Name: Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Öğrenin sandviç benzeri kültürlerle hücre davranışlarını 3D ortamda nasıl inceleneceğini. Fibronektin kaplı substratlar kullanarak yara iyileşmesi ve canlı görüntüleme uygulamaları gerçekleştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HealInSynergy (306990) aracılığıyla ERC'den destek ve FPU programı AP2009-3626 kabul edilmektedir.

Dorsal Yüzeyler 1. Üretimi <ol><li> Çözücü döküm tarafından PLLA düz bir filmin üretimi. <ol><li> Oda sıcaklığında tam olarak (yaklaşık 3 saat) çözününceye kadar (RT) karıştırılarak% 2 bir çözeltisi, kloroform içinde (ağ / hac) PLLA (100 mi kloroform içinde 2 g PLLA) hazırlamak üzere, bir çeker ocak içinde çalışır. </li><li> Cam Petri kabı pulları yerleştirin. Not: (ventral Örnek çapından biraz daha küçüktür) 10.5 mm&#39;lik bir iç çapa sahip ve paslanmaz çelik çamaşır yıkama ventral alt-tabakanın üzerine yerleştirilir ve böylece. Örneğin politetrafloroetilen (PTFE) veya cam pullar gibi başka malzemeler de kullanılabilir. </li><li> Yıkayıcı PLLA çözeltisi 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça buharlaşmasına izin verin. Çözücünün düşük buharlaşmasını sağlamak amacıyla, birkaç delik ile alüminyum folyo ile Petri kabı kapatmak. </li><li> Çözücü izleri buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 120 ° C &#39;de örnekleri ısıtın. </li><li> Numuneler yapmak serin yapalımRT&#39;de wn. </li><li> Numuneler (30 dk yaklaşık) soğuduktan sonra, Petri kabındaki · cm su M 18.2 ile kaplayın ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe. Not: örnekler tamamen soğuduktan değilse, bunlar · yukarı cm su M 18.2 alıp bir lastik devleti kabul edebilir. Buna ek olarak, daha az 8 dakika boyunca · cm su 18.2 kuluçka uygunsuz dekolmanı ve yıkama ayrıldıktan fazla 8 dakika boyunca neden olabilir. </li><li> Bir jilet ile, Petri kabı onları kalkmasına pulları kaldırın. </li><li> Cımbız ile yıkama kenarından herhangi bir kusurları çıkarın ve numuneler hava kurumaya bırakın. </li><li> PLLA hidroliz ile parçalanabilir olduğu için deney gününe kadar bir vakum kurutma cihazı (80 mbar) örnekleri saklayın. </li></ol></li><li> Elektrospinning tarafından PLLA liflerinin üretimi. <ol><li> Karışması sağlandı göre heksaflorizopropanol içinde bir% 8 çözeltisi (ağırlık / hacim) PLLA (100 mi heksaflorizopropanol içinde 8 g PLLA) hazırlamak üzere, bir çeker ocak içinde çalışmatamamen çözülene kadar oda sıcaklığında ing (3 saat, yaklaşık). </li><li> Sırasıyla, rastgele ya da düzenli fiber elde etmek için, bir alüminyum levha veya Elektrospinning bir tambur üzerinde, politetrafloroetilen (PTFE), çamaşır makineleri yerleştirin. Not: (ventral Örnek çapından biraz daha küçüktür) 10.5 mm&#39;lik bir iç çapa sahip kullanımlar politetrafloroetilen (PTFE), çamaşır yıkama ventral alt-tabakanın üzerine yerleştirilir ve böylece. Örneğin, paslanmaz çelik ya da cam pullar gibi başka malzemeler de kullanılabilir. Tambur hizalanmış fiberler elde etmek için 160.7 saniye -1 (yarıçap = 7 cm) &#39;lik bir açısal hızda dönmelidir. Daha yavaş bir hızlı fiber hizalama tetikleyebilir olmayabilir ve daha hızlı kırık lifleri neden olacaktır. </li><li> Polimer çözeltisi ile şırınga yükleyin ve şırınga pompası üzerine yerleştirin. </li><li> 30 kV voltaj ve 12 cm&#39;lik bir toplayıcı mesafe ile, bir 0.9 ml / saat akış oranı kullanılarak PLLA çözeltisi Electrospin. </li><li> Elektrospinning süreci kıç Durdurer 20-30 dk (hücreler aynı anda birkaç lifleri ile etkileşim var çünkü) bir zamanlar iyi bir lif yoğunluğu