Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Bu prosedürün genel amacı, mikroakışkan bir cihazdaki hücreler üzerine ince bir kollajen düzeneği yerleştirmektir. Bu, net pozitif yüklü kollajen molekülleri oluşturmak için önce asitleştirilmiş doğal kollajenin metilasyon yoluyla modifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, net negatif yüklü kollajen molekülleri oluşturmak için asitleştirilmiş doğal kollajeni asyon yoluyla modifiye etmektir.

Daha sonra, mikroakışkan cihazlar hazırlanır ve gece boyunca bağlanmasına ve yayılmasına izin verilen hepatositlerle tohumlanır. Son adım, hücre tabakasının üstünde 10 çift katmanlı kollajen oluşturmak için hücreleri dönüşümlü olarak pozitif ve negatif yüklü kollajen çözeltilerine maruz bırakarak kollajen düzeneğini biriktirmektir. Sonuç olarak, faz ve immünofloresan mikroskobu ve albümin ve üre testleri, hücre polaritesinin ve salgılama fonksiyonunun gelişimini ve sürdürülmesini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin başlıca avantajları, 20 yılı aşkın bir süredir plak kültürlerinde uygulananlara benzer teknikler kullanarak mikro cihazlarda hepatosit kültürüne olanak sağlamasıdır. Karmaşık cihaz tasarımları gerektirmez ve biriktirilen matris 100 nanometre mertebesinde çok incedir. Bu yöntem için ilk olarak, sınıf Capy hücre kültürü tekniklerinin plakalardan mikroakışkan cihazlara nasıl çevrileceği konusunda beyin fırtınası yaparken aklımıza geldi.

Kollajen sandviç yöntemleri üstü açık mikroskobik sistemlerde işe yarar ancak kullanılan hidrojeller sınırlı kanal yüksekliklerine sahip kapalı mikro cihazlarla uyumsuzdur. 100 miligram doğal asitlenmiş kollajen çözeltisini buz, soğuk, steril su ile mililitre başına 0.5 miligram konsantrasyona seyreltin ve alasyonu önlemek için çözeltiyi buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, kollajen çözeltisinin pH'ını birkaç damla normal sodyum hidroksit ile dokuz ila 10 arasında ayarlayın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın.

Kollajen çökeldikçe, çözelti bulanıklaşmaya başlayacak, çökeltilmiş kollajen çözeltisini 25 dakika boyunca 3000 kez G döndürün. Daha sonra, tüplerin dibinde berrak bir jel benzeri çökelti görülmeli, snat'ı aspire etmeli ve daha sonra çökelmiş kollajeni 0.1 normal hidroklorik asit ile 200 mililitre metanol içinde yeniden süspanse etmeli, metilasyon santrifüjünden sonra dört gün boyunca oda sıcaklığında karıştırılırken metilasyon reaksiyonunun meydana gelmesine izin vermelidir, metillenmiş kollajeni peletlemek için 25 dakika boyunca 3000 kez G'de çözelti, Daha sonra asitlendirilmiş metanol supinatı aspire edin ve atın. Daha sonra, metillenmiş kollajeni 25 mililitre steril PBS içinde çözün ve çözeltiyi 60 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün.

Bir normal sodyum hidroksitin 20 mikrolitrelik artışlarını kullanarak çözeltinin pH'ını 7.3 ila 7.4'e ayarlayın. Ticari bir sıçan kollajen ELIZA kiti veya hidroksiprolin tahlil kiti kullanarak kollajen çözeltisinin konsantrasyonunu değerlendirin. Daha sonra çözeltiyi steril PBS ile mililitrede üç miligrama seyreltin.

Metillenmiş kollajen solüsyonunu vidalı kapaklı bir cam şişeye aktararak sterilize edin. Şişenin dibine üç mililitre kloroformu dikkatlice yerleştirin ve şişenin gece boyunca dört santigrat derecede sertleşmesine izin verin. Ertesi sabah.

Aseptik olarak, üst metillenmiş kollajen tabakasını çıkarın. Metillenmiş kollajeni dört santigrat derecede saklayın ve bir ay içinde kullanın. 100 miligram başka bir doğal asitlenmiş kollajen solüsyonunu buz, soğuk, steril su ile mililitre başına 0,5 miligram konsantrasyona seyreltin ve daha önce gösterildiği gibi dasyonu önlemek için solüsyonu buzun üzerine yerleştirin, kollajen solüsyonunun pH'ını sodyum hidroksit ile ayarlayın ve kollajeni çökeltmek için solüsyonu oda sıcaklığında karıştırın.

Daha sonra, 10 mililitre asetonda 40 miligram altı sinik anhidrit çözün. Bu karışımı, çözeltinin pH'ını karıştırırken ve sürekli olarak izlerken kollajen çözeltisine 0,5 mililitrelik artışlarla yavaşça ekleyin. PH 9.0'a yaklaştıkça bir veya iki damla normal sodyum hidroksit ekleyerek pH'ı 9.0'ın üzerinde tutun ve oda sıcaklığında 120 dakika boyunca sürekli karıştırın.

