Name: Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Öğrenin eklem kondrositlerini 3D biyomimetik hidrojellerde genişletme ve olgunlaştırma yöntemini. Bu teknik, kıkırdak onarımı için fizyolojik olarak uygun bir mikroortam sağlar ve hücre fenotipinin korunmasına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Stanford Ortopedik Cerrahi Bölümü'ne ve Stanford Coulter Translasyonel Tohum Hibesi'ne finansman için teşekkür eder. JHL, desteği için Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Bursu ve DARE Doktora Bursu'na teşekkür eder.

Tüm deneyler Stanford Üniversitesi İnsan deneklerin esaslara uygun olarak yapılır ve Kurumsal Değerlendirme Kurulu protokolü onaylandı. 1. Eklem Kondrosit İzolasyonu <ol><li> Total diz protezi sırasında atılan doku kıkırdak edinin ve daha önce 8 açıklandığı gibi teşrih. </li><li> Görme pürüzsüz yüzeyler için kıkırdak örneklerinin medial veya lateral femoral kondilleri seçin ve subkondral kemik etkilemeden 4-5 mm kıkırdak biyopsi kaldırmak için bir neşter ile kıkırdak yüzeyinde kesi yapmak. </li><li> Arıtılmış kollajenaz ile O / N tedavi ile doku enzimatik ayrışma ile hücre dışı matris kondrositler izole edin. 37 ° C &#39;de, kondrosit büyüme ortamı kollajenaz II (125 U / ml) ve kollajenaz IV (160 U / ml) 1: 1&#39;lik kullanın. </li><li> Ertesi gün, 70 ile ayrışmış hücreleri ihtiva eden sindirilir doku filtremm boyut Naylon örgü gözenek. 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de DMEM / F12 ve santrifüj 20 ml ile iki kez yıkayın. </li><li> % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM / F12 içinde yeniden süspansiye, 25 ug / ml askorbat, 2 mM L-glutamin, antimikrobik maddeler, aşağıdaki 1 x 10 6 hücre / 60 mm kültür çanağı yoğunluğunda izole kondrositler Plate (100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 0.25 ug / ml fungizon). Önceki biomimetic hidrojeller kapsülleme 37 ° C&#39;de plakaları tutun ve yüksek yoğunluklu bir tek tabaka olarak birincil kondrosit kültürleri korumak. </li></ol> 2. Biyomimetik Hidrojel Fabrikasyon Not: Bu yöntem sağlar poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA, MW 5.000 g / mol), DPBS kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ihtiva eden bir biomimetik hidrojel sentezi. Foto-başlatıcı eklenmesi fotoaktif çapraz bağlanmasını sağlar. Nihai hidrojel bileşimi% 7 tartmak içeriyort / hacim (a / h) PEGDA bölgesinin% 3 CS-MS w / v, ve ışık başlatan a / h% 0.05. <ol><li> Metakrilat grupları ile CS polimerin işlevselleştirilmesiyle CS-MA sentezlemek. <ol><li> MES 1,952 g deiyonize su, 200 ml NaCl 5,84 g (dihidroksi 2 O) eritilmesi ile 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic asit (MES) ve 0.5 M sodyum klorür (NaCl) tamponlu çözeltisi hazırlayın. Tamponlu çözelti içinde kondroitin sülfat, sodyum tuzu, 5 g çözündürülür. </li><li> (: EDC = 1: 2 NHS mol oranı) 0,532 g (4,62 mmol) N-hidroksisüksinimid (NHS) ve 1,771 g (9,24 mmol) 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -karbodiimid hidroklorür (EDC) ilave 5 dakika boyunca çözeltisi ve bir karıştırma. </li><li> Çözeltisine ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyon sıcaklığı (: 2: 1: EDC: AEMA = 1 NHS molar oranı) 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoetil metakrilat (AEMA) ekleyin. </li><li> Diyaliz tüpüne (12-14 kDa&#39;lık bir MWCO) kullanılarak, 4 gün boyunca iyonu giderilmiş suya karşı diyaliz (diH 2 O) karışımın saflaştınlır. </li><li> P Filtre0.22 um&#39;lik bir filtreden urified çözeltisi ve kurutucu ve vakum O / N çözeltisi içeren açık tüpleri. Tüm tüpleri ışıktan korunmasını sağlamak. Nem ve ışıktan korunan -20 ° C &#39;de erimiş polimeri saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Hücre Encapsulation <ol><li> (Hücre yüklü 3D hidrojeller yumrukluyor için) PCR film ve silindirik çubuklar Otoklav ve UV ışığı altında doku kültürü kaputu 0,2 um filtrelenmiş% 70 etanol dalma ısmarlama silindirik jel kalıp sterilize edin. </li><li> Hava kabarcıkları veya sızıntıları önlemek için boşluklar olmadan otoklavlanmış PCR film ile jel kalıbın dibine kapatılmalıdır. Steril 150 mm plaka muhafaza ediniz. </li><li> Önceki biomimetic hidrojel hücre kapsülleme günlük, kollajenaz II O / N tedavi ve kollajenaz IV çözümü ile yüksek yoğunluklu kondrosit tek tabaka ayrıştırmaları. Kollajenaz VI, her kondrosit büyüme medya için kollajenaz II için 125 U / ml ve 160 U / ml kullanın37 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp almak ve ilave,% 5 ağırlık / hacim (ağırlık / hacim), poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA, molekül ağırlığı = 5000 g / mol),% 3 w / v kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ve DPBS h ışık başlatan /% 0.05 w. Çözüm karıştırmak ve bir kenara tutmak için tüp Vortex. Işıktan tüp koruyun. </li><li> , 50 ml&#39;lik bir Falcon tüpü içine ayrışmış hücreleri toplamak 5 dakika boyunca 460 x g&#39;de santrifüj sayısı ve. Aspire tüm hücreler tüp ortam 15 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta hücreler yeniden askıya almak için, yukarıda karışık jel maddesi ekleyin. Hava kaçınarak oluşumunu kabarcıklar