elde edilir. </li><li> Çözücü izleri buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 120 ° C &#39;de örnekleri ısıtın. </li><li> PLLA hidroliz ile parçalanabilir olduğu için deney gününe kadar bir vakum kurutma cihazı (80 mbar) örnekleri saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Sandviç Kültürü <ol><li> Hücreler ventral 2B yüzeye yapıştırılır kez sandviç gibi kültür birleştirin. <ol><li> Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek. </li><li> Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) Ca içeren 2+ ve Mg2 + (200 ul / sn içinde eritildi fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe1 st için) yeterli. Not: Çözücü döküm film ve electrospun elyaflar yıkama yanlarından birine bağlanır, çünkü nedeniyle imalat işlemine, sırt alt-tabakalar belirlenmiş bir üst ve alt kenara sahiptir. Bu taraf, bu nedenle hücreleri (Şekil 3) bakan bir tanesidir. <ol><li> Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Iki değerli katyonların beri 2+ Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS protein katlanmasını düzenler. </li></ol></li><li> Camına Tohum hücreleri 13 lamelleri. Not: sandviçe benzer kültürü 2B alt tabakalar üzerine dayandığı için, hücre ekim Benzer 2B örnek olarak yapılacaktır. Örneğin, C2C12 miyoblast cm-1 farklılaşma deneyleri ve NIH3T3 fibroblast için 7000 ° C&#39;de tohumlanır 17.500 hücre düşecek şekilde,arşın cm -1 izole kültürleri hücre morfolojisi ve yapışma incelemek için. </li><li> % 5 CO2 37 ° C&#39;de bir kuluçka numuneler ve hücreler 3 saat ventral substrata yapışmasına izin verir. </li><li> (Çamaşır uygun yerlerde), bir 12 çok oyuklu bir plakanın yeni bir kuyu ventral tohumlu yerleştirilmesidir. Not: Yeni bir kuyuda sandviç gibi kültür Montaj bu besinleri tüketmek ve içinde kültüre hücreleri etkileyen büyüme faktörleri ve atık salgılarlar beri iyi tohumlama sonrası dibine yapıştırılır var hücrelerin kurtulmak için tek yoldur sandviç gibi sistem. Bu aynı zamanda sandviç benzeri ortamında kültüre sadece hücreleri lize amacıyla hücresel çekimi için bir zorunluluktur. </li><li> Dikkatle ve bir cımbız yardımıyla, hücreler üzerinde dorsal alt tabakayı bindirme. Ortam (1 mi) ile doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Not: yıkama ağırlığı dorsal alt önleyecektiryüzen tedir. </li><li> Standart 2D kültürlerde olduğu gibi haftada iki kez orta değiştirin. Bu hücre hasarına neden olabilir çünkü dorsal substrat hareket ettirmeyin. </li></ol></li><li> Sadece hücre tohumlama sonrası sandviç gibi kültür birleştirin. <ol><li> Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek. </li><li> Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, Ca + 2 ve Mg + 2, 1 saat boyunca (200 ul / numune) ihtiva eden DPBS içinde eritilmiş fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe edin. <ol><li> Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS <s&gt; 2+ kadar iki değerlikli katyonlar, protein katlanmasını düzenleyen beri. </li></ol></li><li> (Çamaşır uygun) 12, çok oyuklu bir plaka iyi cam lameller üzerine tohum hücreleri. Bunu yapmak için, dorsal substratı döşeme sonra hücre kaybını önlemek için son derece konsantre hücresel süspansiyon kullanın. </li><li> Dikkatle ve bir cımbız yardımıyla, hücreler üzerinde dorsal alt tabakayı bindirme. Ortam (1 mi) ile doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Not: Yıkama ağırlığı yüzen dorsal alt tabakayı önleyecektir. </li><li> Standart 2D kültürlerde olduğu gibi haftada iki kez orta değiştirin. Not: Bu hücre hasarına neden olabilir çünkü dorsal