Name: İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Keşfedin, insan meme epitel hücrelerinde hormon duyarlı 3D kültür modeli kullanarak meme kanseri tedavileri için önemli bilgiler sağlayan bu standartlaştırılmış yöntemi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz büyük ölçüde Cheryl Schaeberle tarafından editoryal katkıları için teşekkür ederiz. Bu araştırma Avon Hibe # 02-2009-093 ve 02-2011-095 ve AMS NIEHS / NIH ES 08314 tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Reaktiflerin 1. Hazırlık <ol><li> 10 -3 M stok solüsyonlar yapmak üzere, sentetik progesteron promegeston (R5020) ve etanol 17 β-estradiol (E2) içinde çözülür. 1 mg / ml stok çözelti yapmak için damıtılmış, deiyonize su içinde prolaktin eritin. 10 -2 M stok çözelti yapmak için DMSO içinde antiöstrojen ICI 182.780 eritin. en fazla 6 ay süreyle -20 ° C&#39;de bu çözümleri saklayın. </li><li> Kömür dekstran (CD) serum ve CDFBS orta elimden: <ol><li> 30 dakika boyunca 57 ° C su banyosu içinde cenin sığır serumu (FBS) ısı etkisiz hale getirirler. Not: kullan Bu protokolün geri kalanı için sadece asitle yıkanmış cam. </li><li> ihtiyaç duyulan kömür miktarını hesaplayın. , Kömür nedeniyle yerinden telafi% 5 ağırlık / hacim toz kömür aktif tartmak serum miktarının% 10&#39;undan fazla hacim kullanma. </li><li> serum miktarı aynı hacim kullanılarak soğuk deiyonize distile su ile iki kez kömür yıkayın. Her yıkama ckömür pelet 2 dakika 50 xg&#39;de entrifuge. yıkar arasında su çıkarmak. Son karbon pelet,% 0.5 ağırlık / hacim Dekstran T-70 ekleyin. 5 dakika boyunca 100 x g&#39;de damıtılmış, iyonu giderilmiş su ve santrifüj ile yeniden askıya. su aspire. </li><li> pelet serum uygun hacim kazandırmak ve serum içine kömür dekstran pelet yeniden askıya. 60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de, (6 RPM) hareket ettirirken, inkübe edin. 20 dakika boyunca 2,000 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant bulutlu görünürse, santrifüj tekrarlayın; Ancak, serum, şu anda tamamen net olmayabilir ama filtrasyon sırasında temizlenecektir. </li><li> Daha büyük parçacık maddenin ayrılması için 0.45 mikronluk bir filtreden sonra tekrar 0.80 mikronluk bir filtreden filtre edilir ve. Son olarak, 0.20 mikron filtre ile filtre sterilize edin. Mağaza -20 ° C&#39;de cam tüpler ya da T-25 kültür şişelerinde CDFBS süzülür. </li><li> Kömür Dekstran fetal ortamı (CDFBS ortamı) Sığır içeren Soyulmuş: fenol kırmızısı içermeyen DMEM 375 ml ve DMEM 125 ml karışımı/ F-12. 37.5 ml çıkarın ve Kömür Dextran Stripped Fetal Sığır serum aynı hacimde ile değiştirin. 2 mM nihai bir konsantrasyona kadar 10 6 U / ml penisilin ve L-glutamin ekleyin. Elde edilen ortam% 75 DMEM,% 25 DMEM / F-12,% 7.5 kömür dekstran soyulmuş FBS, 2 mM L-glutamin ve 10 6 U / ml penisilin. </li></ol></li><li> 10X PBS, 1 N NaOH ve damıtılmış iyonu giderilmiş su hazırlayın. gerekli kollajen çözüm hacmine göre her yeterli hacim hazırlayın. filtreleme bütün çözümleri sterilize edin. 1 aya kadar 4 ° C &#39;de 10 x PBS ve steril damıtılmış iyonu giderilmiş su saklayın. 1N NaOH çözeltisi tutmayın. </li><li> Üretici tarafından sağlanan &quot;Kollajen I, fare kuyruk için alternatif Jelleşme Prosedürü&quot; protokolüne göre 1 mg / ml nihai konsantrasyonda, kolajen çözeltisi hazırlayın. Her bir kolajen jel çözeltisi, 1.5 ml yapılmıştır. Örneğin hazırlanması için kollajen çözeltisi (pipetleme sırasında hasar hesaba 0.5 mi) 18.5 ml hazırlanması12 jeller. hemen kollajen çözümü kullanın veya en fazla 2-3 saat buz üzerinde tutun. </li><li> Carmine Şap boya: <ol><li> 500 ml damıtılmış su içinde 1 gr Carmine ve 2.5 g alüminyum potasyum sülfat birleştirin. 