ise 30 kez iyice karıştırın. </li><li> Pipet 72 özel yapılmış silindirik jel kalıbına hücre hidrojel süspansiyonunun ya da tek başına hidrojel ul ve 5 dakika için 3 mW / m 2 UV ışığı (365 nm dalga boyu) maruz kalma ile jelleşme neden. Hiçbir hücre içeriği ile bazı hidrojel çözüm hazırlayın. Gelecekteki biyokimyasal ve mekanik test için negatif kontrol olarak bu yapıları kullanın. MeasuUV yoğunluğu metre ile UV ışığın yoğunluğuna yeniden. Yoğunluğunu ayarlamak için, UV ışık kaynağı ve jelleşme sırasında hidrojel iskele arasındaki mesafeyi değiştirin. NOT: hidrojel CS içerdiğinden, aselüler katkısı sadece hücresel GAG temsil hücre yüklü hidrojellerin biyokimyasal GAG içeriğinden çıkarılır. </li><li> Kapalı kolay kabuğu için filmi kesmek için bir neşter kullanın ve dikkatlice çıkarın. Silindirik çubuklar yardımıyla, polimerleşmemiş jel ve gevşek hücreler yıkayın steril DPBS 5 ml ile bir 6 yuvalı plaka içine jel üzerinden itin. </li><li> Kültür, her oyuğa kondrosit büyüme ortamı 1,5 ml içeren 24 gözlü levhalar içine, hücre yüklü hidrojeller. Kuyuya yıkanmış hidrojeller aktarmak için tek kullanımlık spatula kullanın. </li><li> Bir canlılık / Sitotoksisite kiti kullanılarak, canlı cansız boyama 24 saat sonrası kapsülleme hücre canlılığını değerlendirmek. Kültür taze kondrosit Gro değişen 3-6 hafta süreyle hücre yüklü hidrojeller ve boş hidrojeller2 günde analizler için hasat öncesi medya wth. </li></ol> 4. RNA Ekstraksiyon ve Gen İfadesi Analizleri <ol><li> Dikkatle medya aspire ve hücre-Ladin yanı sıra boş kontrolü hidrojeller steril PBS 1X koydu. </li><li> Steril bir spatula yardımı ile, temiz bir 1.5 mi Eppendorf tüpüne her hidrojel transferi ve her tüpe Tri-reaktif madde 250 ul ilave edin. RNA izole etmek için üreticinin talimatlarına uyun. </li><li> RNA izolasyonu ve miktar kullanımı her örnekten bunun 1 mcg ve sonra High Capacity cDNA Ters Transkripsiyon Kit kullanılarak cDNA içine ters transkripsiyonu gerçekleştirin. </li><li> Nicel PCR ilgi genlerin ifadesinin incelenmesi için TaqMan Gen İfade Diziler kullanın. GAPDH dahili gen ifadesi düzeylerini normale. </li><li> PCR, aşağıdaki koşullar için bir 10 ardından urasil DNA glikosilaz önceki amplikonları inaktive etmek için 50 ° C&#39;de 2 dakika inkübasyon yer alır60, 95 ° C&#39;de inkübasyon dakika Taq polimerazı aktive etmek için. Daha sonra 95 ° C de 15 sn meydana gelen PCR&#39;nin devre döngüsü gerçekleştirmek ve 60 ° C&#39;de 1 dak. </li></ol> 5. Biyokimyasal analizler <ol><li> Her hücre hidrojel yapıları için DNA ve aşağıdaki gibi sülfatlı glikozaminoglikan (sGAG) üretimini ölçmek. </li><li> Dikkatle medya aspire ve hücre-Ladin yanı sıra boş kontrolü hidrojeller steril PBS 1X koydu. Boş bir tüp tartılır ve kağıt mendil üzerinde kurutma sonra içine hidrojel koymak ve hidrojellerin ağırlığını veya ıslak ağırlığı kaydedin. </li><li> Enzimatik sindirimi için ayrı bir 1.5 mi Eppendorf tüp -20 ° C &#39;de, her bir hidrojel dondurun ve daha sonra (GAG) (DNA) Picogreen deneyi ve Dimetil-Metilen mavisi analizi çalıştırmak için sindirilmiş ürünün bir kısım kullanın. </li><li> Hidrojeller enzimatik sindirimi için papainase çözeltisi hazırlayın. <ol><li> İlk Sodyum fosfata 7.1 g dışarı tartarak PBE tamponu hazırlamake dibazik (Na 2 HPO 4) ve Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (EDTA-Na2) 1.6 g. , DH 2 O 500 ml çözülür pH 6,5&#39;e ayarlanır ve 0.22 mm&#39;lik bir filtreden filtre saflaştırılmış çözeltisi. </li><li> PBE tamponu, 20 ml L-sistein 0,035 g çözündürülür. Çözüm ve steril papain enzimi 100 ul Filtre. </li></ol></li><li> Hazır deneyleri gerçekleştirmek için zaman, -20 ° C ila tüpleri alıp dondurulmuş hidrojellere hazır papain çözüm 300 ul ekleyin. Bir havanda jel Crush ve motor tokmak ile iyice karıştırın. </li><li> Ek papain solüsyonu ile 500 ul hacim kazandırın. Kontrol jeller için aynı prosedürü uygulayın. 16 st 3,9, 60 ° C&#39;de inkübe edin. Sindirilmiş hidrojel ihtiva eden çözelti, dolayısıyla DNA ve GAG ​​ölçümü için kullanılabilir. Üreticinin pr aşağıdaki standart olarak Lambda faj DNA ile Picogreen analizi kullanılarak DNA içeriği ölçünotocol. </li><li> 1,9-dimetilmetilen mavisi (DMMB) standart 10 olarak köpekbalığı kondroitin sülfat ile boya bağlama testi kullanılarak sülfatlı-GAG içeriği ölçmek. İlgili ıslak ağırlık GAG miktarını bölerek GAG içeriği belirler. </li></ol> 6. Mekanik Test <ol><li> 10 N yük hücresi ile donatılmış bir Instron 5944 test sistemi kullanılarak serbest basınç testleri gerçekleştirin. <ol><li> In vitro kültür istenen gün sonra, hücre-hidrojel iskele ve aselüler kontrol hidrojeller sıkıştırma testi gerçekleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında PBS banyosu içinde örnekleri daldırın ve yükleme koşulları altında kıkırdak dokunun yaşadığı fizyolojik suşu itibaren 15,% 11,12 maksimum suşuna 1% streyn / sn bir hızda sıkıştırılması% 10-20 olduğu rapor edilmiştir 13,14. </li></ol></li><li> Üçüncü mertebeden polinom denklem kullanılarak gerilme eğrileri ve eğri uyum vs stres oluşturun. Compr belirleme% 15 suş değerlerinde eğri fit denklemden essive teğet modülü. </li></ol>

