Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi İn Vitro Deneysel Model

Bu prosedürün genel amacı, mikro elektrot dizilerine bağlı in vitro üç boyutlu nöronal ağların yeni bir modelini sunmaktır. Bu, ilk önce şartlandırma, MEA'nın orta kısmının karışık bir poli de lizin ve laminin çözeltisi ile gerçekleştirilmesi ve ardından mikro boncukların yapışma proteinleri, laminin ve polilisin ile kaplanması ile gerçekleştirilir. İkinci adım, muamele edilmiş mikro boncukların süspansiyonunu, kendi kendine birleşecekleri ve düzgün bir tabaka oluşturacakları çok kuyulu bir plaka üzerine dağıtmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, 2D nöronal ağlar oluşturmak için hücreleri milimetre kare başına 2000 hücre yoğunluğunda MEA'nın aktif alanına plakalamaktır. Kaplamadan altı ila sekiz saat sonra, süspansiyon çok kuyulu plakalardan MEA'ya aktarılır ve mikro boncukların altıgen kompakt bir yapıda kendi kendine monte edilmesine izin verilir. Sonuç olarak, konfokal mikroskopi, MEA üzerinde yetiştirilen geleneksel 2B nöronal ağlarla karşılaştırılan 3B ağları görselleştirmek için kullanılır.

Bu tekniğin, in vitro BDI boyutlu hücre kültürleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bir BDI boyutsal modelinde, somata ve büyüme konilerinin düzleşmesi, Andon ve yükselmenin her yöne yayılamamasıdır. Ek olarak, patlama aktivitesi BDI boyutlu ağların elektrofizyolojik dinamiklerine hakim olurken, üç boyutlu olanda da rastgele bir beneklenme aktivitesi bir arada bulunur. Bu yöntem hakkında ilk olarak, Sophie Potto'nun 2008 yılında Nature Method'da yayınlanan ve üç boyutlu ağ oluşturmak için MICROBITS'i bir iskele olarak kullandığı araştırma makalesini okuduğumuzda aklımıza geldi.

Daha sonra bu yöntemi bana uyarladık ve ilk üç boyutlu in vitro kayıtları yaptık. PDMS elastomerini hazırlamak için, kürleme maddesini ve bir polimeri bir Petri kabında bir ila dokuz hacim oranında karıştırın. Daha sonra karışımı çalkalayın ve hava kabarcıklarını gidermek için 10 dakika vakum odasına koyun.

PDMS kısıtlamasını oluşturmak için, PDMS malzemesini daha eski kalıpçıya yerleştirin, ardından 120 santigrat derecede 30 dakika fırına koyun. PDMS kısıtlaması, sırasıyla 22.0 ve 3.0 milimetre dış ve iç çapa ve kaplamadan bir gün önce 650 mikrometre yüksekliğe sahip bir silindir şeklinde olmalıdır. Maskeyi stereo mikroskop altında MEA'nın aktif alanına bağlayın, ardından PDMS maskesini fırında 120 santigrat derecede sterilize edin.

Daha sonra, cam mikro boncukları iki saat boyunca% 70 Etanol içeren konik bir şişede sterilize edin, daha sonra tüm mikro boncukları ortaya çıkarmak için her 30 dakikada bir döndürülün. Etanol çözeltisini şişeden çıkarın ve mikro boncukları iki kez sterilize su ile durulayın. Daha sonra, PDMS maskesi ile sınırlandırılan MEA alanının orta kısmını, mililitre başına 0.05 mikrogramda 24 mikrolitre karışık polilisin ve laminin çözeltisi ile koşullandırın.

Mikro boncukları yapışma proteinleri, laminat ve polilisin ile mililitre başına 0.05 mikrogram ile kaplayın. Daha sonra, stabil ve uzun süreli bir nöronal ağ elde etmek için gece boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, muamele edilmiş mikro boncukların süspansiyonunu, kendi kendine bir araya gelecekleri ve düzgün bir tabaka oluşturacakları bir membran eki ile çok kuyulu plaka üzerine dağıtın.

Daha sonra zarın her bir kuyusunu 0,5 mililitre orta ile doldurun. Bu adımda nöronlar kaplanmaya hazır olana kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit sıcaklıkta inkübatöre koyun. Bir E 18 hamile dişi sıçanı kurban ettikten sonra, sıçan embriyolarını elde edin, ardından su aygırı kampını her sıçan embriyosundan çıkarın.

Onları buz gibi Hanks'e yerleştirin. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen tuz çözeltisini dengeleyin. Daha sonra, dokuyu 37 santigrat derecede 18 ila 20 dakika boyunca DNA'ların% 0.05'ini içeren tryin Hanks çözeltisinin% 0.125'inde ayırın.

