri ile desteklenen zarların imalat kapı açma, yırtılabilir lipid vezikülleri için ihtiyaç aşmak için kullanılabilir. Açıklayıcı bir örnek, bir bileşim olarak, kolesterol, yüksek fraksiyonlu lipit karışımları incelenmiştir. Kolesterol memeli konakçının önemli bir bileşenidiralian hücre zarları ve onun fraksiyonu (eritrositler içinde, örneğin) membran lipid bileşiminin 45-50 mol% yaklaşım olabilir. Bu durumda, bir insan hücre zarı temsil eden bir çift katlı lipid bile basit bir model kolesterol içermelidir. Vezikül füzyon sadece% 10-15 kolesterol ihtiva eden akışkan bir lipid ikili tabakaları imal etmek için kullanılabilir ise 36 (QCM-D ölçümleri sayıya dökülmüş olarak 57% mol kadar), SALB yöntemi yüksek kolesterol içeren fraksiyonlar akışkan lipid iki katmanlı oluşum sağlamaktadır. Kolesterol seviyesi daha (63 mol kadar%) yükselmiş, ancak, şerit şeklinde alanları 37 gözlendi. Yandaş etki hava-su arayüzünde kolesterol / fosfolipidler tek tabaka faz diyagramı β bölgede gözlenen anımsatan sıvı vardı. Genel olarak, SALB yöntemi özellikle, desteklenen lipid ikili katlar oluşturacak için basit ve verimli bir yaklaşım olduğu gösterilmiştirGeleneksel vezikül füzyon yöntemi kapsamı dışındadır n olgu. Şu ana kadar, QCM-D tekniği ve floresan mikroskobu esas SALB metodu ile oluşturulmuş desteklenen lipit katmanlarını karakterize etmek için kullanıldı. İleriye yönelik olarak, yüzey plasmon rezonansı (SPR) 38, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 39,40 olmak üzere yüzey duyarlı analitik ölçümler teknikleri, geniş bir yelpazede, kızılötesi spektroskopi 41 Fourier-dönüşümü, X-ışını 42 ve nötron yansıtma 43 can, Daha fazla karakterize ve basit ve karmaşık iki katmanlı yapılandırmaları SALB yöntemiyle hazırlamak incelemek için kullanılabilir. Bunlar gelişmekte olan yetenekleri basit ve sağlam deneysel protokol yararlanarak yapay hücre zarlarını keşfedebilirsiniz bilim adamlarının daha fazla sayıda kapıyı açın.

Katı destekli lipid iki katmanlı 1 (SLB) bu tür iki tabakalı bir kalınlıkta, iki boyutlu lipit yayılma ve membran bağlantılı biyomoleküllerin barındırmak yeteneği gibi biyomembranlar temel özelliklerini koruyan çok yönlü bir platformdur. Nedeniyle doğal hücre membranlarının karmaşıklığı nedeniyle, bu basit bir platform 3, virüs ve virüs benzeri partikül 4,5 ciltleme gibi Sal oluşumu 2, protein gibi zara bağlı süreçlerin, in vitro çalışmalar için etkili bir platform işlevi gösterilmiştir ve hücre 6 sinyalizasyon. Katı bir desteğe yakın olarak kurulan SLB bu platform, toplam iç yansıma mikroskobu (TIRF), kuartz kristali mikro--dağılımı (QCM-D) ve empedans spektroskopi gibi yüzey duyarlı ölçümleri bir dizi teknik ile uyumludur. Çeşitli yöntemler de dahil olmak üzere hava kabarcığı SLBs farklı üretmek için geliştirilmiştirmikrondan daha küçük ebatlı lipit noktalar çöküşü 7 ve dip-kalem Nanolitografi 8, spin-kaplama iki tabakalı yığınları ve Langmuir-Blodgett (LB) 10 ve tam yayılarak, tek çift katlı lipid kaplamalar için vezikül füzyon (VF) 11 9. VF yöntem, sürekli bir lipid çift oluşturmak için katı bir destek ve daha sonra kendiliğinden kopma ve füzyon küçük tek lamelli vesiküller adsorpsiyonu oluşur. Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında kendiliğinden vezikül yırtılması ağırlıklı olarak silikon dioksit, cam ve mika gibi silikon bazlı malzemeler ile sınırlıdır. Buna ek olarak, vezikül yırtılması kolesterol veya negatif yüklü yüksek lipid içeren fraksiyonlar gibi karmaşık lipid bileşimlerin keseler kendiliğinden oluşmaz. Sisteme bağlı olarak, vezikül yırtılması daha sıcaklık 12, çözelti pH 13 ve tuzluluk 14, ozmotik şok 15 gibi deneysel koşulların uyarlayarak indüklenebilir </sbasınç 16, ya da Ca2 + gibi iki değerlikli iyonların yanı sıra yukarı&gt; ya da 17. Buna alternatif olarak zar aktif peptidi AH bir dizi vezikül kopma ve iki tabakalı bir oluşumuna yol açan, adsorbe veziküller bir tabaka destabilize etmek için dahil edilebilir 18-22 yüzeyleri. Ayrıca, başarılı bir şekilde iki katmanlı oluşum zaman alıcı ve belli membran bileşimleri için elde etmek zor olabilir küçük tek lamelli vesiküller ve iyi kontrol edilen bir nüfus hazırlanmasını gerektirir. Bu nedenle, optimal durumlarda yüksek verimliliğine rağmen (örneğin, veziküller 23 geniş dondurma-eritme öncesi işlemden sonra), vezikül füzyon genel uygulama için uygun alt tabakalar ve membran bileşimlerinin kapsamı ile sınırlıdır. Çözücü yardımlı lipid iki katmanlı (SALB) yöntemi 24-28 lipid kabarcıklar gerektirmeyen alternatif bir üretim tekniğidir. Yöntem biriktirme o dayanmaktadırSLB oluşumunu tetiklemek için, sulu bir tampon çözelti ile bu çözücü yavaş yavaş değişimi, ardından su ile karışabilen bir organik çözücünün varlığında, bir katı yüzey üzerine ön lipit molekülleri. Solvent değişim aşamasının, lipidler, bir organik çözücü üçlü karışım ve su sırasında yığın solüsyonu içinde bir katmanlı faz yapısında oluşumu ve katı bir substrat üzerinde SLB neden su oranının, artan bir dizi faz değişimlerine maruz kalır. Önemli olarak, bu kendi kendini montaj yolu genellikle SLB içinde adsorbe veziküllerin transformasyonu için sınırlayıcı bir adımdır vezikül yırtılması, ihtiyacı atlar. Protokol silikon dioksit, alüminyum oksit, krom, indiyum tin oksit, altın yüzeyleri de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygulanabilir. Bu yazıda ve beraberindeki video, SALB ve vezikül füzyon yöntemleri ile lipid birikimi bir karşılaştırma sunulmaktadır. Özel olarak, deney parametreleri etkisi de dahil olmak üzere, lipid konsantrasyonu,Akış oranı ve SALB yöntemi ile oluşturulan çift katlı kalitesi su ile karışabilen bir organik çözücü seçimi, tartışılmıştır. Imal edilmiş SLBs Analitik Karakterizasyonu (FRAP) teknikleri ışıkla ağartma sonra QCM-D, flüoresan mikroskobu ve floresan kurtarma ile gerçekleştirilir. QCM-D izleme Keller ve Kasemo 29 tarafından yapılan öncü çalışmalar, çünkü geniş bir nicel iki katmanlı oluşum araştırmak için kullanılmıştır, bir yüzey-duyarlı bir kütle ölçümü tekniğidir. Floresan mikroskopi zar homojenliği denetlenmesine yanı sıra membran etki görselleştirme izin verir. FRAP tekniği akışkan zarlarının esas bir özelliği olan, SLB, lipid moleküllerinin yatay hareketlilik belirlemek için standart bir araçtır. Bu çalışmanın ilk bölümü silikon dioksit ve altın iki tabakalı oluşumunu girişimi uygulanan SALB of QCM-D analizi ve vezikül füzyon yöntemleri içerir. İkinci bölümde ise,hazırlanması ve SALB yöntemi ile kolesterol konsantrasyonlarının bir dizi içeren bir taşıyıcı membran karakterizasyonu gösterilmiştir ve sonuçlar vezikül füzyon metodu ile elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır.

