Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Bu prosedürün genel amacı, fizyolojik olarak daha ilgili bir 3B ortamda hücre davranışını incelemek için sandviç benzeri kültürleri bir araya getirmektir. Bu, önce ventral ve dorsal substratların fibronektin gibi proteinlerle hazırlanması ve kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hücreler standart bir 2D kültüre benzer şekilde oturtulur.

Daha sonra dorsal substrat üst üste bindirilir, böylece hücreler ventral ve dorsal olarak uyarılır. Son olarak, yara iyileşme testi gibi deneyler yapılabilir. Sonuç olarak, sandviç benzeri kültürler, canlı görüntüleme, immünofloresan veya hücresel ekstraksiyon gibi standart 2D kültürler için önceden geliştirilmiş prosedürlerle analiz edilir.

Daha fazla analiz için. Bu kültürel tekniğin mevcut üç boyutlu sistemlere göre en büyük avantajı, hem ventral hem de dorsal bölgelerde topografya, kimya, sertlik ve protein içerikleri gibi malzeme etkileşimlerinde farklı parametrelerin incelenmesine izin vermesi ve yüksek derecede çok yönlülük sunmasıdır. Lipin, immünofloresan ve hücresel ekstraksiyonlar gibi bazı üç boyutlu sistemler için engellenebilecek deneysel prosedürlerin yanı sıra, bir davlumbazda çalışarak solvent döküm ile düz bir polilaktik asit veya PLLA filmi üretmek için, 100 mililitre kloroforma iki gram PLLA ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık üç saat veya tamamen eriyene kadar karıştırın.

Paslanmaz çelik rondelaları bir cam petri kabına yerleştirin. Daha sonra yıkayıcılara 200 mikrolitre PLLA solüsyonu ekleyin. Çanağı örtmek için birkaç delikli alüminyum folyo kullanın ve PLLA'nın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça buharlaşmasına izin verin.

Daha sonra, herhangi bir çözücü izini buharlaştırmak için numuneleri beş dakika boyunca 120 santigrat derecede ısıtın. Daha sonra numunelerin oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika soğumaya bıraktıktan sonra, tabaktaki numuneleri kaplamak için 18.2 mega ohm santimetre su kullanın ve oda sıcaklığında sekiz dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, pulları Petri kabından çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.

Ardından, yıkayıcıların kenarındaki kusurları gidermek için cımbız kullanın ve numunelerin kurumasını bekleyin. PLLA hidroliz deposu ile parçalanabildiğinden, bir vakumdaki numuneler deney gününe kadar kurur. Ek olarak, ELLA lifleri metin protokolüne göre üretilebilir ve steril bir kültür başlığı altında dorsal substrat olarak kullanılabilir.

Numunelere kalsiyum ve magnezyum içeren dokos, PBS veya DPBS'de mililitre başına 20 mikrogram FI nin ekleyin ve protein kaplamasını takiben bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Numuneleri iki kez yıkamak için DPBS'yi kullanın ve cam kapak kızakları üzerinde bir sonraki tohum hücrelerini kullanmaya hazır olana kadar P kalsiyum ve magnezyum ile DPBS'de saklayın ve hücrelerin ventral substrata yapışmasını sağlamak için üç saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra numuneleri 12 oyuklu bir plakanın yeni kuyularına aktarın.

Cımbız kullanarak, dorsal substratı hücrelerin üzerine dikkatlice yerleştirin. Sonra bir mililitre orta ekleyin. Yıkayıcının ağırlığı, sırt alt tabakasının yüzmesini önleyecektir.

Numuneleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye getirin ve sandviç benzeri kültür içindeki hücre göçünü incelemek için ortamı haftada iki kez değiştirin. Ventral ve dorsal substratları daha önce gösterildiği gibi fibronektin ile kapladıktan sonra, cam örtü üzerindeki tohum hücreleri yüksek yoğunlukta kayar, numuneleri inkübe eder ve hücrelerin birleşmesine izin verir. Ardından, bir boşlukla ayrılmış iki hücre popülasyonu oluşturmak için hücre tek tabakasını çizmek için bir pipet ucu kullanın.

Ventral oturmuş substratı, hızlandırılmış alım için uygun ve dorsal substratların içine sığacak kadar büyük yeni bir kuyuya yerleştirin. Daha sonra, daha önce gösterildiği gibi cımbızla, dorsal substratı hücrelerin üzerine yerleştirin ve ortamla yeniden doldurun. Numuneyi hızlandırılmış bir mikroskop altına yerleştirin ve her 20 dakikada bir boşluk kapanmasının görüntülerini yakalayın.

Sandviçteki boşluk kapanmasını analiz etmek için Image J'den mito BO gibi bir yazılım kullanın. Kültür gibi. Sülfat, dorsal reseptörlerin uyarıldığı zamana ve dorsal etkileşimin özelliklerine büyük ölçüde bağlıdır.

Hidrojeller gibi diğer 3D sistemlere benzer şekilde, örneğin, burada görüldüğü gibi, dorsal elektro bükülmüş PLLA lifleri, fibronektin ile kaplandığında hücre hizalamasını yönlendirir, ancak BSA gibi yapışkan olmayan bir proteinle kaplandığında değil. Ek olarak, düz dorsal PLLA'lı sandviç benzeri kültürler, C iki C 12 hücresi kullanılarak miyogenez seviyesinde bir artışı tetikledi. Bu aynı zamanda dorsal biyolojik uyaranlara da bağlıdır.

Farklı dorsal proteinlerle etkileşim, bu videoda gösterildiği gibi farklı farklılaşma oranlarına yol açtığından, bir yara iyileşme testinde sandviç benzeri kültür içinde göç eden fibroblastlar, uzun bir morfoloji benimser ve hücrelere kıyasla daha kısa mesafeler göç eder. 3D fibronektin ve kollajen jellere benzer 2D substratlar üzerinde kültürlenmiştir. Sandviç benzeri kültürleme, 2D koşullara kıyasla hücre aracılı ECM yeniden organizasyonunu artırır.

Bu süreç, dorsal mekanik uyaranlara ve hücre iskeleti stabilitesine dayanır. BLE'ler gibi kasılma inhibitörlerinin kullanımı statin işlemi engellediğinden S Tamam, bu videoyu izledikten sonra, sandviç benzeri kültürlerin nasıl birleştirileceği konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, hastalık modellerindeki uygulamalar, geliştirme çalışmaları ve ilaç testleri dahil olmak üzere, reaksiyon tıbbı ve kanser için mikro çevre gibi 3D mühendislik yapabilir.