Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Bu prosedürün genel amacı, bir mikroakışkan cihazdaki hücrelerin üzerine ince bir kolajen tabakası yerleştirmektir. Bu işlem, öncelikle asitlendirilmiş doğal kolajenin metilasyon yoluyla modifiye edilerek net pozitif yüklü kolajen moleküllerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, asitlendirilmiş doğal kolajenin modifiye edilerek net negatif yüklü kolajen moleküllerinin oluşturulmasıdır.

Ardından, mikroakışkan cihazlar hazırlanır ve hepatositler ekilir; hücrelerin gece boyunca yapışması ve yayılmasına izin verilir. Son adım, hücre tabakasının üzerine 10 kollajen çift tabakası oluşturmak için hücreleri pozitif ve negatif yüklü kollajen çözeltilerine sırayla maruz bırakarak kollajen düzenlemesini biriktirmektir. Nihayetinde, hücre polaritesinin ve salgılayıcı fonksiyonun gelişimi ile korunmasını göstermek için faz kontrast ve immünofloresan mikroskopi ile albümin ve üre analizleri kullanılır.

Bu tekniğin temel avantajları, 20 yılı aşkın süredir plaka kültürlerinde uygulanan tekniklere benzer yöntemler kullanarak mikro cihazlarda hepatosit kültürüne olanak sağlamasıdır. Karmaşık cihaz tasarımları gerektirmez ve çöktürülen matris 100 nanometre mertebesinde oldukça incedir. Bu yönteme dair ilk fikri, klasik Capy hücre kültürü tekniklerini plakalardan mikroakışkan cihazlara nasıl aktarabileceğimiz üzerine beyin fırtınası yaparken geliştirdik.

Kolajen sandviç yöntemleri açık üstlü mikroskobik sistemlerde çalışır, ancak kullanılan hidrojeller sınırlı kanal yüksekliklerine sahip kapalı mikro cihazlarla uyumsuzdur. 100 miligramlık doğal asidifiye kolajen çözeltisini, buz gibi soğuk steril su ile 0,5 miligram/mililitre konsantrasyona seyreltin ve jelatinleşmeyi önlemek için çözeltiyi buz üzerinde bekletin. Ardından, kolajen çözeltisinin pH değerini birkaç damla 1 normal sodyum hidroksit ile 9 ile 10 arasına ayarlayın ve çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın.

Kolajen çöktükçe çözelti bulanıklaşmaya başlayacaktır; çökmüş kolajen çözeltisini 3000 ×g hızda 25 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, tüplerin dibinde berrak, jel benzeri bir çökelek görülmelidir; süpernatantı aspire edin ve ardından çökmüş kolajeni 0,1 N hidroklorik asit içeren 200 mL metanol içinde yeniden süspande edin; oda sıcaklığında karıştırarak dört gün boyunca metilasyon reaksiyonunun gerçekleşmesini sağlayın; metilasyondan sonra, metillenmiş kolajeni peletlemek için çözeltiyi 3000 ×g hızda 25 dakika santrifüj edin, ardından asitlendirilmiş metanol süpernatantını aspire ederek imha edin. Son olarak, metillenmiş kolajeni 25 mL steril PBS içinde çözün ve çözeltiyi 60 µm hücre süzgecinden filtreleyin.

Çözeltinin pH değerini, 1 N sodyum hidroksitin 20 µL'lik artışlar şeklinde ekleyerek 7,3 ile 7,4 arasına ayarlayın. Kolajen çözeltisinin konsantrasyonunu, ticari bir sıçan kolajen ELISA kiti veya hidroksiprolin analiz kiti kullanarak belirleyin. Ardından çözeltiyi, steril PBS ile 3 mg/mL olacak şekilde seyreltin.

Metillenmiş kolajen çözeltisini, vidalı kapaklı bir cam şişeye aktararak sterilize edin. Şişenin dibine üç mililitre kloroformu dikkatlice katman şeklinde ekleyin ve şişenin dört santigrat derecede gece boyunca bekletilmesine izin verin. Ertesi sabah.

Üstteki metillenmiş kollajen tabakasını aseptik olarak çıkarın. Metillenmiş kollajeni dört santigrat derecede saklayın ve bir ay içinde kullanın. Başka bir 100 miligram natif asitlendirilmiş kollajen çözeltisini, buz gibi soğuk, steril su ile 0,5 miligram/mililitre konsantrasyona seyreltin ve daha önce gösterildiği gibi denatürasyonu önlemek için çözeltiyi buz üzerinde tutun; kollajen çözeltisinin pH'ını sodyum hidroksit ile ayarlayın ve kollajeni çöktürmek için çözeltiyi oda sıcaklığında karıştırın.

Ardından, 40 miligram siyanik anhidriti 10 mililitre aseton içerisinde çözün. Karıştırırken ve çözeltinin pH değerini sürekli izlerken, bu karışımı kolajen çözeltisine 0,5 mililitrelik artışlarla yavaşça ekleyin. pH değeri 9,0'a yaklaştığında bir veya iki damla bir normal sodyum hidroksit ekleyerek pH'ı 9,0'ın üzerinde tutun ve oda sıcaklığında 120 dakika boyunca sürekli karıştırın.