<table><tbody><tr><td>QCM-D silikon dioksit kaplı yüzeyler</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>İsveç</tr><tr><td>QCM-D altın kaplamalı yüzeyler</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>İsveç</tr><tr><td>Q-Sense E4 modülü</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>İsveç</tr><tr><td>Plazma Temizleyici, PDC-32G</td><td>Harrick Plazma, Ithaca, NY</td><td>PDC-001 (115V)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamine rodamin B sülfonil) (amonyum tuzu) (Rh-PE)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>kolesterol</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Metil-&beta;-siklodekstrin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol Sigma</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>673773</tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>459844</tr><tr><td>n-propanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>279544</tr><tr><td>Yapışkan Slayt I 0.1 Luer</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>Erkek dirsek 1/8"</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>Silikon boru 1.6 & # 160; mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Cam lamel No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 Peristaltik Pompa</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71725</td><td></td></tr></tbody></table>

solvent destekli çift katlı lipid (salb) yöntemi ile biyomembran fabrikasyon

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Hücre zarları taklit etmek amacıyla, desteklenen çift katlı lipid (SLB) katı yüzeylere biyouyumluluk ve biofunctionality kazandıran ise membran ile ilgili süreçlerin in vitro soruşturma sağlayan çekici bir platformdur. Fosfolipit keseciklerin spontan adsorpsiyon ve kopma SLBs oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında, vezikül füzyon (VF) lipid bileşimleri ve katı destek, yalnızca bir alt kümesi ile sınırlıdır. Burada, veziküller gerektirmez SLBs oluşturmak üzere çözücü yardımlı lipid iki katmanlı (SALB) oluşumu yöntemi denir tek-aşamalı bir genel prosedür tarif etmektedir. SALB yöntemi SLB oluşumunu tetiklemek amacıyla, su ile karışabilen organik çözücüler (örneğin, izopropanol) ve sulu tampon solüsyonu ile daha sonra solvent değişimi varlığında bir katı yüzey üzerine lipit moleküllerinin birikmesini içerir. Sürekli çözücü değişim aşaması uygulanmasını sağlarİzleme iki katmanlı oluşum ve yüzey duyarlı biyosensör geniş bir yelpazede kullanarak bir sonraki değişiklikler için uygun olan bir akış konfigürasyonunda metot. SALB yöntemi vezikül füzyon dirençli olanlar dahil olmak üzere, hidrofil bir yüzeylerin geniş bir yelpazede SLBs imal etmek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu vezikül füzyon metodu kullanılarak hazırlanamaz lipid bileşimlerinin oluşan SLBs imalatım mümkün. Burada, iki örnek hidrofilik yüzeyler, silisyum dioksit ve altın SALB ve konvansiyonel vezikül füzyon yöntemleri ile elde edilen sonuçları karşılaştırmak. SALB yöntemi ile hazırlanan, yüksek kaliteli iki katmanlı hazırlanması için deneysel koşullar optimize etmek için, yerleştirme aşamasında organik çözücü tipi, çözücü değişimine oranı ve lipit konsantrasyonu dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin etkisi sorun uçları ile birlikte ele alınmaktadır . Yüksek kolesterol içeren fraksiyonlar desteklenen membran oluşumu da cinler olanMembran yapılandırmaları geniş bir aralığı için SALB tekniğinin teknik özelliklerini vurgulayan, SALB yöntemiyle trated.