20 dakika boyunca karıştırılarak kaynatılır. üzerine kaynar önlemek için dikkatle izleyin. Ek damıtılmış su ile geri 500 ml son ses seviyesini ayarlayın. </li><li> antimikrobiyal aktivitesi için timol bir kristal ekleyin ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile bir şişe kapağı. Her kullanımdan önce, bir laboratuvar sınıfı kağıt filtre içinden filtre ediniz. en fazla üç ay süreyle karmin çözümü tekrar kullanın. Oda sıcaklığında, ışıktan korunmalıdır. </li></ol></li><li> Kolagenaz çözelti: a / h% 0.125&#39;lik bir konsantrasyonda DMEM / F12 ortamı içinde kolajenaz çözülür. Bu çözüm tutmayın. </li></ol> Sıçan Kuyruk Kollajen Tip 1 jeller ve Hormon Tedavisi 2. 3D Kültür T47D hücreleri Not: 4 ° C&#39;de steril serolojik pipetler ve pipet uçları tutun. <ol><li> PrepaBir tek hücre süspansiyonu tekrar ve hücre sayımı gerçekleştirin. Bölünmüş T47D hücre kültürleri onlar% 70 izdiham ulaşmadan. gerekli hücrelerin miktarını içeren birim santrifüj. bir jel yaklaşık 75.000 T47D hücreleri içermesi gerektiğini düşünün. </li><li> Soğuk pipet kullanarak, kollajen, uygun hacimde hücre pelletini yeniden askıya. Her bir kolajen jel 1.5 ml oluşur düşünün. kabarcıkları almaktan kaçınması yavaşça hücreleri ve kollajen karıştırın. </li><li> , Hücre dağılımı üzerinde statik elektriğin etkisini önlemek plaka unwrapping sonra bir statik düşürücü fırça ile 12 plaka sınırları, üst ve alt fırçalayın. başlık çalışma yüzeyi ile temas sırasında statik yük birikmesini önlemek için, statik düşürücü brush.Gently fırçalanmış edilmiş bir 12-çukurlu bir tablaya (boş levha) üzerine, bu plaka yerleştirmek karışımı 1.5 ml dökün 12 oyuklu plakanın her oyuğuna. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka plaka koyun. th kaldıre inkübatör plaka ve kaputu geri yerleştirin. </li><li> P200 steril ucu kullanarak, dikkatle kuyunun sınırına yumuşak dairesel hareketlerle jel ayırın. bir jel kuyunun dibinden ayırmak gerekir. </li><li> CDFBS medya seyreltilir hormonlar oyuklara ilave edin. 10 7 M son konsantrasyonda bir bir 10 -10 M son konsantrasyon ve prolaktin E2 ve R5020 kullanın. Kontrol olarak, katma hormonların ama hala kullanılan hormon stoklarının eşit DMSO yüksek ses içeren olmadan CDFBS ortamını kullanın. Her iyi medya 1.5 ml içerdiğinden emin olun. 37 ° C,% 5 CO2,% 100 içinde 3B kültürleri yerleştirin nem doku kültürü inkübatör. her 2 günde bir ortam değiştirme, 1 ya da 2 hafta kültür koruyun. </li></ol> Tüm Mounts 3. Jel İşleme <ol><li> Kültür ortamını çıkarın ve her bir oyuğa, PBS, 1.5 ml ekleyin. </li><li> Bir slayta jel aktarın. Bir eğrisi kullanılarak yarısında jel kestid cerrahi bıçak. yarısı ile işleme devam edin ve histolojik analiz için diğer yarısını kaydedin. </li><li> Bütün bir slayt monte yarım jel aktarın. 5 dakika boyunca jel kurumaya bırakın ve daha sonra% 10 formalin içeren bir coplin kavanoza slayt aktarın. Not: Bütün inkübasyonlar oda sıcaklığında yapılmalıdır. </li><li> Bir sallama O / N bir coplin kavanoza jeller sabitleyin. </li><li> Yıkama çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri için iki kez PBS ile. Aktarım% 70 EtOH için slaytlar; çalkalayıcı üzerinde 1 saat süreyle inkübe edin. Carmine Şap O / N Transfer slaytlar. </li><li> Bir sonraki gün, 1 saat için her% 70 EtOH,% 95 EtOH ve% 100 EtOH içinde bir karıştırıcı üzerinde slaytlar dihidrat. Transferi iki kez 1 saat her ksilen ve çalkalayıcı üzerinde tutmak için slaytlar. jeller ve 1.5 mm kalınlığında lamelleri monte toluen bazlı montaj ortamı kullanın. </li><li> Düzenli ışık (mikroskop veya stereoskop) kapsamında tüm bağlar inceleyin. şekil ve lümen