<ol><li>Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+study+of+collagen+types+I+and+II+and+procollagen+IIA+in+human+cartilage+repair+tissue+following+autologous+chondrocyte+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation.</a> Knee. 16, 398-404 (2009).</li>
<li>Smeriglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Potential+of+Juvenile+and+Adult+Human+Articular+Chondrocytes+for+Cartilage+Tissue+Formation+in+Three-Dimensional+Biomimetic+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li>
<li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Scientific reports. 3, 3553(2013).</li>
<li>Taipale, J., Keski-Oja, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+in+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factors in the extracellular matrix.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).</li>
<li>Varghese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+based+niches+for+chondrogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).</li>
<li>Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+stiffness+on+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+response+to+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta.</a> Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).</li>
<li>Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stromal+Cells+in+Combinatorial+Hydrogels+Containing+Cartilage+Matrix+Proteins+with+Decoupled+Mechanical+Stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li>
<li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+BMP-2+on+osteoarthritic+human+chondrocyte+metabolism+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro.</a> J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).</li>
<li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+in+agarose+culture+synthesize+a+mechanically+functional+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix.</a> J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).</li>
<li>Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitation+and+discrimination+of+sulphated+glycosaminoglycans+by+use+of+dimethylmethylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue.</a> Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).</li>
<li>Lai, J. H., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meniscus+and+cartilage+exhibit+distinct+intra-tissue+strain+distributions+under+unconfined+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+cartilage+%2F+OARS%2C+Osteoarthritis+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).</li>
<li>Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-rate+dependent+stiffness+of+articular+cartilage+in+unconfined+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression.</a> Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).</li>
<li>Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+measurement+of+articular+cartilage+deformations+in+the+intact+human+hip+joint+under+load%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+bone+and+joint+surgery.+American%22%5BJournal%5D)">In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load.</a> The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).</li>
<li>Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+stresses+in+the+human+hip+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Cartilage stresses in the human hip joint.</a> Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).</li>
<li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li>
<li>Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage%3A+tissue+design+and+chondrocyte-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Instructional+course+lectures%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions.</a> Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).</li>
<li>Wang, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+chondroitin+sulphate+for+cartilage+tissue-biomaterial+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration.</a> Nat Mater. 6, 385-392 (2007).</li>
<li>Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bonding+and+fusion+of+meniscus+fibrocartilage+using+a+novel+chondroitin+sulfate+bone+marrow+tissue+adhesive%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive.</a> Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokolde bildirildiği gibi, 3D hidrojeller genellikle tek tabakalı kültürler 15 ile karşılaştı fibrocartilage hücrelerine hücre dediferansiyasyon süreci kaçınarak, kültürde kondrosit fenotipi muhafaza edebiliyoruz. Ayrıca, hidrojel yapısının chondrocytes- uzun süreli kültürleri yaş ve hastalık ile ilişkili içsel hücre özelliklerini korumaktadır elverişli bir ortam ortaya koymuştur. 3B biomimetik hidrojel kullanılması birçok avantaj vardır. İlk olarak, kondroitin sülfat dahil (CS), eklem kıkırdağının içinde bulunan başlıca bir komponent, kondroitinaz salgılayarak hidrojel matrisi bozan ve ekstra hücresel matris 5, 16 yeni sentezlenmiş kıkırdak bırakmaya hücreleri sağlar. Buna ek olarak, CS gösterilmiştir artritik eklem anti-inflamatuar özelliklere sahip. Biomimetik hidrojel kıkırdak tamir hücre dağıtımı için bir iskele malzemesi olarak kullanılabilir, ve kimyasal olarak modifiye edilebilirDaha iyi doku biyomalzeme entegrasyon 17,18 kolaylaştırmak için. PEG-CS hidrojellerin kullanımı, uzun süreli kondrositlerin kültürleri ve biyokimyasal ve mekanik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak verir. İşte biz bu platformu kıkırdak mühendisliği için en uygun hücre tipini tanımlamak amacıyla farklılaştırılmış kondrosit çeşitli kaynaklardan karşılaştırmalı analizler için yararlı olabilir nasıl gösterir. İlginçtir, hidrojeller kapsüllü kondrositlere kendi içsel yeteneklerine göre canlı kalır ve çoğalır. Hidrojel bileşimi destekleri, aslında, sağlıklı genç ve erişkin kondrositlerin büyümesi Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi. Açıklanan hidrojel bileşimi ve yapısı da kıkırdak doku formasyonunu teşvik glikozaminoglikan ile değerlendirilen fonksiyonel hücre dışı matris birikimi (GAG ile gösterildiği gibi ) ölçümü. Buluşun bir başka avantajı, kondrosit hidrojel yapıları olanYeni oluşan kıkırdak dokusunun mekanik özellikleri için değerlendirilebilir. Serbest basınç testi karşılaştırma için aselüler hidrojel yapılmalıdır unutmayın. Hidrojeller, aslında, bağlı CS parçalarının sertliği için temel bir sertliğe sahiptir. (Bir gerilme oranı / s% 1 at)% 5-20 serbest basınç gerilme yükleme koşulları altında kıkırdak dokusu yaşadığı fizyolojik zorlanma beri kıkırdak dokusunun 11,12 mekanik testler için uygulanabilir 10-20 olduğu rapor edilmiştir % 13,14. Mekanik test hücre yüklü ve hücresel olmayan iki hidrojellerin tepkisi, kültür son nokta değerlendirilmiştir. Tarif edilen örnekte, OA kıkırdak ihtiva eden konstruktların düşük katılıkta aksine, yetişkin ve juvenil kondrositlerin ihtiva eden konstruktların benzer bir sertliğe gözlenen, yukarıda. Hücre-hidrojel yapısının bu tür mekanik özellikleri fonksiyonel özelliklerinin değerlendirilmesine olanakHücre olgunlaşma yeteneği derinlemesine analizini veren oluşturulan doku. Sonuç olarak, kıkırdak doku üretmek için farklı bir kondrosit nüfusun potansiyel çalışma 3D biomimetik hidrojellerin kullanımı yaygın olarak uygulanabilir. Burada tarif edilen in vitro çalışmaların yanısıra hücre-yüklü yapıları in vivo nakli fizyolojik bağlamda hücre olgunlaşmasını ve rejeneratif potansiyel çalışma tasavvur edilebilir. Ek biomimetik faktörlerle hidrojel platformun bundan başka değişiklikleri de, kondrosit çoğalmasını ve olgunlaşmasını optimize etmek için tasavvur edilebilir.

Sınırlı kendi kendini onarma potansiyeli ile insan eklem kıkırdağı sık sık geri dönüşü olmayan hasarlara uğrar. Şu anda eklem kıkırdağı yaralanmalarının tedavisi için verimli hücre bazlı yaklaşımların geliştirilmesine yönelik kapsamlı çabalar odaklanmaktadır. Bu hücre bazlı tedavilerin başarısı, büyük ölçüde optimal bir hücre kaynağının seçimine ve rejeneratif potansiyelinin korunmasına bağlıdır. Kondrositler, kıkırdak onarımı için yaygın bir hücre kaynağıdır, ancak tedarikleri sınırlıdır ve 2D tek katmanlı kültürde in vitro genişleme sırasında farklılaşabilirler, böylece hiyalin kıkırdak 1 oluşumunu sınırlarlar. 
Bu protokolün amacı, farklı yaş ve hastalık durumlarından insan kondrositlerinin in vitro karşılaştırmalı bir çalışması için 3 boyutlu bir hidrojel platformu oluşturmaktır. Geleneksel iki boyutlu (2D) kültürün aksine, üç boyutlu (3D) hidrojeller, kondrositlerin morfolojilerini ve fenotiplerini korumalarına izin verir ve kondrositlerin kıkırdak dokusu üretmesini sağlayan fizyolojik olarak ilgili bir ortam sağlar 2,3. Kondrosit kültürü için 3 boyutlu bir fiziksel yapı sağlamanın yanı sıra, hidrojeller doğal kıkırdak hücre dışı matrisin (ECM) işlevini taklit eder. Spesifik olarak, kondroitin sülfat metakrilatın dahil edilmesi, salgılanan parakrin faktörler 4 için potansiyel bir rezervuar sağlar ve hücre aracılı bozunma ve matris döngüsü 5 sağlar. Agaroz ve aljinat jeller dahil olmak üzere çeşitli çalışmalarda birçok 3D hidrojel kültür sistemi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kondrosit kültürü için bazı belirgin avantajları olan biyomimetik bir 3D kültür sistemi kullandık. Kondroitin sülfat (CS), eklem kıkırdağında bol miktarda bulunan bir bileşendir ve PEG-CS hidrojellerinin kondrojenik fenotipi koruduğu ve hatta arttırdığı ve hücre aracılı matris bozunmasını ve dönüşümünü kolaylaştırdığı gösterilmiştir 2,5. Ek olarak, hidrojel iskelenin mekanik özellikleri, PEG konsantrasyonunun değiştirilmesiyle kolayca modüle edilebilir ve bu nedenle kondrositlerin veya ilgili bir hücre tipinin 6,7 rejenerasyon potansiyelini daha da arttırmak için kullanılabilir. PEG / CSMA ayrıca biyouyumludur ve bu nedenle örneğin kıkırdak defektlerinde doğrudan bir klinik uygulama potansiyeline sahiptir. Bu sistemin sınırlaması, karmaşıklığı ve agaroz gibi daha basit sistemlere kıyasla hücre canlılığını potansiyel olarak etkileyebilecek fotopolimerizasyonun kullanılmasıdır, ancak kondrosit kültürünün avantajları potansiyel sınırlamalardan daha ağır basmaktadır.
3D hidrojel kültürü, hücre fenotipinin (gen ekspresyonu, protein immün boyama) ve fonksiyonel sonucun (kıkırdak matrisi üretiminin miktar tayini, mekanik test) değerlendirilmesi için geleneksel testle uyumludur. Bu elverişli 3D ortam, uzun süreli 3D kültürlerde üç farklı yaşlı popülasyondan insan kondrositlerinin doku rejenerasyon potansiyelini karşılaştırmak için test edildi. 
Sonuçlar hem fenotipik hem de fonksiyonel testlerle değerlendirildi. Juvenil, erişkin ve OA kondrositler, 3D biyomimetik hidrojel kültüründe farklı yanıtlar gösterdi. 3 ve 6 hafta sonra, kondrojenik gen ekspresyonu juvenil ve yetişkin kondrositlerde yukarı regüle edildi, ancak OA kondrositlerinde aşağı regüle edildi. Agrekan, tip II kollajen ve glikozaminoglikan (GAG) dahil olmak üzere kıkırdak dokusu bileşenlerinin birikimi juvenil ve yetişkin kondrositler için yüksekti, ancak OA kondrositleri için yüksek değildi. Ortaya çıkan kıkırdak yapılarının basınç modülleri de benzer eğilimler sergiledi. Sonuç olarak, hem juvenil hem de erişkin kondrositler, hidrojellerde 6 haftaya kadar 3D kültürde kondrojenik ve kıkırdak matriks eğilimi sergiledi. Buna karşılık, osteoartritik kondrositler, kıkırdak fenotip kaybı ve sağlam kıkırdak oluşturma konusunda minimal yetenek ortaya çıkardı.

<table><tbody><tr><td>juvenil kondrositler (Klontikler Normal İnsan Kondrosit Hücre Sistemi)</td> <td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>yetişkin kondrositler (Klontikler Normal İnsan Kondrosit Hücre Sistemi)</td> <td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>poli (etilen glikol diakrilat)</td> <td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>2-morfolinoetansülfonik asit</td><td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>foto başlatıcı</td><td>Irgacure&nbsp;</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>kondroitin sülfat sodyum tuzu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroksisüksinimid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -karbodiimid hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoetil metakrilat</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>diyaliz tüpleri</td><td>Spectrum Laboratories &nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz 2</td><td>Worthington Biyokimyasal&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004177</tr><tr><td>Kollajenaz 4</td><td>Worthington Biyokimyasal&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004189</tr><tr><td>DMEM/F12 ortamı</td><td>HyClone, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH3002301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>canlı/ölü tahlil</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri reaktif</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-dimetilmetilmetilen mavisi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV ışık ekipmanları - XX-15LW Tezgah Lambası, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Instron 5944 test sistemi&nbsp;</td><td>Instron Şirketi</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

eklem kondrosit kültür ve kıkırdak Üretimi için 3d hidrojel iskeleleri

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

İnsan eklem kıkırdağı hasara karşı oldukça hassastır ve sınırlı kendi kendini onarma ve yenilenme potansiyeline sahiptir. Kıkırdak dokusunu tasarlamak için hücre bazlı stratejiler, eklem kıkırdağını onarmak için umut verici bir çözüm sunar. Doku onarımı için en uygun hücre kaynağını seçmek için, doku mühendisliği kıkırdağında farklı hücre kaynakları tarafından yapılan biyolojik ve biyomekanik farklılıkları sistematik olarak incelemek için uygun bir kültür platformu geliştirmek önemlidir. Burada juvenil, yetişkin ve osteoartritik (OA) kondrositlerin kıkırdak rejenerasyon potansiyelini sistematik olarak incelemek için üç boyutlu (3D) bir biyomimetik hidrojel kültür platformu uyguladık. 3D biyomimetik hidrojel, kondrositlerin in vitro kültürü için fizyolojik olarak ilgili bir mikro ortam sağlayan sentetik bileşenli poli (etilen glikol) ve biyoaktif bileşenli kondroitin sülfattan oluşuyordu. Ek olarak, iskele potansiyel olarak in vivo kıkırdak onarımı için hücre iletimi için kullanılabilir. İskelede tasarlanan kıkırdak dokusu, kantitatif gen ekspresyonu, immünofloresan boyama, biyokimyasal testler ve mekanik testler kullanılarak değerlendirilebilir. Bu sonuçları kullanarak, hem gen ekspresyonu düzeyinde hem de tasarlanmış kıkırdak dokusunun biyokimyasal ve biyomekanik özelliklerinde, değişen yaşlardaki kondrositlerin diferansiyel rejeneratif potansiyelini karakterize edebildik. 3D kültür modeli, normal veya anormal gelişimin farklı aşamalarından kondrositler ve progenitör hücreler arasındaki moleküler ve fonksiyonel farklılıkları araştırmak için uygulanabilir.

PEG ve CS kısımları (Şekil 1) içeren biyoaktif hidrojeller insan mafsal kondrositleri 2,3,5,7 kültür ve olgunlaşması için ideal bir platform oluşturmaktadır. Farklı yaşlarda ve hastalık durumlarından Kondrositler tarif edilen yöntem ile kültürlendi ve fenotipi, gen ekspresyonu ve oluşturulan kıkırdak dokusunun biyokimyasal ve mekanik özellikleri için analiz edilebilir. Üç kondrosit örnekleri juvenile- 6 ay, bireylerde erişkin 34 yaş ve osteoarthritic- 74 yaşında, 3D biomimetik hidrojeller kültür 3 hafta sonra hasat edilmiştir. Gen ekspresyonu, normal kondrosit, çocuk ve yetişkin hem analizleri kondrosit genleri Col2a1 ve Col6a1 ekspresyonunda bir artış göstermiştir. Col6a1 (Şekil 2) ekspresyonunu sürdürmek uygun bir biomimetik ortamda kültürlenen olmasına rağmen kondrojenik fenotipinin kaybı gösterirken Aksine, hastalıklı kondrositler Col2a1 dramatik bir azalma olduğunu gösterdi. CS-PEG hidrojeller de kondrositler çoğalmaya için dinamik bir ortam olarak hizmet PEG ve CS önceden var olan matris sindirimi ve hücre etrafındaki ve hücre dışı matris olgun kıkırdak dokusunun başlıca bileşenleri bırakır. In vitro kültür 3 hafta sonra, kondrosit genişlemesi, bu özellikler göz önüne alındığında Picogreen boyası ile DNA miktarının ölçülmesi ile tahmin edilebilir. Hücreler üç grup karşılaştırmalı analizi OA kondrositler kültür 1 gün ile karşılaştırıldığında dramatik bir düşüş sergiledi ise çocuk ve yetişkin nüfusun hücre yoğunluğu değişmeden olduğunu göstermektedir. DNA içeriğinin kaybı aynı zamanda uzun dönemli kültür (Şekil 3) sırasında mümkün hücre ölümünü destek veren kondrositler OA için değil gözlenmiştir. Salgılanmış matris kültürlerin 3 hafta sonra bitiş noktası aşamasında DMMB boya bağlama deneyi ile sülfatlanmış-GAG içeriği olarak belirlendi. GAG içeriği recor olarak hidrojel yaş ağırlık normalize edilmektedirded enzimatik sindirim ve aselüler katkı önce çıkarılır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, kondrositler 3D hidrojeller kültür 3 hafta boyunca GAG benzer bir önemli miktarda biriken. Fiziksel iskele varlığı serbest basınç deneyleri 2,3 ile numunelerin biyomekanik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak verir. Hücresel olmayan hidrojeller basınç modüllerden bir azalma olur ise, hücreye yüklü yapılar Kültürde 3 hafta (Şekil 4) daha sonra sıkıştırma modülünü muhafaza. Fenotipik, burada açıklanan biyokimyasal ve biyomekanik analizler değerlendirilmesi ve mühendislik kıkırdak için farklı kondrosit popülasyonlarının potansiyelini anlamak için, bu nedenle yararlıdır. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> 3D kondrosit cul 1. PEG-CS biomimetic hidrojeller ŞekilTure. Kondrositler poli (etilen glikol diakrilat) (PEGDA) ve kondroitin sülfat-metakrilat (CS-MA) ve ısmarlama silindirik jel kalıbına dökülmüş ihtiva eden bir karışım içinde tekrar süspanse edilir. UV ışınlarına maruz sonra, jeller kalıplardan toplanır ve hücre canlılığı, canlı cansız boyanma 24 saat sonrası kapsülleme değerlendirilir katılaştı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Şekil 3D biomimetik hidrojeller kültürlenmiş insan kondrositlerde kondrojenik genlerin 2. ifadesi. 3B biomimetik hidrojeller kültür 3 hafta sonra genç, yetişkin ve OA kondrositler tarafından kıkırdak belirteçleri Col2a1 ve Col6a1 nicel gen ekspresyonu. Değerler gün 1. Hata b gen ifade düzeyine normalize edilmişars ortalama ± SD temsil etmektedir. p *, &lt;iki kuyruklu Student t testi ile tespit edildiği üzere 0.05. Smeriglio ark modifiye. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> 3D biomimetic Hidrojellerde kültürlü insan kondrositlerde Şekil 3. DNA içeriği. 3D biomimetic hidrojellerin kültür 3 hafta sonra çocuk, yetişkin ve OA kondrositlerinde Picogreen testi ile DNA miktar tayini. Değerler gün 1&#39;de DNA düzeyinde normalize <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">edilir, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; Şekil 4. GAG içerik ölçümü ve 1. günde ve 3D biomimetic hidrojeller kültür 3 hafta sonra insan kondrosit serbest basınç testi. 1. günde kondrositlerde ve kültür 3 hafta sonra DMMB deneyi ile (A) GAG miktar 3D biomimetic hidrojeller. Değerler ağırlığı (ww) ıslak normalize ve ug / g olarak ifade edilmiştir. 1. günde ve 3D biomimetic hidrojeller kültür 3 hafta sonra asellüler ve hücre yüklü hidrojellerin (B) Basınç modülü (kPa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.</a>

Kıkırdak onarımı, karşılanmamış bir tıbbi zorluğu temsil eder ve insan eklem kıkırdağını tasarlamak için hücre temelli yaklaşımlar umut verici bir çözümdür. Burada, insan eklem kondrositlerinin genişlemesi ve olgunlaşması için ideal bir araç olarak üç boyutlu (3D) biyomimetik hidrojelleri tanımlıyoruz.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Bu prosedürün genel amacı, eklem kondrositlerini genişletmek ve insan eklem kıkırdağı üretmek için 3B biyomimetik bir hidrojel kültürü gerçekleştirmektir. Bu işlem; öncelikle total diz artroplastisinden elde edilen femoral kondillerin diseke edilmesi, subkondral kemikten kıkırdak dokusunun çıkarılması ve kondrositlerin enzimatik disosyasyon yoluyla hücre dışı matristen izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, biyomimetik bir hidrojel üretimi için kondroitin sülfat metakrilat polimerini sentezlemektir.Ardından, kondrositler 3D biyomimetik hidrojeller içine hapsedilir ve konstrüktler in vitro ortamda üç ila altı hafta boyunca kültüre edilir. Nihayetinde, hem biyokimyasal hem de mekanik testler kullanılarak eklem kondrositlerinin büyüdüğünü ve olgunlaştığını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Kondrositlerin kültüre edilmesi için 3D biyometrik hidrojel platformunun kullanılmasının temel avantajı, kıkırdağın doğal bileşenlerini içerdiği için fizyolojik olarak ilgili bir mikroortam sağlamasıdır.Kondrositlerin fizyolojilerini ve fenotiplerini daha uzun bir süre koruyabilmeleri bir avantajdır. Biyoaktif bir polimer olan kondroitin yüzeyinin üç boyutlu matris hidrojeline dahil edilmesi, kondrosit aracılı metriklerin ve degradasyon döngüsünün gerçekleşmesini sağlar. Ayrıca, hidrojel matrisinin mekanik ve biyokimyasal özellikleri kolayca modifiye edilebilir.Bu teknik, hücre fenotipini ve fonksiyonel sonucu değerlendirmek için kullanılan geleneksel analizlerle uyumludur. Antik hastalık evresiyle ilişkili kondrosit intrinsik özelliklerini incelemek ve fizyolojik bir bağlamda hücre olgunlaşmasını ve rejeneratif potansiyeli değerlendirmek için kullanılabilir. Başlamak için, total diz artroplastisi sırasında genellikle atılan taze kıkırdak dokusunu kullanarak; bir birim 125 units per milliliter collagenase two ile bir birim 160 units per milliliter collagenase four'ü choy büyüme ortamında birleştirerek disosyasyon ortamı hazırlayın.Steril bir bistüri alarak femoral kondillerden birinin düz yüzeyinden biyopsi yapın. Ardından biyopsiyi ince dilimler halinde tıraşlayın. Kıkırdak dilimlerini, hacimce bir üç oranında birleşik disosiyasyon ortamına ekleyin ve kondrositlerin ertesi gün ekstrasellüler matriksten salınması için kabı 37 °C'de gece boyunca bekletin.Disosiye hücreleri içeren sindirilmiş dokuyu 70 mikron gözenek boyutundaki bir naylon süzgeçten filtreleyin. Ardından hücreleri, önceden ısıtılmış 20 mililitre D-M-E-M-F 12 besiyeri ile iki kez yıkayın ve hücreleri 600 G'de beş dakika boyunca pelletleyin. Son olarak, izole edilen kondrositleri bir he sitometre plakasında sayın.1 milyon hücreyi 60 milimetrelik bir kültür kabına ekleyin ve tamamlayıcı eklenmiş D-M-E-M-F 12 medyumu ile kaplayın. Standart kültür tekniklerini izleyerek primer kondrosit kültürlerini yüksek yoğunluklu bir monokatman olarak sürdürün. 200 mililitre deiyonize suya 1,952 gram 2-metakriloiloksietil sülfonik asit ve 5,84 gram sodyum klorür ekleyerek kondroitin sülfat metakrilat sentezleyin ve çözelti tamamen çözünene kadar karıştırın.Ardından, beş gram kondroitin sülfat sodyum tuzunu tamponlu çözeltide çözün. Daha sonra çözeltiye 0,532 gram N-hidroksi CIN amit ve 1,771 gram bir etil üç üç dimetil amino propil karbo id hidroklorür ekleyip beş dakika boyunca karıştırın. Çözünme tamamlandığında, çözeltiye 0,765 gram iki amino etil metakrilat ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında, alüminyum folyo ile örtülmüş şekilde 24 saat boyunca sürdürün.Final karışımı, 12 ile 14 kilodalton moleküler ağırlık kesme sınırlı diyaliz tüpleri kullanarak dört gün boyunca deiyonize suya karşı diyaliz ederek saflaştırın. Ardından saflaştırılmış çözeltiyi 0,22 mikronluk bir filtreden süzün ve eksi 20 derece Celsius'ta dondurun. Çözeltiyi içeren açık tüpleri bir desikatöre yerleştirin.Alüminyum folyo ile örterek ışıktan koruyun ve gece boyunca vakum uygulayın. Çözünmüş polimeri, hücre enkapsülasyonundan bir gün önce, ışık ve nemden korumak için parafilm ve folyo ile sarılı halde Falcon tüplerinde -20 °C'de saklayın. Kültürlenmiş hücrelerin ortamını uzaklaştırın ve hücreleri disosyasyon ortamı ile kaplayın.Hücreleri kolajenaz solüsyonunda 37 °C'de gece boyunca inkübe edin; otoklav PCR filmi ve silindirik çubukları hazırlayın ve ardından özel yapım silindirik jel kalıbını, bir doku kültürü davlumbazı altında UV ışığı altında gece boyunca 0,2 micron filtrelenmiş %70 etanol içinde bekleterek sterilize edin. Ertesi gün, kalıpları etanolden çıkarın ve doku kültürü davlumbazı içinde kurumaya bırakın. Ardından kalıbı steril bir 150 millimeter plak içine yerleştirin. Kuruduktan sonra, kalıpların alt kısmını otoklav PCR filmi kullanarak mühürleyin.Sızıntıları önlemek için hava kabarcığı veya boşluk kalmadığından emin olun. Ardından, 50 mililitrelik bir tüp alın ve hazırlanan kondroitin sülfat metakrilatın %10'unu, polietilen glikol diakrilatın %10'unu ve ağırlıkça hacimce %5'lik foto başlatıcıyı, sırasıyla %3, %5 ve %0,05 nihai konsantrasyonlara ulaşacak şekilde DPBS içerisine ekleyin.Tüpü ışıktan koruyun ve karışımı kısa süreliğine vorteksleyin. Ayrıştırılmış hücreleri 50 mililitrelik bir falcon tüpüne toplayın ve ardından bir hemositometre kullanarak onları sayın. Hücreleri 460 ×g'de beş dakika boyunca pelletleyin ve mililitre başına 15 milyon hücre yoğunluğunda karışık jel materyali içinde yeniden süspande edin.Kabarcık oluşumunu önlemeye dikkat ederek çözeltiyi 30 kez karıştırın. Ardından, özel yapım silindirik jel kalıbına 72 µL hücreli hidrojel süspansiyonu veya yalnızca hidrojeli pipetleyin. Jelleri, metrekare başına üç miliwatt gücünde 365 nm UV ışığına beş dakika boyunca maruz bırakarak jelleşmeyi sağlayın.Jelleşme tamamlandığında, filmi kesmek için bir skalpel kullanın ve filmi dikkatlice çıkarın. Silindirik çubukların yardımıyla jeli, kalan polimerize olmamış jeli ve serbest hücreleri yıkamak için beş mililitre steril DPBS içeren altı kuyucuklu bir plakaya doğru itin. Ardından, yıkanmış hidrojelleri, her birinde 1,5 mililitre Chondra site büyüme medyumu bulunan 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın.Hidrojelleri 37 °C'de inkübe edin ve besiyerini her iki günde bir değiştirin. Enkapsülasyondan 24 saat sonra, standart teknikleri kullanarak canlı-ölü boyaması ile hücre canlılığını değerlendirin; hücre yüklü hidrojelleri ve boş hidrojelleri, hasat ve analiz öncesinde üç ila altı hafta boyunca kültüre edin. İstenen in vitro kültür gün sayısından sonra, hücreli hidrojel iskele ve aselüler kontrol hidrojelleri üzerinde sıkıştırma testini gerçekleştirmek için örnekleri inkübatörden çıkarın.Numuneleri oda sıcaklığında, 10 Newton'luk bir yük hücresiyle donatılmış mekanik test sistemine bağlı PBS banyosuna teker teker yerleştirin; saniyede %1 şekil değiştirme hızıyla %15 maksimum şekil değiştirmeye kadar sıkıştırın. Mekanik testleri analiz etmek için her numune için gerilme-şekil değiştirme eğrileri oluşturun ve eğri uydurma işlemi yapın. Üçüncü dereceden bir polinom denklem kullanlyarak, %15 şekil değiştirme değerlerindeki eğri uydurma denkleminden basma teğet modülünü belirleyin. Üç haftalık kültürden sonra, 3D biyomimetik hidrojellerde hem genç hem de yetişkin normal kondrositlerin gen ekspresyon analizi, kollagen two A one ve kollagen six A one kondrosit genlerinin ekspresyonunda bir artış göstermiştir. Buna karşılık, hastalıklı kondrositler, kollagen six A one ekspresyonunu korumalarına rağmen kollagen two A one'da dramatik bir azalma göstermiş ve uygun bir biyomimetik ortamda kültüre edilmelerine rağmen konjenik fenotip kaybı sergilemişlerdir.Üç haftalık kültürden sonra kondrosit genişlemesi, pico green boyası ile DNA kantifikasyonu yapılarak tahmin edilebilir. Üç hücre grubunun karşılaştırmalı analizi, genç ve yetişkin popülasyonların hücre yoğunluğunun değişmediğini, osteoartritli kondrositlerin ise kültürün birinci gününe kıyasla belirgin bir azalma sergilediğini göstermektedir. Salgılanan kondrosit matrisi, üç haftalık kültürden sonra sülfatlanmış GAG içeriği olarak kantifiye edilmiştir.Burada gösterildiği gibi, kondrositler üç haftalık kültür süresi boyunca önemli miktarda gag biriktirmiştir; bu durum, hücre yüklü hidrojellerin kontrol gruplarına kıyasla iyileşmiş mekanik özelliklerine katkıda bulunmuş olabilir. Bu prosedürün bireysel çalışmalar için uygulanmasının yanı sıra, 3B biyomimetik hidrojel kültür modeli, tam kalınlıkta kıkırdak defekt modeline kolayca uyarlanabilir ve uzun süreli eklem kıkırdağı rejenerasyonundaki fonksiyonel ve biyokimyasal sonuçlar karakterize edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, eklem diz örneklerinden insan kondrositlerinin nasıl izole edileceği ve uzun süreli kültür ile kıkırdak üretimi için üç boyutlu hidrojel iskelelerin nasıl hazırlanacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. 3B BME hidrojellerinin kullanımı, bizlerin ve diğer araştırmacıların farklı olgun kondrosit popülasyonlarının yanı sıra yeni kök hücre ve progenitör hücre popülasyonlarının kondrojenik potansiyellerini karşılaştırmalarına olanak sağlayacaktır.Gelecekte, kıkırdak rejenerasyonu ve onarımı için kullanılabilecek optimal bir iskele formüle etmek amacıyla, bu teknikler ek mimetik faktörleri içerecek şekilde genişletilebilir.