substrat hareket ettirmeyin. </li></ol></li></ol> 3. Analiz Not: Sandviç gibi kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır ve bu nedenle yaygın olarak zaten standart 2D kültürler için geliştirilmiş prosedürler ile analiz edilebilir. Örneğin, beri PLLA şeffaf ve cel olduğunuls xy düzlemi içinde hareket etmek kısıtlanır, mikroskopi 2B yüzeylerde olarak yapılır. Hücre göçü, bu nedenle deneme ve görüntü analizi kolaylaştırır 3D kültürleri için z-ekseni hücreler izleme gerek kalmadan, 2B kültürleri gibi analiz edilebilir. Bir çizik testi ile yara iyileşmesi tahlil incelemek için bu protokolü uygulayın: <ol><li> Sandviç gibi kültür içinde Çalışma hücre göçü (yara iyileşmesi deneyi). <ol><li> Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek. </li><li> Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, 1 saat süre ile Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) Ca + 2 ve Mg içeren 2+ içinde eritildi fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe edin. <ol><li> Protein Kaplamadan sonra, DPBS ile iki kez numune yıkayınamacıyla fazla proteinin ayrılması için. Daha sonra, protein Doğallıktan neden olabilir, bu, kurutma elde örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Iki değerli katyonların beri 2+ Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS protein katlanmasını düzenler. </li></ol></li><li> Yüksek yoğunlukta 13 cam lamelleri Tohum hücreleri. </li><li> % 5 CO2 37 ° C&#39;de bir kuluçka numuneler ve hücreler kaynaşmaya elde etmek için izin verir. </li><li> Bir boşlukla ayrılan 2 hücre popülasyonlarının almak için hücre tek tabaka kazımak için bir pipet kullanın. </li><li> Time-lapse edinimi için yeni bir kuyu uygun ventral numaralı seribaşı substrat yerleştirin ve dorsal yüzeylerde (yani 12 çoklu plaka) uygun yerlerde. </li><li> Dikkatli ve bir çift cımbız yardımı ile, hücreler üzerindeki sırt alt tabaka kaplaması ve daha sonra (bir 12 çok-delikli plaka için 1 mi) ortam ile doldurun. Not: yıkama ağırlığı önleyecektir tO yüzen alt tabakayı dorsal. </li><li> Time-lapse mikroskop örnek yerleştirin (37 ° C olarak ayarlanmış ve% 5 CO 2) ve boşluk kapatma her 20 dk görüntüleri alır. </li><li> Böyle ImageJ gelen eklenti MiToBo olarak özel bir yazılım kullanılarak boşluk kapatma analiz edin. 14 </li></ol></li></ol> Not: protein ve nükleik asit ekstraksiyon 2B alt tabakalar üzerinde benzer şekilde gerçekleştirilir. Ekstraksiyon verimini artırmak amacıyla hücreleri üzerinde doğrudan lizis tamponu eklemek için sandviç gibi kültür demontaj oluşur tek fazladan bir adım vardır. Örneğin mRNA çıkarımı için: <ol start="2"><li> Sandviç gibi Kültürler mRNA Özü <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir kit ile ilgili tüm tamponları hazırlayın. </li><li> Inkübatör dışarı sandviç gibi kültür atın. </li><li> Örneklerden kültür ortamı çıkarın. </li><li> DPBS Ca içeren bir kez numune yıkayın2 + ve Mg2 + (1 mi) ve bütün çözelti çıkarın. </li><li> Bir çift cımbız yardımı ile, sırt alt-tabakanın çıkarın ve ventral substrata liziz tamponu (350 ul) ilave edin. Ayrıca, sırt alt-tabakaya yapışan hücreler lize etmek için yeniden ventral alt-tabaka üzerine sırt alt tabaka kaplaması. </li><li> Lizis çözeltisi izole etmek için, dorsal substrat çıkarın. </li><li> MRNA almak için üreticinin talimatlarına uyun. </li></ol></li></ol> Not: Proteinlerin imüno-da 2 boyutlu yüzeylere olduğu gibi gerçekleştirilebilir. Sandviç gibi kültürler antikorlar ve tampon doğru difüzyon engel olabilir için, inkübasyon süreleri arttırılmalıdır. Ayrıca, sandviç boyama