daha ayrıntılı bir analizi için konfokal mikroskopi kullanımı ve HeNe 633 nm lazer ile Carmine boya görselleştirmek. </li></ol>Histoloji Analiz İşleme 4. Jel İşleme <ol><li> % 10 formalin içeren 20 ml&#39;lik bir cam şişeye jel kalan yarısı aktarın ve çalkalama O / N üzerine sabitlenir. </li><li> çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri için iki kez PBS ile jeller yıkayın. parafine için işlem kasetleri içine yerleştirin jeller. </li><li> % 70 EtOH transfer jeller, 1 saat boyunca inkübe edilir ve 1 saat için% 95 EtOH ile izleyin, 1 saat boyunca, taze% 95 EtOH değiştirmek,% 100 EtOH, 1 saat ve 1 saat süre ile, taze% 100 EtOH değiştirin. 1 saat boyunca, taze ksilen içinde yeniden Bu noktada, jeller oda sıcaklığında% 100 EtOH O / N depolanabilir ya 1 saat süreyle ksilen ile inkübe edilir ve. </li><li> Aktarım kasetleri iki kez daha fazla taze parafin ile tekrar vakum inkübatöründe 60 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca Parafin. </li><li> temiz parafin ile plastik kalıp doldurun. , Kaseti açın jel çıkarın ve plastik kalıp içeren parafin yerleştirin. parafin ile doldurun ve üstüne etiketi içeren kasetin üst eklemek ve blok soğumaya bırakın. </li><li> plast kaldıric kalıp ve bölüm mikrotom kullanılarak blok. HE boyama ve immünsitokimya 5 um kalınlığında kesitler elde edin. </li></ol> Kollajenaz muamelesi kullanılarak jellerden hücreleri hücreleri 5. Ekstraksiyon <ol><li> kuyudan jel çıkarın ve PBS içeren bir petri tabağına aktarın. Durulayın jel kısaca. </li><li> % 0.125 kolajenaz 2 ml içeren 15 ml&#39;lik bir tüpe jel aktarın. küçük parçalar halinde jel kırmak için yukarı pipet ve aşağı 4-5 kez. </li><li> 25 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir (jel eritildi ve hücreler, süspansiyon içinde olan kadar) </li><li> Serum takviyeli kültür ortamında 2 ml ilave edilir. santrifüj (1.000 xg, 5 dk), ıskarta süpernatant hücreleri toplamak, hücrelerin yeniden askıya ve saymak. </li></ol>

<ol><li>Barnes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+tissues%3A+interactions+between+the+matrix+and+human+breast+cells+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time.</a> PLoS ONE. 9, e93325(2014).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen+responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Nat.Acad.Sci.USA%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture.</a> Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).</li>
<li>Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogens+stimulate+cell+proliferation+and+induce+secretory+proteins+in+a+human+breast+cancer+cell+line+%28T47D%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Endocrinol.Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D).</a> J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).</li>
<li>Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+collagen+reorganization+on+mammary+epithelial+morphogenesis+in+a+3D+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model.</a> Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).</li>
<li>Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDhimolea%2C+E+%22J.Biomed.Mat.Res.A%22">J.Biomed.Mat.Res.A</a>. 100, 2905-2912 (2012).</li>
<li>Krause, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+breast+tubulogenesis+using+extracellular+matrix+composition+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells.</a> Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).</li>
<li>Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+in+vitro.+culture+model+to+study+stromal-epithelial+interactions+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland.</a> Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).</li>