Altı adet siyanik ve hidrit çözeltisinin tamamı eklendikten sonra, süksinat kolajen çözündükçe karışımın berraklaştığını gözlemleyin ve pH değerinin 9,0'ın üzerinde kaldığından emin olmak için periyodik olarak kontrol etmeye devam edin. Süksinat kolajenin tamamı çözündüğünde, bir normal hidroklorik asidin 20 µL'lik artışlarını kullanarak çözeltinin pH değerini 4,0'a ayarlayın. Süksinat kolajen çöktükçe çözeltinin tekrar bulanıklaştığını gözlemleyin.

Ardından, çözeltiyi 3000 ×g'de 25 dakika boyunca santrifüjleyin. Süksinat kolajenini çöktürmek ve reaktif olmayan süksinik anhidrit içeren asitlendirilmiş süpernatantı uzaklaştırmak için, süksinat kolajenini 25 mL steril PBS içerisinde tekrarlanan pipetleme yöntemiyle çözerek yaklaşık 3 mg/mL nihai konsantrasyon elde edin. Daha sonra çözeltiyi 60 µm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve ardından çözeltinin pH değerini 7,3 ile 7,4 arasına ayarlayın.

Sodyum hidroksitin normal çözeltisini 20 µL'lik artışlarla kullanarak, ticari bir rat kolajen ELISA kiti veya hidroksiprolin analiz kiti yardımıyla çözeltinin konsantrasyonunu belirleyin. Ardından çözeltiyi 3 mg/mL olacak şekilde seyreltin. Bu asetik kolajen çözeltisini, metillendirilmiş kolajen çözeltisinde olduğu gibi steril PBS kullanarak sterilize edin.

Hücre büyümesi için 100 mikron yüksekliğinde, 0,4 ila 1,5 milimetre genişliğinde ve bir ila 10 milimetre uzunluğunda kanallara sahip hücre kültürü odacıkları içeren mikroakışkan bir cihazı standart teknikle imal ederek başlayın. Cihazın yüzeylerini ve bir lamı oksitlemek için plazma temizleyici kullanın. Ardından, bir bağ oluşturmak için ikisini birbirine bastırın.

Cihaz, en az 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılarak sterilize edildikten sonra, hazne steril PBS içindeki 15 µg/mL fibronectin ile doldurulur ve 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edilir. Ardından, cihaz beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde hücrelerle doldurulur.

Laminar akışlı bir doku kültürü kabininde, her cihaz için her bir solüsyonla 10 uygulama yapacak kadar yeterli hacimde metillenmiş ve asetillenmiş kolajen solüsyonlarının yanı sıra birkaç ek mililitre besiyeri hazırlayın. Solüsyonları buz üzerinde tutun. Cihazları sırasıyla 20 µL metillenmiş ve ardından asetillenmiş kolajen solüsyonları ile yıkayarak ardışık olarak temizleyin.

Her uygulamadan arasında bir dakika bekleyin. Cihazı her solüsyon için toplamda 10 kez yıkayın. Kollajen katmanları büyürken hücrelerin medyadan yoksun kaldığı süreyi minimize etmek için hızlı çalışın; kollajenin mikroakışkan cihazın giriş ve çıkışında yavaşça biriktiği gözlemlenebilir.

Sıvı akışına karşı direnç artarsa, cihazı bir veya iki kez medyayla yıkayın ve ardından katmanlandırma işlemine devam edin. Tüm katmanlar uygulandıktan sonra, cihazı iki kez taze medyayla durulayın ve inkübatöre geri yerleştirin. Metilasyon ve asetilasyon, kollajen moleküllerinin yük özelliklerini değiştirir.

Asetilasyon, pozitif yüklü grupları uzaklaştırıp yerlerine negatif yüklü gruplar yerleştirirken, metilasyon negatif yüklü grupları uzaklaştırarak net pozitif yüklü moleküller oluşturur; bu durum, iki kolajen varyantının hücreler gibi yüklü yüzeylerin üzerine katman katman birikmesine olanak tanır. Bir mikroakışkan cihaz içindeki fibronektin kaplı cam üzerine ekilen primer hepatositler, bu yöntemle katman katman kaplanabilir. Kolajen matris montajında, hücreler üzerine 10 çift katmanın biriktirilmesi yaklaşık 140 nanometre kalınlığında bir kolajen tabakası oluşturur; üst kolajen katmanı olmayan hepatositler katman katman uygulanmamıştır.

Matriksler, zamanla farklılaşmış fenotiplerini kaybeder, büzülür ve mikroakışkan cihazların yüzeyinden ayrılırlar. Buna karşılık, ultra ince bir kolajen düzeneği ile kaplanmış hepatositler, 14 gün boyunca farklılaşmış morfolojilerini, %90'ın üzerinde bir canlılığı ve polarizasyonlarını korurlar. Kolajen katman katman tekniği, hücre canlılığı, morfoloji ve polarizasyonun yanı sıra, burada belirtildiği üzere primer hepatositlerin fonksiyonlarını da geri kazandırır ve stabilize eder. Bu videoyu izledikten sonra, net pozitif ve negatif yüklü kolajen çözeltileri oluşturmak için kolajenin nasıl metilendiği ve süksinatlandığı ile mikroakışkan cihazlardaki hücrelerin üzerinde ince kolajen düzenekleri oluşturmak için bunların katman katman biriktirme işleminde nasıl kullanılacağı hakkında kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız.