Name: Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Öğrenin bağırsakta lipit transportunu Caco-2 hücreleri kullanarak in vitro modelde incelemeyi. Lipoprotein izolasyonu ve partikül boyut analizi yöntemleriyle besin emilimi mekanizmalarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, California Northstate Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'nden (AMN'ye) Tohum Hibe Ödülü tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu makalenin yayın maliyetini karşıladığı için California Northstate Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'ne ve bu makalenin düzenlenmesindeki yardımları için George Talbott'a teşekkür eder.

CACO-2 hücrelerinin 1. Bakım <ol><li> Düzenli doku kültürü yemekleri kullanma <ol><li> (FBS, 37 ° C su banyosu içinde şişe yerleştirerek bir dondurulmuş şişesinden alınan Caco-2 hücreleri çözülme ve hemen önceden ısıtılmış büyüme ortamı (% 15 fetal bovin serumu, 10 ml içeren 10 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı eklemek ) Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)) &#39;de. <ol><li> Caco-2 hücreleri% 50-70 kaynaşmaya ulaştığı zaman, onları 1 bölünmüş: müstakil kadar 37 ° C&#39;de% 0.05 tripsin / 0.53 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 3 ml ile hücrelerin inkübe edilmesi ile 6 (15 dk) . Hücre topaklaşmayı önlemek yumuşak pipetleme hücreler karıştırmak için birkaç kez. Önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml içeren 10 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı tripsinize edilmiş hücre 0.5 ml ilave edilir. </li></ol></li><li> Yavaşça bir sola ve sağa yön ardından ileri ve geri yönde yemeklere birkaç kez sallayın. Yemekler dönen kaçınıngibi eşit olmayan bir hücre dispersiyonu ile sonuçlanabilir. </li><li> % 5 CO 2 ile birlikte 37 ° C inkübatör düz bir yüzeye yerleştirin yemekleri. Eğimli yüzeyler de eşit olmayan bir hücre dispersiyonu ile sonuçlanabilir. </li><li> Inkübasyon başladıktan sonra büyüme Ortam bir gün değiştirin. </li><li> Hücreleri izlemek ve izdiham ulaşmak günü kaydedin. Hücreler bölünür günden itibaren izdiham ulaşmak için yaklaşık 1 hafta sürer. </li><li> Hücreler izdiham ulaşmadan haftada iki kez büyüme ortamı değiştirin. Hücreler izdiham ulaştığınızda, her gün büyüme ortamı değiştirmek. Hücreler 7-günler sonrası konfluent olduktan sonra, günlük büyüme ortamı değiştirmek. Not: 13-günler sonrası konfluent (Şekil 1) olduğunda hücreler deneyler için hazırız. Hücreler sonunda lipoproteinlerin üreten daha az etkili hale gelecektir yana, 8 sonrası birleşik 13-17-gün arasında olan hücreleri kullanır. Deney yapmak için nasıl adım 3&#39;e gidin.</li></ol></li><li> Geçirgen zar sistemi kullanılarak <ol><li> Aşama 1.1.1.1 tarif edildiği gibi geçirgen zar ekinde Caco-2 hücreleri, tohum. Yukarıda. Onların hücre büyümesi (iyileşme dönemi) normalde yavaş çünkü dondurulmuş şişesinden alınan hücreler kullanılarak kaçının. Kısaca, önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml içeren apikal (üst bölmesi) tripsinize edilmiş hücre 0.5 ml ilave ediniz. Ayrıca, bazolateral bölme (alt bölmesi) önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml. Not: En iyi uygulama için, bazolateral odasına ilk ve daha sonra apikal odasına büyüme ortamı ekleyin. Eski medya çıkartırken, apikal medya önünde bazolateral ortamı çıkarın. Bu membran rüptürü olabilir polikarbonat membran alay kaçının. </li><li> Nedeniyle polikarbonat zardan kötü hücre görünürlüğe, benzer yoğunlukta düzenli bir doku kültürü çanak Caco-2 hücreleri tohum ve hücre izdiham yargılamak için bu yemeğin kullanın. </li><li> S izleyinTeps&#39;in 1.1.2-1.1.6, yukarıda. </li></ol></li></ol> 2. Gene overekspresyonu <ol><li> Normal transfeksiyon yaklaşımı kullanarak <ol><li> Yukarıda 1.1.1.1.-1.1.4 de tarif edildiği gibi bir doku kültürü tabağına Caco-2 hücreleri, tohum. Not: hücreler yaklaşık% 40-50 konfluent olduğunda, transfekte hazırdır. </li><li> Mikrosantrifüj tüpü içinde düşük serum ortamında 472 ul transfeksiyon reaktifi 67 ul ekle. Tüp duvar ile sulandırılmamış transfeksiyon reaktif temasından kaçının. </li><li> PLL3.7 23 ug transfeksiyon reaktifi / düşük serum ortamında karışımına, yeşil flüoresan protein (EGFP) 9 Geliştirilmiş ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> DMEM içinde% 10 FBS 8 ml Caco-2 hücreleri, büyüme ortamı değiştirin. </li><li> Damla damla çanak DNA / transfeksiyon reaktif / azaltılmış serum medya karışımı ekleyin. </li><li> Yavaşça ileri ve ba yemekleri birkaç kez sallayınBir sola ve sağa yönde takip ckward yön. </li><li> 37 ° C inkübatör çanak yerleştirin. </li><li> Kuluçka başladıktan sonra büyüme ortamı 10 ml her gün bir çanak ortamı değiştirin. </li><li> Gen ifadesini izleyin. <ol><li> 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyanmamış olan gen ekspresyonunu izlemek. Floresan mikroskobu kullanılarak, yeşil hücrelerin yüzde belirler. yüzde transfeksiyon verimini gösterir. </li><li> DAPI boyama ile gen ifadesini izleyin. <ol><li> Fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez hücreler yıkanır. </li><li> PBS (oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon) içinde% 4 formaldehit, 10 ml ekleyerek hücreleri saptamak. </li><li> PBS üç kez hücreleri yıkayın. </li><li> 500 DAPI,% 1 BSA,% 0.01 digitonin: 1 içeren PBS 8 ml ile oda sıcaklığında 15 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri. </li><li> PBS üç kez hücreleri yıkayın. </li><li> U, bir flüoresan mikroskop şarkı, mavi (Şekil 2 üst panel) ki bu yeşil / mavi göreli hücre sayısını belirler. hesaplanan yüzde transfeksiyon verimini gösterir. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Lentivirüs aşırı sistemi 10 kullanılarak <ol><li> 15 cm&#39;lik bir doku kültürü çanağı içinde Tohum, insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri (DMEM içinde% 10 FBS büyüme ortamı olarak). Not: hücreler yaklaşık% 60-70 konfluent olduğunda, transfekte hazırdır. </li><li> Mikrosantrifüj tüpü 11 düşük serum ortamı 1133 ul transfeksiyon reaktifi 162 ul ekle. Tüp duvar ile sulandırılmamış transfeksiyon reaktif temasından kaçının. </li><li> Ekle 24 pLL3.7 eGFP (ya da başka bir yapı) ug, 15.6 REV karşılık elemanının ug (RRE), REV 6.0 ug, ve transfeksiyon reaktifi / r içine veziküler stomatit virüsü glikoprotein 8.4 ug (VSVG)educed serum ortamında karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> DMEM içinde% 10 FBS ve 16 ml büyüme ortamı değiştirin. </li><li> Damla damla çanak DNA / transfeksiyon reaktif / azaltılmış serum medya karışımı ekleyin. </li><li> Yavaşça bir sola ve sağa yön ardından ileri ve geri yönde yemeklere birkaç kez sallayın. Bu noktada müstakil HEK293T hücrelerinin bazılarını görmek için normaldir. </li><li> Inkübatör çanak yerleştirin. </li><li> Kuluçkalamadan 24 saat sonra, büyüme ortamı, 25 ml çanak ortamı değiştirin. </li><li> Ertesi gün, lentivirüs (birinci toplama) içeren büyüme ortamı toplar. </li><li> Adımı yineleyin 2.2.10 fazla lentivirüs (ikinci toplama) toplamak için. </li><li> (5 dakika boyunca 2.500 xg) birinci ve ikinci toplama havuzu ve santrifüj hücre enkaz kaldırmak. </li><li> Tek kullanımlık şişe üstü filtre (0.45 mikron gözenek) ile toplama Filtre veRT (JA-20 rotor) 2 saat süre ile 31.400 x g&#39;de santrifüje toplama virüsü konsantre edilir. Pelet bulunduğu santrifüj tüpünün dibine işaretleyin. Süpernatant tortusundan ayırma, ve yaklaşık 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ters tüpü terk. </li><li> 1X PBS, 100 ul virüs içeren pelletini. Kabarcıkları kaçının. </li><li> -80 ° C &#39;de konsantre edilir virüs saklayın. Donma-çözülme döngüleri kaçının. </li><li> Titrasyon ile, Caco-2 hücreleri nakletmek için gerekli virüs optimal miktarının belirlenmesi. Maliyet tasarrufu için, 24-çukurlu plaka (iyi büyüme ortamı / 0.3 ml) kullanılarak titrasyonu için 10 cm&#39;lik bir doku kültürü çanağı kullanın. <ol><li> Konsantre edilmiş virüs artan miktarlarda ekleyin (0, 1, 2, 5, 10, 25, ve 50 ul / kuyucuk)% 40-70 konfluent Caco-2 hücreleri için polibren (nihai konsantrasyon = 5 ug / ml) ile takviye edilmiştir. 1.1.2 tarif edildiği gibi hafifçe 24 oyuklu plaka çalkalayın. </li><li> Onların gen ifadesini Monitör (Adım 2.1.10.) (Şekil 2 alt4 paneller). </li></ol></li><li> Transgen ifadesi genellikle sürekli olduğundan, gelecek deneyler için transdüse hücreleri korumak ve sürekli olarak gen ifadesini izlemek (Adım 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. Lipoprotein salgılanmasını uyararak <ol><li> Düzenli doku kültürü çanak kullanma <ol><li> Oleik asit, 50 mg, lesitin, 40 mg, ve sodyum taurokolat ve 48 mg karıştırılarak bir 100X yağ karışım hazırlayın. (8 yemekler için yeterli) PBS ile 900 ul hacim kazandırın. Kuvvetli bir şekilde lipit karışımı karıştırın. </li><li> Büyüme ortamı 89.1 ml 100X lipit karışımı 900 ul ekleyin. Mix ve lipid içeren medya filtre. oleik asit, lesitin, ve sodyum taurokolat ve nihai konsantrasyonlar (1X) 2.0 mM, 1.36 mM ve sırası ile 1.0 mM vardır. </li><li> Hücrelere lipid içeren ortam, 10 ml ilave edilir. </li><li> 37 4 saat boyunca lipit-içeren ortam ile inkübe hücreleriC inkübatör °. </li><li> PBS üç kez hücreleri yıkayın. </li><li> Lipoprotein salgılanmasını toplamak için hücrelerin büyüme ortamı 10 ml ilave edilir. </li><li> 37 ° C kuluçka makinesi içinde 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Lipoprotein içeren medya toplayın. </li></ol></li><li> Geçirgen zar sistemi kullanılarak <ol><li> Adımları 3.1.1-3.1.2 lipit karışımı hazırlamak için. </li><li> Apikal bölmeye lipid içeren ortam 10 ml ve bazolateral bölmeye büyüme ortamı 10 ml ilave edilir. </li><li> 37 ° C kuluçka makinesi içinde 4 saat süreyle inkübe edin. Bazolateral bölme lipoprotein ihtiva eden ortam toplayın. </li></ol></li></ol> 4. lipoprotein İzolasyon (Şekil 3) <ol><li> Santrifüj (5 dakika boyunca 2.000 xg) lipoprotein içeren medyanın hücre enkaz kaldırmak. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine ortamı süzün. </li><li> Ortam, sodyum klorür 5.95 g ekleyin. </li><li> Sa Eğermple TEM ile analiz edilecektir, lipoproteinlerin bütünlüğünü korumak için 1 proteaz önleyici kokteyl tablet ekleyin. </li><li> Su ile 23 ml hacmi (1.2 g / ml NaCI yoğunluk çözeltisi) getirin. </li><li> Tamamen çözünmüş çözülür. </li><li> Polikarbonat ultrasantrifüjdeki tüp içine çözeltinin Tümünü süzün. </li><li> Yavaşça, 0.5 ml, su (1.0 ug / ml yoğunlukta), 1.2 ug / ml yoğunlukta çözelti kaplar. </li><li> Hacimce ağırlıkça değil tüp dengeleyin. </li><li> Yavaşça T865 rotor tüpler yükleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca 429.460 x g&#39;de ultrasantrifüjdeki örnekleri dönerler. </li><li> Hemen Nazik pipetleme üst 0.5 ml solüsyon izole. Mümkün olduğunca hareketsiz tüp tutun. </li></ol> 5. TEM analizi <ol><li> (A / h) ile pH 6,0&#39;a ayarlanır% 2 fosfotungstik asit 5 ml hazırlayın. </li><li> (: 0.2 mikron gözenek boyutu) bir şırınga filtresi ile% 2 fosfotungstik asit Filtre. </li><li> Steril bir çanak lipoprotein numunenin 20 ul bırakın. </li><li> Bir sonraki aynı yemeğin üzerine örnek süzülmüş% 2 fosfotungstik asit 20 ul bırakın. </li><li> Yavaşça donuk yan numune üzerinde oturan bir EM ızgara bırakın. </li><li> 1 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Yavaşça ızgara örneği kaldırmak için bir filtre kağıdına EM ızgara tarafı dokunun. </li><li> Yavaşça donuk tarafı% 2 fosfotungstik asit dayayarak EM ızgara bırakın. </li><li> 1 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Yavaşça ızgara fosfotungstik asit ayrılması için bir filtre kağıdı üzerinde EM ızgara yan dokunun. </li><li> Bir TEM kullanarak, lipoproteinler (Şekil 4) görüntüleri yakalamak. </li></ol>

<ol><li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li>
<li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li>
<li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li>
<li>Lo, C. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li>
<li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li>
<li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+biosynthetic+interaction+network+component%2C+TMEM24%2C+facilitates+insulin+reserve+pool+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li>
<li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+saturated%2C+mono-%2C+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li>
<li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cells+and+human+fetal+colon%3A+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li>
<li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li>
</ol>

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu yazıda, kullanılabilecek iki sistem Caco-2 hücreleri, yani düzenli doku kültürü çanak ve geçirgen zar açıklanmıştır korumak için. geçirgen zar sistemi kullanmanın faydaları apikal ayrılmasını ve bazolateral bölmeleri ve lipid karışımı inkübe ve aynı zamanda lipoprotein salgılanmasını toplamak için yeteneği vardır. Ancak, geçirgen zar ekler pahalıdır, ve polikarbonat membran iyi bir hücre görünürlüğü izin vermez. Bu in vitro modelin avantajlarından biri genetik manipülasyon çalışmaları daha ekonomik ve daha a...

4 - diyet yağ ve lipid içinde çözünür ilaçlar ve vitaminler intestinal çalışmaları lenf fistül MODEL 1 kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilebilir. Ancak, ilgili cerrahi teknikler sadece zor değil, aynı zamanda pahalı değil. In vivo kullanılabilmektedir dışkı analizi dayalı yaklaşımlar da, mide-barsak sisteminde 2,5 yüzdesi alımını belirlemek için temel olarak kullanılmaktadır. Bu yazıda anlatılan in vitro model daha düşük maliyetli olduğunu ve ilgili teknikler tartışmalı az zorlayıcı bulunmaktadır. Genetik modifikasyonlar çalışmaları da zaman alıcı, bu in vitro bir model kullanılarak gerçekleştirilmiştir zaman daha ekonomik ve daha az bulunmaktadır. Enterositler tarafından alınır lipit çözünür malzeme lipoproteinler 6,7 içine paketlenmiş olduğundan, lipoproteinlerin üretmek için bu in vitro modelin etkinliği çok önemlidir. iki ana intestinal lipoproteinler kilomikronlar, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL) vardır. Lipidler mide-bağırsak lümeninde bol mevcut olduğunda çapı 80 nm ya da daha fazlası ile lipoproteinler olarak tanımlanan kilomikronlar, küçük bağırsak tarafından sıkı bir şekilde üretilir. Onlar büyük lipoproteinler olduğundan, şilomikronlar makul en verimli lipit taşıyıcıları vardır. Şilomikron 8 üretebilen bu in vitro modeli, diyet yağ emme, gut lipid çözünür vitamini emme ve oral lipofilik ilaç biyo-incelemek için kullanılabilir. lipoprotein fraksiyonuna lipid çözünür moleküller, vitaminler ya da ilaçların bulunması, ince bağırsakta kendi emilme bir göstergesidir. Daha önce ele alındığı gibi, bu model, oral lipofilik ilaç biyo-6 geliştirmek için de kullanılabilir. Bu kağıt Caco-2 hücreleri geçirgen zar veya normal doku kültürü yemekleri, nasıl lipit mi muhafaza edilmelidir açıklanırLipoprotein üretimini stimüle etmek için soğutun lentivirüs sentezleme sisteminin etkin aşırı ekspresyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir nasıl hazırlanmalı ve izole lipoproteinler kadar analiz edilmelidir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>16750-112</td><td>Hücre eklemeden önce büyüme ortamını ayrı doku kültürü kabında önceden ısıtın</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>3600511</td><td>Serumumuzu ısıtmıyoruz</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Hücreler tripsin tedavisinden önce PBS ile yıkanabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>Geçirgen membran sistemi</td><td>Fisher</td><td>7200173</td><td>10 cm çanak, 3 mm gözenek boyutu, polikarbonat membran</td></tr><tr><td>10 cm çanak</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td>Doku kültürü kabı</td></tr><tr><td>15 cm tabak</td><td>Fisher</td><td>08-772-24</td><td>Doku kültürü kabı</td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Fisher</td><td>12565163</td><td>Doku kültürü plakası</td></tr><tr><td>Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi</td><td>Fisher</td><td>PRE2691</td><td>Diğer transfeksiyon reaktifi ile ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Azaltılmış serum ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>11058021</td><td>Transfeksiyon</td></tr><tr><td>için pLL3.7 eGFP</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td></tr><tr><td>Şişe üstü filtre</td><td>Fisher</td><td>9761120</td><td>0,45 mm gözenekli</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td>10 mg / ml</td></tr><tr><td>Oleik asit</td><td>Sigma</td><td>01383-5G</td><td>Donma-çözülme döngüsünü önleyin</td></tr><tr><td>Lesitin&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>IC10214625</td><td>Yumurta lesitini&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum taurokolat</td><td>Fisher</td><td>NC9620276</td><td>Ürün durduruldu; Alternatif katalog numarası: 50-121-7956</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyl tableti (EDTA içermez)</td><td>Fisher</td><td>5892791001</td><td>Esas olarak TEM analizine ihtiyaç duyan numuneler için kullanılır</td></tr><tr><td>Polikarbonat ultrasantrifüj tüpü</td><td>Fisher</td><td>NC9696153</td><td>Birden çok kez yeniden kullanmak tüpü çökertecektir</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü kapağı</td><td>Fisher</td><td>NC9796914</td><td>Tüpü/kapağı rotordan çıkarmak için bir alet gereklidir</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Fisher</td><td>50-949-261</td><td>Tek Kullanımlık</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td>Gözenek boyutu = 0,2 mm; naylon</td></tr><tr><td>Fosfotungstik asit</td><td>Fisher</td><td>AC208310250</td><td>% 2 fosfotungstik asit hazırlamak için, pH 6.0</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Fisher</td><td>50-238-62</td><td>Ekstra ince ve güçlü ipuçları</td></tr><tr><td>Formvar/karbon ızgara</td><td>Fisher</td><td>50-260-34</td><td>Formvar/karbon film kare ızgara 400 Bakır</td></tr></tbody></table>

bağırsak tarafından lipit transport eğitim için caco-2 hücreleri kullanarak

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Diyetle yağ emilimi ile ilgili çalışmalar genellikle lenf kanülü ile donatılmış bir hayvan modeli kullanılarak yapılır. Bu hayvan modeli, diyetle alınan yağ emiliminin in vivo modeli olarak yaygın olarak kabul edilse de, ilgili cerrahi teknikler zorlu ve pahalıdır. Hayvan modelinin genetik manipülasyonu da maliyetli ve zaman alıcıdır. Alternatif in vitro model tartışmasız daha uygun fiyatlı, zaman kazandıran ve daha az zorlayıcıdır. Daha da önemlisi, in vitro model, araştırmacıların enterositleri izole bir sistem olarak incelemelerine olanak tanıyarak tüm organizma modelinin doğasında bulunan karmaşıklığı azaltır. Bu makale, insan kolon karsinomu hücrelerinin (Caco-2), lipitlerin ve yağda çözünen ilaçların ve vitaminlerin enterosit taşınmasını incelemek için in vitro bir model olarak nasıl hizmet edebileceğini açıklamaktadır. Caco-2 hücrelerinin uygun bakımını ve lipit karışımlarının hazırlanmasını açıklar; Ve ayrıca geçirgen membran sistemini kullanmanın değerli seçeneğini tartışır. Diferansiye Caco-2 hücreleri polarize olduğundan, geçirgen membran sistemini kullanmanın temel avantajı, apikali bazolateral bölmeden ayırmasıdır. Sonuç olarak, lipit karışımı apikal bölmeye eklenebilirken, lipoproteinler bazolateral bölmeden toplanabilir. Ek olarak, lentivirüs ekspresyon sisteminin Caco-2 hücrelerinde gen ekspresyonunu yukarı regüle etmedeki etkinliği tartışılmıştır. Son olarak, bu makale, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile bağırsak lipoproteinlerinin başarılı bir şekilde izole edilmesinin nasıl doğrulanacağını açıklamaktadır.

1 görüntüler, normal 13-gün sonrası birleşik Caco-2 hücreleri Şekil. Kubbe-şekilli yapılar ve hücre içi lipid damlacıkları görünümü farklılaşmış Caco-2 hücreleri için karakteristiktir. Caco-2 hücreleri tohumlama sırasında eşit dağılmış değil, onlar kümelenir ve yemeğin belirli alanlarda sarmak olacaktır; ve herhangi bir hücrelerde olmadan çanak birkaç alanları olacaktır. Swirling ve eğimli bir yüzeye çanak yerleştirilmesi kaçınılmalıdır. Bu post-birleşik Caco-2 hücreleri yeni büyüme ort...

Caco-2 hücreleri, lipitlerin ve yağda çözünen ilaçların/vitaminlerin enterosit taşınmasını incelemek için in vitro bir model olarak hizmet edebilir. Geçirgen membran sistemi, apikal kısmı bazolateral bölmeden ayırırken, lentivirüs ekspresyon sistemi etkili bir gen aşırı ekspresyon yöntemi sunar. Lipoproteinlerin izolasyonu TEM ile doğrulanır.

Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Bu prosedürün genel amacı, lipidde çözünen moleküllerin bağırsak tarafından taşınmasını incelemektir. Bu işlem, öncelikle farklılaşmış caco two hücrelerinin geçirgen membran ekine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, Caco two hücreleri bir lipid karışımı ile inkübe edilir ve lipoprotein salgılanması stimüle edilir.Ardından, sodyum klorür yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüj kullanılarak lipoproteinler izole edilir. Son olarak, izole edilen lipoproteinler fosfotungstik asit ile negatif boyanır. Nihayetinde, şilomikronların çok düşük yoğunluklu lipoproteinlere göre bağıl bolluğunu göstermek için partikül boyutu analizi kullanılır.Bu yöntem, diyetteki lipidlerin bağırsak tarafından taşınması hakkında bilgi sağlayabilse de, oral lipid ilaçların biyoyararlanımının belirlenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Metin protokolüne göre gen aşırı ekspresyonu gerçekleştirip izleme yaptıktan sonra, gen aşırı ekspresyonunu sürdüren KCO iki hücreyi muhafaza edin. %50 ila %70 konfluense ulaşmış hücreleri kullanarak, 3 mL %0,05 trypsin ve 0,53 mM EDTA ekleyip 37 °C'de hücreler ayrılana kadar inkübe ederek hücreleri bire altıya bölün; topaklanmayı önlemek için hücreleri birkaç kez nazikçe pipetleyin.Ardından, 0,5 mililitre hücreyi geçirgen bir membranın apikal veya üst bölmesine aktardıktan sonra, 10 mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı içeren insert'i yerleştirin. Alt lateral bölmeye 10 mililitre sıcak büyüme ortamı ekleyin. Kapları ileri geri hareketlerle birkaç kez nazikçe sallayın.Hücrelerin eşit dağılmamasını önlemek için kapları dairesel hareketlerle sallamaktan kaçının. Kapları 37 °C ve %5 CO₂ içeren bir inkübatörde düz bir yüzeye yerleştirin. Bir gün sonra büyüme besiyerini değiştirin ve besiyeri değişimine metin protokolüne uygun olarak devam edin.900 µL PBS'yi 50 mg oleik asite ekleyerek 100 x lipid karışımı hazırlayın. Karışımı kuvvetlice vorteksleyin. Tüm oleik asit karışımını, 40 mg Han ve 48 mg sodyum tarot içeren bir tüpe aktarın. Lipid karışımını kuvvetlice vorteksleyerek çözün.900 µL lipid karışımını 89,1 mL büyüme ortamına ekleyin ve ortamdaki nihai konsantrasyonlar burada gösterildiği şekilde çözeltiyi süzerek karıştırın. Geçirgen membran insertler üzerinde büyütülmüş, konfluens sonrası 13 günlük Caco-2 hücrelerini kullanın. Apikal bölmeye 10 mL lipid içeren ortam, bazolateral bölmeye ise 10 mL büyüme ortamı ekleyin.Bazolateral odadaki lipoprotein içeren ortamı toplamadan önce 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Lipoproteinleri izole etmek için, lipoprotein içeren ortamı 2000 ×g'de beş dakika santrifüjleyerek hücre kalıntılarını uzaklaştırın. Ortamı 50 ml'lik bir tüpe aktarın, ardından 5,95 g sodyum klorür ekleyin ve geçirimli elektron mikroskobu veya TEM ile analiz yapılıyorsa bir adet proteaz inhibitörü tableti ekleyin.Hacmi 23 mililitreye tamamlamak ve çözünenleri tamamen çözmek için su kullanın. Ardından çözeltiyi bir polikarbonat ultrasentrifüj tüpüne aktarın. 1.2 gram per mililitre yoğunluktaki çözeltinin üzerine nazikçe tabaka oluşturmak için 0.5 mililitre su kullanın.Ardından tüpü ağırlıkça dengeleyin. Tüpleri bir T 8 65 rotoruna yerleştirin ve 429.460 ×g'de ve 4 °C'de 24 saat boyunca ultrasantrifüj uygulayın. Sonrasında, tüpü mümkün olduğunca hareketsiz tutarak, üstteki 0,5 mL çözeltiyi hemen izole edin.TEM analizi gerçekleştirmek için, 2% fosfotungstik asidin beş mililitresini hazırlayın ve pH değerini 6.0'a ayarlayın. Çözeltiyi, 0.2 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtresi kullanarak süzün. Steril bir lam üzerine lipoprotein örneğinden 20 mikrolitre damlatın.Ardından, aynı kap üzerindeki örneğin yanına, mat tarafı örneğe bakacak şekilde 20 µL filtrelenmiş fosfotungstik asit damlatın. Bir EM ızgarasını lipoprotein damlasının üzerine nazikçe bırakın ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Daha sonra, ızgara üzerindeki fazla örneği uzaklaştırmak için ızgaranın kenarına bir filtre kağıdı yardımıyla hafifçe vurun.Ardından, ızgarayı aynı tarafı fosfo-dil dilindeki asit damlasının üzerine gelecek şekilde nazikçe bırakın ve fazla solüsyonu uzaklaştırmak için ızgarayı filtre kağıdına hafifçe vurmadan önce bir dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, lipoproteinlerin görüntülerini yakalamak için TEM uygulayın. Burada, diferansiye olmuş Caco-2 hücrelerinin karakteristiği olan kubbe şeklinde yapılar ve hücre içi lipid damlacıkları sergileyen, konfluent olduktan 13 gün sonraki normal Caco-2 hücreleri gösterilmektedir.Bu aşamada, hücreler kopmaya karşı daha duyarlı olduğu için yeni besiyeri yavaşça eklenmelidir. Sodyum klorür yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak, caco two hücreleri tarafından salgılanan lipoproteinler izole edildi ve TEM ile analiz edildi. Burada, çapları 80 nanometreden büyük lipoproteinler olan şilomikronların bazıları gösterilmektedir.Daha küçük v LDL'ler de mevcuttur. Toplam lipoprotein partikül sayısına oranla yüksek bir şilomikron partikül yüzdesi, gelişimi sonrasında etkili lipid taşınımına işaret eder. Bu teknik, eczacılık bilimleri alanındaki araştırmacıların oral lipofilik ilaçların biyoyararlanımını daha kapsamlı bir şekilde incelemelerinin yolunu açmıştır.

using-caco-2-cells-to-study-lipid-transport-by-the-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, karmaşık gıda kaynaklarında demir biyoyararlanımını değerlendirmek için bir in vitro tekniği göstermektedir. Teknik, farklılaşmış Caco-2 hücreleri tarafından demir alımı ile birlikte insan sindiriminin simülasyonunu birleştirir. Hücre içi ferritin oluşumu, hücresel demir alımı için bir belirteç görevi görür.

Caco-2 Hücre Biyo-Testi: Karmaşık Gıda Kaynaklarında Demir Biyoyararlanımını Ölçmek için İn Vitro Bir Yöntem

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Biz, insan bağırsak-on-a-chip microphysiological sistemi kullanılarak uzun bir süre için bir in vitro protokole ko-kültür bağırsak mikrobiyomları ve bağırsak villi açıklar.

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

3 boyutlu yetiştirilen Caco-2 hücreleri bir in vitro hücre kültürü modeli ve fare bağırsak bir ex vivo modeli kullanılarak bağırsak serotonin taşıyıcısı (SERT) fonksiyonu ve ifadesinin düzenlenmesi çalışma basit bir yöntem tarif eder. Bu yöntemler, diğer epitelyal taşıyıcılar çalışma için de geçerlidir.

Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için

Bu protokol karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır. Bu primer bağırsak kültürler bir takım teknikler kullanılarak bağırsak peptidi salgısının temel sinyal yollarının inceleme sağlar.

Enteroendokrin Hücre Gut Hormon salgısını Çalışması ve Canlı Hücre Görüntüleme için Amaçlanan Kemirgen Küçük Bağırsak Karışık İlköğretim Kültürler

Biz X x-ray ışınlanmış Caco-2 ve periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) arasındaki çapraz karışma araştırmak için bir protokol mevcut. Protokol Caco-2 ışınlama ve set-up ortak kültür PBMC ile başlar; daha sonra trans-epitel elektriksel direnç düzenli olarak 48 s ve western blot Caco-2 ve PBMC gerçekleştirilen üzerinden ölçülür.

X-ışını arasında çapraz karışma araştırmak için bir ortak kültür yöntemi Caco-2 hücreleri ve PBMC radyasyona maruz

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

Bu protokol yağ asitleri ile stimülasyon üzerine insan bağırsak organoidlerinde lipid damlacık (LD) oluşumunun karakterizasyonu için bir test açıklar. Bu denemenin LD oluşumunun nicelleştirilmesi için nasıl kullanıldığını ve LD oluşumunu etkileyen ilaçlar için yüksek iş elde taramalarda nasıl kullanılabileceğini tartışıyoruz.

İnsan Bağırsak Organoidlerinde Lipid Damlacık Oluşumunun Karakterizasyonu ve Niceliği için Floresan Esaslı Bir Test

Biz asetaminofen (APAP) bağırsak ve karaciğer organoidleri ile bir mikrofizyolojik sistem (MPS) maruz. Bu makalede, MPS'de organoid üretim yöntemleri ve APAP farmakokinetik ve toksikolojik özellik değerlendirmeleri açıklanmaktadır. Ayrıca sonuçları doğrulamak için gerekli doku işlevselliği analizleri açıklar.

İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

Demir (Fe) biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlili, gıdalardan, gıda ürünlerinden, takviyelerden, yemeklerden ve hatta diyet rejimlerinden Fe biyoyararlanımını değerlendirmek için uygun maliyetli ve çok yönlü bir yaklaşımı temsil eder. İnsan çalışmalarına tamamen doğrulanmış, Fe biyoyararlanımı çalışmaları için en son teknolojiyi temsil eder.

Gıda Demir Biyoyararlanımının Ölçümü için Caco-2 Hücre Biyotahlili

Öğrenin bağırsakta lipit transportunu Caco-2 hücreleri kullanarak in vitro modelde incelemeyi. Lipoprotein izolasyonu ve partikül boyut analizi yöntemleriyle besin emilimi mekanizmalarını keşfedin.

Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak

Daha fazla video keşfet