<li>Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+determines+the+breast+cancer+cells%27+phenotype%3A+organization+of+MCF7+cells+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures.</a> BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).</li>
<li>Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing-like+immune+program+facilitates+postpartum+mammary+gland+involution+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression.</a> Int.J.Cancer. , (2014).</li>
<li>Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation%3A+evidence+for+negative+control+on+estrogen-sensitive+T47D+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).</li>
<li>Speroni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+epithelial+organization+in+a+3D+breast+tissue+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model.</a> Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).</li>
<li>Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiestrogenic+effect+of+R5020%2C+a+synthetic+progestin+in+human+breast+cancer+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Endocrinol.Metab%22%5BJournal%5D)">Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture.</a> J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, hormonların meme epiteli üzerindeki etkisini test etmek için hormona duyarlı bir 3D kültür modeli açıklıyoruz. Hormonlara yanıt, doku morfolojisi, hücre proliferasyonu ve gen ekspresyon seviyelerinde değerlendirilebilir 12. Bu tekniğin bir sınırlaması, kültürler plastik bir alt plakada büyütüldüğü için kültür periyodu boyunca görselleştirmenin ışık mikroskobu ile sınırlı olmasıdır. 3D kültür sistemi, kültürlerin canlı görüntülenmesine izin vermek için cam alt plakalara uyarlanabilir 1.
<...

standart 2D kültürlerin aksine, 3D hücre kültürü vekil modelleri fizyolojik ilgili bağlamda, biri doku andıran epitel hücre davranış çalışma için izin verir. meme bezi 3D kültürleri meme bezi gelişimi ve neoplazi birçok açıdan aydınlatmak yardımcı olmuştur. Ancak, şu anda mevcut 3D kültür modellerinin en görev için kullanılan insan epitel hücre hatları hormon reseptör ifadesini 6,7,9 eksikliği nedeniyle hormon etkisini incelemek için uygun değildir. Bu yazıda, hormon etkisini 12 incelemek için uygundur insan meme epitel 3D kültür modeli açıklanmaktadır. Bu model, ilk olarak göğüs infiltratif duktal karsinom olan 54 yaşındaki bir kadın hastadan elde edilen bir plöral efüzyonundan elde edilmiştir ticari olarak temin edilebilen hormon duyarlı insan meme epitelyal hücre kuşağı, T47D 3,11,13 kullanır. Bir matris olarak fare kuyruk kolajeni tip 1 kullanın. Bu 3D kültURE modeli insan meme epitelyal hücreleri üzerinde üç mammotropic hormon (estradiyol, promegeston (progesteron bir analog) ve prolaktin) etki çalışma için uygundur. Hormon oluşan epitel morfolojisi morfometrik analizi 12 zamanla miktar olarak tespit edilebilir. Uygun tohum yoğunluğu, bu 3D kültürler 2 hafta muhafaza edilmesini sağlar. Bu zamana kadar, yapıların geliştirilmesi epitel morfolojisi üzerinde hormon eylem sağlam bir nicel değerlendirilmesi için yeterlidir. Jeller, hücre proliferasyonu için daha önceki zaman noktalarında toplandı edilebilir ve gen ekspresyonu analizi. Buna ek olarak, bu model sıralı bir hormon tedavisinin etkilerini test etmek için uygun olan; örneğin, bir hafta boyunca hormonların diğer hormon / kombinasyonu ile ilk haftasında estradiol ile muamele değiştirildikten sonra. örneğin ICI 182.780 olan östrojenik bileşikler ve antiöstrojenler, etkisi de stu edilebilirBu 3D kültür modeli 12 kullanılarak öldü.