Biz lipid veziküller kullanmadan katı yüzeyler üzerinde desteklenen lipid çift oluşturmak için deneysel bir protokol mevcut. Çeşitli biyolojik uygulamalarda, kolesterol açısından zengin bir etki ile, bir lipid, silikon dioksit ve altın iki tabakalı olarak desteklenen zarları meydana getirmek üzere, bir aşamalı bir yöntemi göstermektedir.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Bu prosedürün genel amacı, çözücü destekli lipid çift katmanı yöntemiyle destekli membranlar üretmektir. Bu yöntem; lipidlerin ve membran proteinlerinin temel özelliklerini anlamak gibi membran biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabildiği gibi, ilaç keşifleri ve moleküler tanı gibi uygulamalara da imkan tanır. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel yöntemlerle mümkün olmayan birçok durumda, destek lipidlerini katman katman oluşturabilmesidir.Prosedür aynı zamanda kullanımı kolaydır ve minimum numune hazırlığı gerektirir. Bu tekniğin etkileri, membran proteinleri gibi önemli ilaç hedeflerinin incelenmesine olanak tanıdığı için tedavi ve teşhis yöntemlerimize kadar uzanmaktadır. Yöntem ayrıca, malzeme bilimi uygulamaları için biyouyumlu substratlar üretmek amacıyla da kullanılabilir.Bu Yöntemle ilgili fikri ilk olarak, geleneksel membran üretim yöntemlerinin zorluklarını tartışırken ve prosedürün laboratuvarımızdaki lisansüstü öğrencilere kolayca ve hızlıca öğretilebileceğini gördüğümüzde edindik. Lipid tozunu izopropanol çözeltisinde çözerek 10 mg/mL DOPC lipid stok çözeltisi hazırlayın. Ardından, 1 mg/mL lipid stok çözeltisi elde etmek için rhodamine etiketli DOPE lipid tozunu izopropanol çözeltisinde çözün.Floresans, mikroskopi ve fotobleşing sonrası floresans geri kazanımı veya FRAP deneyleri için gerekli nihai konsantrasyondaki lipid karışımını hazırlamak amacıyla stok çözeltileri İzopropanol içinde seyreltin ve karıştırın; lipid karışımına ağırlıkça %0.5 R domine işaretli DOPE dahil edilmelidir. İzopropanol içindeki lipid karışımını, mikroakışkan kanal dolana kadar enjekte edin. Lipid karışımını cam yüzey üzerinde yaklaşık 10 dakika boyunca inkübe edin.Tuz değişimi çok düşük bir akış hızında gerçekleştirilmelidir, aksi takdirde çift tabakanın kalitesi düşük olacaktır. Bir peristaltik pompa kullanarak, lipid çözeltisini çok düşük bir akış hızında kademeli olarak su veya tampon çözelti ile değiştirin. Ardından, kolesterolce zenginleştirilmiş destekli membranların oluşumu için kalıntı izopropanolü uzaklaştırmak amacıyla kanalı fazla tamponla iyice durulayın.Sırasıyla tozları izopropanol içinde çözerek ve ardından membran akışkanlık analizini gerçekleştirmek için öncekiyle aynı protokolü tekrarlayarak DOPC, lipid kolesterol ve rho domine, etiketli DOPE lipid içeren bir stok çözelti hazırlayın. İlk olarak cam lamı 1% sodyum ESAL sülfat çözeltisine 10 dakika boyunca daldırın. Ardından lamları deiyonize su ile iyice yıkayın ve etanol ile durulayın.Lamları hafif bir nitrojen akımı kullanarak kurutun. Ardından, lamları oksijen plazma odasında maksimum radyo frekans gücünde 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Sonrasında, tabansız ticari mikroakışkan odanın koruyucu film kaplamasını cımbız yardımıyla çıkarın ve cam lamı odanın yapışkan tarafına sabitleyin.Konnektörleri ve tüpleri odacığın giriş ve çıkış konumlarına monte edin ve mikroakışkan kanalı mikroskop tablasına yerleştirin; daha önce olduğu gibi, ağırlıkça %0,5 rho domine etiketli DOPE Lipid İnorganik çözücü içeren istenen lipid kompozisyonunu kullanarak mikroakışkan kanal içerisinde floresan işaretli destekli bir lipid çift tabakası oluşturun. Ardından, 60x yağ daldırma objektif ile çift tabaka düzlemini belirleyin. Görüntüleri yakalamak için öncelikle, fotobezme gerçekleşmeden önce iki adet ön beyazlama görüntüsü alın.Lazerin yoğunluğu sabitlenene kadar ısıtın. Ardından, 532 nanometre 100 miliwatt lazer ışını ile 30 mikron genişliğinde dairesel bir noktayı fotobleyk edin. Fotobleaching işleminin hemen ardından.Kolesterol miktarını belirlemek amacıyla, ağartma noktasındaki toparlanmayı ve floresans yoğunluğunu izlemek için iki dakika boyunca her bir saniyede bir dizi görüntü kaydedin. İlk olarak, silikon dioksit kaplı kuvars kristal sensör çipini, oksijen plazma odasında maksimum radyo frekans gücünde 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Çipi odadan çıkarın ve hemen ölçüm odasına yerleştirin; deneyden önce burada Q Sense E four A dört kanallı kuvars kristal mikroterazi kullanılmıştır.Doğru montajı sağlamak için sensörün ve havanın frekans ve dissipasyon değerlerini elde edin. Bunun için qof yazılım programını çalıştırın. Edinme (acquisition) seçeneğine tıklayın ve açılan yeni pencerede kurulum ölçümünü (setup measurement) seçin; 3 5 7 9 11 ve 13 üst tonlarını (overtones) kontrol edin.Ardından bul ve çalıştır seçeneğine tıklayın. Rezonans spektrumlarını kontrol etmek için sıcaklığı 24 °C olarak ayarlayın. Uygun montaj sağlandığında, peristaltik pompayı çalıştırın ve yazılım programı üzerinden ölçüm odasına dakikada 100 µL akış hızında tampon çözelti akıtın; rezonans frekansı ve enerji dissipasyon sinyallerini kaydetmek için veri toplama seçeneğine tıklayın ve ölçümü yeniden başlat'ı seçin.Kararlı bir temel çizgi elde edilene kadar bu adımı tekrarlayın. Frekans ve dissipasyon kaymaları için. Lipitsiz izopropanolü 10 dakika boyunca enjekte edin.Bunu, izopropanol içerisinde 0.5 mg/mL toplam lipid konsantrasyonuna sahip, istenen molar orandaki DOPC lipid ve kolesterol karışımının 10 dakika boyunca enjeksiyonu ile takip edin. Ardından, 100 µL/dakika akış hızında 20 dakika boyunca tampon çözelti enjekte edin. Son olarak, frekans sinyali kararlı bir değere ulaşana kadar, tampon çözelti içerisinde hazırlanmış 1 mM metil beta siklodekstrin çözeltisi enjekte edin.Metil beta siklodekstrin uygulama adımının neden olduğu bağıl pozitif frekans kaymalarını ölçün ve metin protokolünde açıklandığı şekilde toplam kolesterol ve DOPC lipidlerini hesaplayın. Ardından, DOPC lipidi ve kolesterolün moleküler ağırlıklarını dikkate alarak, desteklenmiş lipid çift tabakasındaki kolesterolün mol kesrini hesaplayın. Burada, SAL yöntemiyle cam yüzeyler üzerinde oluşturulmuş, ağırlıkça %0,5 rumin işaretli DOPE lipidi içeren bir DOPC lipid çift tabakasının temsili floresan mikroskopi görüntüsü gösterilmiştir.Fotobleykleme sonrası floresan geri kazanımı deneyi, lipid çift tabakasının lateral akışkanlığını belirten neredeyse tam bir floresan geri kazanımı göstermiştir. Burada, destekli çift tabaka oluşumu için frekans ve dissipasyon kaymalarına ait temsili QCMD eğrileri yer almaktadır. SAL yöntemi kullanılarak, yönteme hakim olunduğunda düzlemsel bir çift tabaka oluşumuna karşılık gelen nihai rezonans frekans kaymaları ve dissipasyon kaymaları elde edilmiştir.Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulandığında 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, solvent destekli lipid çift tabaka yöntemini kullanarak destekli biyomembranların nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, deneyden önce taze lipid çözeltileri hazırlamayı ve deney düzeneğinize bağlı olarak solvent değişim hızını optimize etmeyi hatırlamanız önemlidir; bu prosedürü takiben, membran domainlerinin oluşumu gibi ek soruları yanıtlamak için Atomik kuvvet mikroskobu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak in vitro olarak cam destekli bir lipid çift tabakası üzerinde septin organizasyonunu araştırmak için bir prosedür gösteriyoruz.