protokolü başlamadan önce demonte edilebilir, ancak bu ikinci durumda bazı hücreler dorsal ve ventral substrat alt tabakaya bazı bağlı kalacaktır. <ol start="3"><li> Bir sandviç gibi kültürün içinde Immunodetect proteinler <ol&gt; <li> DPBS ile bir kez örnek yıkayın ve 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit ile sabitlenir. Not: Sırt alt-tabaka difüzyon problemleri önlenebilir, böylece sabitleme işlemi esnasında çıkarılabilir. </li><li> DPBS (1 mi) ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS içinde% 0.5 Triton X-100 (1 mi) ile geçirgenliği. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DPBS içinde% 1 albümini (1 mi) ile spesifik olmayan bağlanma yerleri bloke eder. </li><li> Primer antikor ile inkübe (2 ug / ml; 1 mi), oda sıcaklığında 3 saat çözüm engelleme. </li><li> DPBS ile 10 dakika /% 0.5 Tween 20 (1 mi) 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında çözeltisi (1 mi) bloke sekonder antikor (2 ug / ml) ve 1 ug / ml DAPI ile 2 saat inkübe edin. </li><li> DPBS içinde 10 dakika /% 0.5 Tween 20 (1 mi) 3 kez yıkayın. </li><li> DPBS yıkayın. Not: Numuneler Vectashield bir slayt üzerine monte edilir ve dorsal yüzeyler önce immunodeteksiyon çıkarıldığında oje ile kapatılabilir. </li><li> Floresan mikro altında gözlemleyinstandart 2D yüzeyler gibi kapsamı. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).</li>
<li>Ruffner, H., Lichtenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems--towards+primary+drug+discovery+platforms%3A+an+interview+with+Heinz+Ruffner+%28Novartis%29+and+Jan+Lichtenberg+%28InSphero%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero).</a> Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).</li>
<li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).</li>
<li>Schor, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%27sandwich%27+assay+for+quantifying+chemo-regulated+cell+migration+within+3-dimensional+matrices%3A+wound+healing+cytokines+exhibit+distinct+motogenic+activities+compared+to+the+transmembrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).</li>
<li>Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+system+for+the+assessment+of+cell+migration+on+3D+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).</li>
<li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+and+ventral+stimuli+in+sandwich-like+microenvironments.+Effect+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions%3A+effect+on+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39(2012).</li>
<li>Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Glaß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Migration+Analysis%3A+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recogn%22%5BJournal%5D)">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell%2Fmatrix+interface+to+control+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulatory+effects+of+a+three-dimensional+microenvironment+on+cell-mediated+fibronectin+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Günümüzde, 3D kültür kanseri dahil olmak üzere hücre biyolojisinde önemli bir ilaç ve biyoteknolojik sanayi için konu yanı sıra araştırma, ve kök hücre. Bunun bir sonucu olarak çok sayıda 3D kültür sistemleri geliştirilmiştir. Ne yazık ki, 3D sistemleri arasındaki farklılıklar genellikle hücre kader anlayışı engelleyen, farklı hücre davranışı neden olur. Ayrıca, deneysel işlemler genellikle 2B kültür sistemleri gibi basit değildir. Bu nedenle bu bazı sakıncaları çok önemlidir aşmak isteyen yeni kültür sistemlerinin geli...

In vivo hücre mikroçevrelerde çoğu üç boyutlu (3D) bir yapıya sahip olsa Geleneksel olarak, hücre kültürü, iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bu doğal olmayan 2D ortam düz bir dünya için kendini uyarlama bir yolu olarak, hücre davranış değişiklikleri, tetikler hangi doğrudan etkiler, hücre kaderi 1,2. Bu nedenle, 2B hücre kültürlerinde elde edilen sonuçlar her zaman in vivo tekrarlanabilir değildir. Bu, herhangi bir boyut bağımlı biyolojik mekanizma 3,4 içine daha fazla anlayış almak için daha fazla fizyolojik benzeri koşulların sağlanması isteyen yeni alakalı kültür sistemlerinin geliştirilmesi teşvik etmiştir. 2B hücreleri ventral yapışır yüzeylerde oysa, in vivo hücrelerin çoğunluğu tamamen ECM ve çevrili: 2B kültür ve in vivo ortamda 3D arasındaki ana farklardan biri ekstrasellüler matriks (ECM) demirlemiş hücre reseptörlerinin dağılımı Böylece ceII yapışma reseptörlerinin bir 3D dağıtım yoluyla gerçekleşir. Bu sayede, hücre büyümesi, hücre farklılaşması ve gen ekspresyonu gibi önemli işlevleri modüle farklı hücre yapışma sinyal yollarını başlatır. Onların değişkenlik ve karmaşıklık ortak hücre kültürü prosedürlerinin kendi standardizasyon engel olsa son on yılda, pek çok farklı 3D kültür sistemleri, 5-8 kurulmuştur. Ayrıca 3D sistemler genellikle işlemek ve 2D yüzeylerde mevcut deneysel işlemler kolayca 3D kültürler için kurulmuş olamaz kolay değildir. Buna ek olarak, edebiyat nadiren bu modellerde hücre davranışını doğru anlaşılmasını engelleyen, eşdeğer 2B durumu veya diğer 3D sistemlerle 3D kültürleri karşılaştırır. Bir kez 2B substrat, dorsal reseptörlerinin uyarılması üzerine yapıştırılır hücrelere sahip - yeni bir malzeme (sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan ile - hücre hem yanıtları 3D ortamlar tetikleyebilir. reaBunun arkasında oğlu dorsal ve ventral reseptörleri yapışır ve sandviç ortamında yaymak için (Şekil 1) 9,10 hem de eş zamanlı aktivasyonu olduğunu. Bunun bir sonucu olarak, hücreler 2B kültürleri 11,12 ile ilgili olarak önemli değişimler geçirirler. Dorsal uyarım önemli hücresel yollardaki değişiklikler tetikler çünkü Böylece, hücre kaderi, çünkü sandviç kültürü montajı esnasında belirlenir. Bu nedenle, hücre kaderi yüksek sandviçe benzer kültürü 11 monte edilir zaman ile tespit edilir. Nedeniyle sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hem ventral ve dorsal tarafı böyle kimya, topoğrafya, sertlik ve protein kaplamalar gibi hücre / malzeme etkileşimleri farklı parametrelerin çalışma sağlayan basit ve çok yönlü bir araçtır. Bu, geniş bir v bağımsız olarak dorsal ve ventral kombinasyonu diğer 3D Systems (Şekil 2) göre çok yönlü bir yüksek derecesiYüzey koşullarının ariety. Buna ek olarak, farklı hücre hatları ve sandviç-benzeri kültür monte farklı zamanlarda olanakları geniş spektrumunu artan incelenebilir. Sandviçe benzer kültür standart bir protokol kullanılarak aşağıda ayrıntılı olarak, ya sırt alt tabakalar, protein kaplama olarak ventral alt-tabaka ve fibronektin gibi cam lamel gibi asit (PLLA) electrospun elyaflar ya da filmler-L-laktik poli. Sandviç gibi kültürler, sadece hücre tohumlama sonra veya 2B kültür 3 saat sonra monte edilmiştir. Bununla birlikte, diğer malzeme sistemleri ve proteinler kullanılabilir dikkat ediniz; aynı şekilde sandviç benzeri bir kültürü, farklı zaman noktalarında monte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Ploy (laktik asit)</td> <td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Kapak camları (12 mm ve Oslash;)</td><td>Marienfeld</td><td>631-0666</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Scharlab</td><td>CL0200</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Heksafloro-2-propanol (HFIP)</td> <td>Sigma</td><td>105228</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Şırınga (1 ml)</td> <td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Yeni Çağ Pompa Sistemleri</td><td>NE1000</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman Yüksek Gerilim DC Güç Kaynağı</td><td>Glassman Yüksek Gerilim</td><td>Serisi FC</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>Hucoa-Herl&ouml; s</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman Laminer akış ve başlık</td><td>Telstar</td><td>AV30 / 70</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>İnsan Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>RNeasy Mikro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI 6000</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Albümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Ara 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Reaktifi</td></tr></tbody></table>