3d-hydrogel-scaffolds-for-articular-chondrocyte-culture-cartilage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Sinovyal sıvıda yüksek düzeyde insan eklem kondrosit kültür 3D sistemi açıklanmıştır. Sinovyal sıvı eklem kıkırdağı için en doğal mikroçevresinin yansıtır ve kolayca elde ve saklanabilir. Bu sistem, böylece kıkırdak rejenerasyon eğitim ve artrit tedavisi için tarama terapötikler için kullanılabilir.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Kondrositler tarafından kıkırdak ekstraselüler matriks biyosentezi mekanik uyaranlara uygulama etkilenebilir. Bu yöntem, 3D yapıları ve kondrosit metabolizması bağlı değişikliklerin değerlendirilmesi kapsüllü kondrositler dinamik basınç suşların uygulama tekniği anlatılmaktadır.

Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu

Bir bioprinter bir kurban kalıp dayalı desenli hidrojeller oluşturmak için kullanıldı. Poloksamer kalıp ikinci bir hidrojel ile dolduruldu ve daha sonra üçüncü bir hidrojel ile doldurulmuş boşluklar bırakarak elüt edilmiştir. Bu yöntem Biyopolimerlerin karmaşık mimarileri oluşturmak için hızlı sağım ve poloksamerin iyi baskı kullanır.

Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Bu yazıda anlatılan yöntemleri eşzamanlı UV polimerizasyon ile bir bioprinter içine ticari bir mürekkep püskürtmeli yazıcı dönüştürmek için nasıl gösterir. Yazıcı hücreleri ve biyomalzeme 3D doku yapısı oluşturmak yeteneğine sahiptir. Burada gösterilen çalışma 3D neocartilage inşa.

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Heterojen hücre popülasyonlarına sahip yük taşıyan dokuların mühendisliği ve analizi hala bir zorluktur. Burada, tek bir yapı içinde çeşitli hücre popülasyonlarının birlikte kültürü için bir platform olarak iki katmanlı aljinat hidrojel diskler oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.

Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

İnsan diz eklemindeki kıkırdak, kemik, yağ yastığı ve sinovyumu özetlemek için kullanılan insan mezenkimal kök hücrelerinden dört tip doku üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu dört doku özelleştirilmiş bir biyoreaktöre entegre edilir ve mikroakışkanlar yoluyla bağlanır, böylece çip üzerinde bir diz eklemi oluşturur.

Eklem hastalıklarını modellemek ve ilaçları test etmek için çip üzerinde diz eklemi oluşturulması

Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.

Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Öğrenin eklem kondrositlerini 3D biyomimetik hidrojellerde genişletme ve olgunlaştırma yöntemini. Bu teknik, kıkırdak onarımı için fizyolojik olarak uygun bir mikroortam sağlar ve hücre fenotipinin korunmasına yardımcı olur.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Daha fazla video keşfet