Düzlemsel Destekli Lipid Bilayer Deneyi: Biyolojik Membran Mimiklerinde Septin Montajını Araştırmak İçin Mikroskopi Tabanlı İn Vitro Teknik

Bu video, lipid çift katmanları ile kaplanmış mikroküreler üzerinde septin protein düzeneğini inceleme tekniğini açıklar. Bu teknik, eğri yüzeyler üzerindeki eğriliğe bağlı protein düzeneklerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Küresel Destekli Lipid Çift Tabakalı Deney: Mikroküreler Üzerinde Septin Düzeneğini Gözlemlemek İçin Bir Teknik

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır ve doğal zar parçacıkları hücre zarlarının özelliklerini yaklaşık ve analitik çeşitli stratejiler dahil edilmesi uygun sistemlerdir. Burada destekli lipid iki katmanlı kaplı SiO 2 boncuklar, fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıklarının oluşan mikrodizileri hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Bir depolanabilir, taşınabilir lipit iki katmanlı oluşum sistemi göstermektedir. Dondurulmuş bir membran ön-madde çevre sıcaklığına getirildiğinde bir lipid iki-tabakalı zar üzerinden% 80 başarı oranı ile 1 saat içinde oluşturulabilmektedir. Bu sistem iyon kanalları ile ilişkili zahmetli süreçler ve uzmanlık azaltacaktır.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin çözücü destekli lipid çift katman yöntemiyle katı yüzeylerde desteklenmiş membran üretimini. Bu teknik, lipit özelliklerini ve membran proteinlerini incelemek için biyofizik ve malzeme bilimi araştırmalarında kullanılır.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

Daha fazla video keşfet