sandviç gibi mikroçevrelerde hücre / malzeme etkileşimleri harness

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Hücre kültürü, geleneksel hücre biyo materyal yüzeyi ventral reseptörleri kullanarak uygun iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bununla birlikte, in vivo olarak, hücrelerin çoğu tamamen reseptörlerinin bir üç boyutlu (3D) dağılımı ile sonuçlanan hücre dışı matrisin (ECM) ile çevrilidir. Bu sinyal yolları dışında-ve böylece hücre davranış farklılıkları tetikleyebilir. Bu makale zaten yeni bir malzeme (bir sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan bir 2B yüzeye yapıştırılır hücrelerin dorsal reseptörlerini uyararak standart 2D kültürlere göre önemli değişiklikler tetikler olduğunu göstermektedir. Ayrıca, ventral ve dorsal reseptörlerinin aynı anda uyarma yakın 3D ortamlarda bulunan edilene hücre davranışını değiştirir. Buna ek olarak, bağlı sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hücre / malzeme inte farklı parametrelerin çalışma sağlar çok yönlü bir araçtırkasılma konsantrasyona, örneğin, topoğrafya, sertlik ve hem ventral ve dorsal kenarlarında farklı protein kaplamaları. Sandviç benzeri kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır çünkü nihayet, birkaç analiz prosedürleri zaten 3D sistemleri için gerekli daha karmaşık prosedürleri aşarak, normal olarak kullanılabilir standart 2D kültürler için geliştirilmiş.

sandviç gibi kültürün içinde dorsal reseptörlerinin uyarılması, hücre morfolojisi, hücre yapışması ve hücre içi sinyal yolları (örneğin fokal yapışma kinaz, FAK) 10-12 değişiklikleri tetikler. Diğer 3D kültürler 15,16 için görüldüğü gibi, bir örnek olarak, sandviç benzeri bir sistem içinde kültürlendi fibroblastlar, 2D göre α 5 integrin alt birimi aşın. Hücre kaderi, hidroj eller gibi diğer 3D sistemlerinde olur Benzer şekilde, sırt reseptörleri uyar...

Aşağıdaki protokol, iki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3B) hücresel ortamlar arasında bir ara aşama olarak kullanılacak sandviç benzeri kültürleri bir araya getirme prosedürünü açıklar. Tasarlanmış sistemler mikroskopi, biyomekanik, biyokimya ve hücre biyolojisi tahlillerinde uygulamalara sahip olabilir.

Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre davranışlarını fizyolojik olarak daha ilgili bir 3D ortamda incelemek amacıyla sandviç benzeri kültürler oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle ventral ve dorsal substratların fibronectin gibi proteinlerle hazırlanması ve kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, hücreler standart bir 2D kültüre benzer şekilde yerleştirilir.Ardından, hücrelerin hem ventral hem de dorsal olarak stimüle edilmesi için dorsal substrat üzerine yerleştirilir. Son olarak, yara iyileşmesi deneyi gibi deneyler gerçekleştirilebilir. Nihayetinde, sandviç benzeri kültürler; canlı görüntüleme, immünofloresan veya hücresel ekstraksiyon gibi standart 2D kültürler için önceden geliştirilmiş prosedürlerle analiz edilir.Daha ileri analizler için. Bu kültür tekniğinin mevcut üç boyutlu sistemlere göre temel avantajı; topografya, kimya, sertlik ve protein içerikleri gibi materyal etkileşimlerindeki farklı parametrelerin hem ventral hem de dorsal bölgelerde incelenmesine olanak tanıyarak yüksek düzeyde çok yönlülük sunmasıdır. Ayrıca, bazı üç boyutlu sistemlerde engellenebilen lipin analizi, immünofloresans ve hücresel ekstraksiyonlar gibi deneysel prosedürler kolayca gerçekleştirilebilir. Solvent döküm yöntemiyle düz bir polilaktik asit veya PLLA film üretmek için, çeker ocak altında çalışarak, 100 mililitre kloroformun içine iki gram PLLA ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık üç saat boyunca veya tamamen çözünene kadar karıştırın.Paslanmaz çelik pulları cam bir petri kabına yerleştirin. Ardından, pulların içine 200 µL PLLA çözeltisi ekleyin. Kabın üzerini birkaç deliği olan alüminyum folyo ile kapatın ve PLLA'nın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça buharlaşmasını sağlayın.Ardından, çözücü kalıntılarını uçurmak için numuneleri 120 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. Daha sonra numunelerin oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika soğumasını bekleyin, numunelerin üzerini kaplamak için kapta 18.2 mega ohm cm su kullanın ve oda sıcaklığında sekiz dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, pulları Petri kabından ayırmak için bir jilet kullanın.Ardından, pulların kenarındaki tüm kusurları temizlemek için cımbız kullanın ve örneklerin havada kurumasını bekleyin. PLLA hidroliz yoluyla bozunabildiği için, örnekleri deney gününe kadar vakumlu bir desikatörde saklayın. Ayrıca, ELLA lifleri metin protokolüne uygun olarak üretilebilir ve steril bir kültür kabini altında dorsal substrat olarak kullanılabilir.Protein kaplamasının ardından, örneklere kalsiyum ve magnezyum içeren PBS veya DPBS içerisinde 20 µg/mL FI nin ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Örnekleri iki kez yıkamak için DPBS kullanın ve bir sonraki aşamaya hazır olana kadar kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS içerisinde saklayın. Cam lameller üzerine hücreleri ekleyin ve hücrelerin substrata tutunmasını sağlamak için 37 °C'de %5 karbondioksit ile üç saat boyunca inkübe edin. Ardından örnekleri 12 kuyucuklu bir plakanın yeni kuyucuklarına aktarın.Cımbız kullanarak, dorsal substratı hücrelerin üzerine dikkatlice yerleştirin. Ardından bir mililitre besiyeri ekleyin. Pulun ağırlığı, dorsal substratın yüzmesini önleyecektir.Sandviç benzeri kültür içinde hücre göçünü incelemek için örnekleri %5 karbon dioksit ile 37 derece Celsius'a geri getirin ve ortamı haftada iki kez değiştirin. Daha önce gösterildiği gibi ventral ve dorsal substratları fibronektin ile kapladıktan sonra, hücreleri yüksek yoğunlukta cam lameller üzerine ekleyin, örnekleri inkübe edin ve hücrelerin konfluense ulaşmasını sağlayın. Ardından, bir boşlukla ayrılmış iki hücre popülasyonu oluşturmak için hücre tek tabakasını bir pipet ucuyla çizin.Ventral yerleşimli substratı, zaman aşımı (time-lapse) görüntülemesine uygun ve dorsal substratların içine sığabileceği kadar büyük olan yeni bir kuyucuğa yerleştirin. Ardından, daha önce gösterildiği gibi cımbız kullanarak, dorsal substratı hücrelerin üzerine kapatın ve ortamı tekrar doldurun. Numuneyi bir zaman aşımı mikroskobuna yerleştirin ve boşluk kapanmasının görüntülerini her 20 dakikada bir yakalayın.Sandviç kültürdeki boşluk kapanmasını analiz etmek için Image J'den mito BO gibi bir yazılım kullanın. Sülfat, dorsal reseptörlerin stimüle edildiği zamana ve dorsal etkileşimin özelliklerine yüksek derecede bağımlıdır.Burada görüldüğü gibi, örneğin hidrojeller gibi diğer 3D sistemlere benzer şekilde, dorsal elektro eğirme PLLA fiberleri fibronektin ile kaplandığında hücre hizalanmasını yönlendirirken, BSA gibi yapışkan olmayan bir proteinle kaplandığında bunu yapmaz. Ayrıca, düz dorsal PLLA içeren sandviç benzeri kültürler, C2C12 hücreleri kullanılarak miyogenez seviyesinde bir artışı tetiklemiştir. Bu durum aynı zamanda dorsal biyolojik uyarılara da bağlıdır.Bu videoda gösterildiği üzere, farklı dorsal proteinlerle etkileşim farklı farklılaşma oranlarıyla sonuçlandığından, bir yara iyileşmesi deneyinde sandviç benzeri kültür içinde göç eden fibroblastlar, 3D fibronektin ve kolajen jellerine benzer 2D substratlarda kültüre edilen hücrelere kıyasla daha uzamış bir morfoloji benimser ve daha kısa mesafeler katederler. Sandviç benzeri kültürleme, 2D koşullarına kıyasla hücre aracılı ECM yeniden organizasyonunu artırır.Bu süreç, dorsal mekanik uyaranlara ve hücre iskeleti stabilitesine dayanmaktadır. BLE'ler veya statin gibi kontraktilite inhibitörlerinin kullanımı bu süreci engellediği için S. Tamam, bu videoyu izledikten sonra, sandviç benzeri kültürlerin nasıl oluşturulacağı konusunda net bir anlayışa sahip olmanız gerekir. Bu yöntem; hastalık modelleri, gelişim çalışmaları ve ilaç testleri dahil olmak üzere rejeneratif tıp ve kanser için 3D benzeri mikroortamlar tasarlamakta kullanılabilir.