Altı sinik ve hidrit çözeltisinin tümünü ekledikten sonra, süksinat kollajen çözüldükçe karışımın berraklaştığını gözlemleyin, 9.0'ın üzerinde kaldığından emin olmak için pH'ı periyodik olarak kontrol etmeye devam edin. Süksinat kollajenin tamamı çözüldüğünde, bir normal hidroklorik asidin 20 mikrolitrelik artışlarını kullanarak çözeltinin pH'ını 4.0'a ayarlayın. Çözeltiyi gözlemleyin, süksinat kollajen çökeltikçe tekrar bulanıklaşın.

Daha sonra çözeltiyi 25 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyin. Süksinat kollajen asbury'yi peletlemek ve asitlenmiş snat'ı reaktif olmayan snic anhidrit ile atmak için, süksinat kollajeni 25 mililitre steril PBS'de tekrarlanan pipetleme ile çözün ve mililitre başına yaklaşık üç miligramlık bir nihai konsantrasyon elde edin. Daha sonra çözeltiyi 60 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün ve ardından çözeltinin pH'ını 7,3 ile 7,4 arasında ayarlayın.

Bir normal sodyum hidroksitin 20 mikrolitrelik artışlarını kullanarak, ticari bir kollajen sıçan ELIZA kiti veya hidroksiprolin test kiti kullanarak çözeltinin konsantrasyonunu değerlendirin. Daha sonra çözeltiyi mililitre başına üç miligrama seyreltin. Steril PBS kullanarak, bu atılmış kollajen solüsyonunu metillenmiş kollajen solüsyonu ile aynı şekilde sterilize edin.

Hücre büyümesi için 100 mikron uzunluğunda, 0,4 ila 1,5 milimetre genişliğinde ve bir ila 10 milimetre uzunluğunda kanallara sahip hücre kültürü odalarına sahip standart tekniği kullanarak bir mikroakışkan cihaz üreterek başlayın. Cihazın yüzeylerini oksitlemek için bir plazma temizleyici ve bir cam slayt kullanın. Ardından bir bağ oluşturmak için ikisini birbirine bastırın.

Cihazı en az 30 dakika UV ışığına maruz bırakarak sterilize ettikten sonra. Hazneyi mililitre başına 15 mikrogram, steril PBS'de fibronektin ile doldurun ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hücreli cihaza bakın.

Laminer akışlı bir doku kültürü davlumbazında, cihaz başına her bir çözeltinin 10 uygulaması için yeterli hacimde metillenmiş ve atılmış kollajen çözeltilerinin yanı sıra birkaç aşırı mililitre ortam hazırlayın. Çözeltileri buz üzerinde tutun. Cihazları 20 mikrolitre metillenmiş ve daha sonra atılmış kollajen solüsyonları ile dönüşümlü olarak yıkayın.

Her uygulama arasında bir dakika bekleyin. Cihazı çözelti başına toplam 10 kez yıkayın. Kollajen katmanlarını büyütürken hücrelerin ortamsız kaldığı süreyi en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın, mikroakışkan cihazın giriş ve çıkışında kollajenin yavaş yavaş biriktiğini gözlemlemek mümkündür.

Sıvı akışına karşı direnç artarsa, cihazı bir veya iki kez ortamla yıkayın ve ardından katmanlamaya devam edin. Tüm katmanları uyguladıktan sonra, cihazı iki kez taze ortamla durulayın ve inkübatöre geri dönün. Metilasyon ve asyon, kollajen moleküllerinin yük özelliklerini değiştirir.

Asyon, pozitif yüklü grupları uzaklaştırır ve bunları negatif yüklü gruplarla değiştirir ve metilasyon, negatif yüklü grupları uzaklaştırır, net pozitif yüklü moleküller oluşturur ve iki kollajen varyantının hücreler gibi yüklü yüzeylerin üzerinde katman katman birikmesine izin verir. Mikroakışkan bir cihaz içinde fibronektin kaplı cam üzerine ekilen primer hepatositler bu tabaka tabaka kaplanabilir. Kollajen matriks montajı, 10 çift tabakanın hücreler üzerinde birikmesi, yaklaşık 140 nanometre hepatositten oluşan bir kollajen tabakası kalınlığı oluşturur ve üst kollajen tabakası tabaka tabaka olmaz.

Matris, farklılaşmış fenotip sözleşmelerini kaybeder ve zamanla mikroakışkan cihazların yüzeyini kaldırır. Buna karşılık, ultra ince bir kollajen düzeneği ile kaplanmış hepatositler, farklılaşmış morfolojilerini, %90'dan daha büyük bir canlılığı ve 14 gün boyunca polarizasyonlarını korurlar. Hücre canlılığı morfolojisi ve polarizasyonuna ek olarak, kollajen katman katman tekniği ayrıca burada belirtildiği gibi birincil hepatositlerin işlevini geri kazanır ve stabilize eder, Bu videoyu izledikten sonra, net pozitif ve negatif yüklü kollajen çözeltileri oluşturmak için kollajenin nasıl metilleneceğini ve süksinleneceğini iyi anlamalısınız ve bunları mikroakışkan cihazlarda hücrelerin üzerinde ince kollajen düzenekleri oluşturmak için katman katman biriktirmede nasıl kullanacağınızı.