Bundan sonra, süpernatanı bir peor pipeti ile çıkarın. Beş dakika boyunca% 10 FBS içeren ortam ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Daha sonra ortamı FBS ile çıkarın ve büyüme ortamı ile bir kez yıkayın, takviyesi% 1 L-glutamin ve Gentamisin mililitre başına 10 mikrogramda.

Daha sonra, ortamı çıkarın. 500 mikrolitre büyüme ile tekrar doldurun. Orta. Mililitre başına 10 mikrogramda %1 L-glutamin ve Gentamisin takviyesi.

Doku peletini, sütlü bir hücre süspansiyonu görünene kadar dar bir PE pipeti ile mekanik olarak ayırın. Bundan sonra, 2.0 mililitrelik bir nihai hacim elde etmek için küçük bir hacim hücre süspansiyonunu büyüme ortamı ile seyreltin. Hemo sitometre odası ile elde edilen hücresel konsantrasyonu sayın.

Daha sonra, mikrolitre başına 600 ila 700 hücre arasında istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek için bu konsantrasyonu bir ila beş oranında seyreltin. Hücreleri, milimetre kare başına 2000 hücre yoğunluğunda, bir 2D nöronal ağ oluşturmak için PDMS kısıtlaması tarafından tanımlanan MEA'nın aktif alanına yerleştirin. Ardından, MEA cihazını 37 santigrat derecede% 5 nemlendirilmiş karbondioksit atmosferi ile inkübatöre yerleştirin.

3D kültürün inşası için ön adımı tamamlamak için, mikrolitre başına 600 ila 700 hücre konsantrasyonuna sahip 160 mikrolitre süspansiyonu, çok kuyulu plakaların içine yerleştirilmiş mikro boncuk tek tabakasının yüzeyine dağıtın. Daha sonra, çok kuyulu plakaları, 37 santigrat derecede% 5 nemlendirilmiş karbondioksit atmosferine sahip inkübatöre yerleştirin, kaplamadan altı ila sekiz saat sonra, 30 ila 40 mikrolitre süspansiyonu mikro boncuklar ve nöronlarla birlikte MEA alanına aktarın. Her aktarımdan sonra, mikro boncukların altıgen bir yapıda kendi kendine bir araya gelmesine izin vermek için yaklaşık yarım dakika bekleyin.

Tüm katmanlar biriktirildikten ve PDMS kısıtlaması ile sınırlandırılmış alanın üstünde 300 mikrolitre ortamda kendiliğinden birleştirildikten sonra. MEA'ya bağlı 3D yapıyı inkübatörde 37 santigrat derece ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksitte koyun. Bundan sonra, in vitro olarak üç hafta sonra takviyesi ile bir mililitre büyüme ortamı ekleyin, 3D yapı, gösterilen PDMS kısıtlaması olmadan da stabildir.

İşte MEA yüzeyine bağlı tek bir boncuk tabakasının DIC görüntüsü. Siyah noktaların konumu, elektrotların uzamsal düzenini temsil eder. Kırmızı sinyal tarafından yansıtılan harita iki için immünofloresan boyama, MEA'nın elektrot düzlemine doğrudan bağlı mikroboncuklar etrafındaki nöronların dendritik arborizasyonunun ve ADA'sının dağılımını gösterir.

Bu görüntü, nöronların olgun post mitotik nöronlarda ifade edilen yeni N için etiketlendiği yüksek derecede birbirine bağlı bir ağı gösteren bir 3B kültürün bir Zack dizisinin maksimum projeksiyonunu göstermektedir. Ve gaba için, işte hipokampal ağların 3D konfigürasyonda temsili elektrofizyolojik kaydı. Ve bu da hipokampal ağların 2 boyutlu konfigürasyonda temsili elektrofizyolojik kaydı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür yedi saat içinde yapılabilir. Bununla birlikte, prosedürün farklı günlerde gerçekleştirilen birkaç adımı olduğundan, tüm prosedürü gerçekleştirmek için zaman tahmininin sadece bir gösterge olduğunu fark etmek önemlidir. Bu prosedürü denerken, önce mea'nın elektroduna 2 boyutlu bir nöron diüretik tabakası kaplamayı hatırlamak ve daha sonra 3D yapıyı gerçekleştirmek için mikrobitlerin ve nöronun süspansiyonunu çok kuyulu plakadan mea'ya çok dikkatli bir şekilde aktarmayı unutmamak önemlidir.

Bu teknik, hesaplamalı sinirbilim alanındaki araştırmacıların, ağ bağlantısının ortaya çıkan ağ dinamiklerini nasıl şekillendirebileceğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, mikro elektrot dizilerine bağlı in vitro üç boyutlu bir nöronal ağın nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.