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makale, mikrometre ölçeğinde yapışık hücreleri arasındaki hücre-hücre etkileşimleri dinamik düzenlenmesi için deneysel bir yaklaşımı açıklar. Manipülasyon, hepatosit ve stromal hücre arasındaki hücrelerarası iletişimi gösterilmiştir. Geliştirilen platform geliştirme ve patogenezinde de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerin, hücre-hücre etkileşimleri soruşturma sağlar.

Hücre hücre Etkileşim kurgulama için Silikon mikroçipler

Biz, bir substrat üzerindeki istenilen noktada hücre yerleştirmek için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntem desen hücreleri yüzeye hücreleri ile dolu mikro oyukların içeren bir silikon çip saygısız. Bu yöntem yayılabilir ve juxtacrine hücreleri arasındaki sinyal modüle etmek için yeni bir yol sağlar.

Bio Flip-Chip kullanarak Embriyonik Kök Hücreler, Desenlendirme

Biz hücreleri ve embriyolar incelemek için bir cihaz ve yeni bir yöntem sunulmuştur. Tek hücreler tam microcavity dizileri sıralanır. Onların 3D hapsi fizyolojik koşullarda karşılaşılan 3D ortamlarda yolunda atılmış bir adımdır ve organel yönünü verir. Hücre şekli kontrol ederek, bu kurulum standart deneylerde bildirilen değişkenlik en aza indirir.

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Akışkan bileşenlerle entegre edilmiş mikro fabrikasyon cihazlar, in vivo mikro ortamı taklit eden hücre çalışmaları için in vitro bir platform sağlar. Tek veya bir arada bulunan kimyasal/elektriksel/kesme gerilimi uyaranları altında hücresel tepkileri incelemek için polimetilmetakrilat bazlı mikroakışkan çipler geliştirdik.

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Bu makalede, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi taklit eden vivo içinde hücresel microenvironments fiziksel ve kimyasal yüksek üretilen iş manipülasyonu ipuçları ve için hazırlamak için ayrıntılı metodolojisi insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için en iyi hücresel ortam tek hücreli profil oluşturma ile tanımlayın.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Geleneksel olarak, hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamını in vivo olarak zayıf bir şekilde taklit eden düzlemsel substratlar üzerinde gerçekleştirilir. Burada, fizyolojik olarak ilgili kavisli geometrilere ve mikro desenli hücre dışı proteinlere sahip hücre kültürü substratları üretmek için bir yöntem tanımladık ve bu hücre dışı ipuçlarının hücresel olarak algılanmasına sistematik araştırmalara izin veriyoruz.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Öğrenin sandviç benzeri kültürlerle hücre davranışlarını 3D ortamda nasıl inceleneceğini. Fibronektin kaplı substratlar kullanarak yara iyileşmesi ve canlı görüntüleme uygulamaları gerçekleştirin.

Sandviç gibi mikroçevrelerde Hücre / Malzeme Etkileşimleri Harness

Daha fazla video keşfet