<table><tbody><tr><td>12 oyuklu Doku Kültürü Plakaları (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polistiren konik Tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>Aktif Kömür</td><td>Sigma</td><td>C-5510</td><td></td></tr><tr><td>Karmin Şap</td><td>Sigma</td><td>C1022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip 3</td><td>Worthington</td><td>S0C11784</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>HeNe 633nm lazer ile donatılmış</td></tr><tr><td>Dextran T-70</td><td>Abersham / Pharmacia</td><td>17-0280-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12, HEPES, fenol kırmızısı ve nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11339-021</td><td>Hormon kullanımı için fenol kırmızısı içermeyen ortam</td></tr><tr><td>DMEM, düşük glikoz, piruvat, glutamin yok, fenol kırmızısı yok</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11054-020</td><td>Hormon kullanımı için fenol kırmızısı içermeyen ortam</td></tr><tr><td>17-&beta;-Estradiol</td><td>EMD Millipore</td><td>3301</td><td>etanol etanol içinde çözülmüş</td></tr><tr><td></td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serum</td><td>hiklonu</td><td>SH30070.03</td><td>Hormonlarla kullanım için, Kömür Dekstran soyulmuş olmalıdır&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtreler (115 ml)</td><td>Nalgene</td><td>380-0080, 245-0045, 120-0020</td><td>sırasıyla 0.88, 0.45, 0.20 mikron&n;</td></tr><tr><td>Formalin, %10</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SF93-20</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780 (fulvestrant)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4409-25MG</td><td>DMSO Mikrotomunda Çözünmüş</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>Doku gömme ortamı</td><td>McCormick Scientific</td><td>39502004</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin</td><td>Sigma</td><td>7794-10MU</td><td>10 ml damıtılmış deiyonize su içinde çözülmüş</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su pH 7.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Prolaktin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4021-50UG</td><td>Damıtılmış deiyonize suda çözülmüş</td></tr><tr><td>Promegestone</td><td>Perkin Elmer</td><td>NLP004005MG</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>Sıçan Kuyruğu Kollajeninde Çözülmüş&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354236</td><td>Lotlar farklı konsantrasyonlar içerebilir, buna göre not edin</td></tr><tr><td>Neşter Miltex</td><td></td><td>4311</td><td></td></tr><tr><td>Yarı Kapalı Tezgah Üstü Doku İşlemcisi</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>1N NaOH stoğu hazırlayın</td></tr><tr><td>StaticMaster Anti-statik fırça&nbsp;</td><td>Amstat</td><td>C3500</td><td></td></tr><tr><td>Stripette Serolojik Pipetler&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>T-25 şişeleri</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430168</tr><tr><td>Doku</td><td>Kasetleri Fisher Scientific</td><td>15-200-403E</td><td></td></tr><tr><td>Buğday Şişeleri, Cam, 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen&nbsp;</td><td>VWR</td><td>95057-822</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

İnsan meme bezi epitelinin bir hormon duyarlı 3d kültür modeli

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Meme epitel morfogenezi süreci hormonlardan etkilenir. 2D kültürler kullanılarak meme epiteli üzerindeki hormon etkisinin incelenmesi, hücre proliferasyonu ve gen ekspresyonu uç noktaları ile sınırlıdır. Bununla birlikte, organizmada, meme morfogenezi 3 boyutlu bir ortamda gerçekleşir. 3D kültür sistemleri, tek katmanlı hücre kültürü (2D) ile organizmanın karmaşıklığı arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur. Burada, hormon etkisini incelemek için uygun olan insan meme epitelinin bir 3D kültür modelini açıklıyoruz. Ticari olarak temin edilebilen hormona duyarlı insan memesi epitel hücre hattı, T47D ve sıçan kuyruğu kollajen tip 1'i matris olarak kullanır. Bu 3D kültür modeli, ana mamotropik hormonlara yanıt verir: estradiol, progestinler ve prolaktin. Bu hormonların epitel morfogenezi üzerindeki etkisi, son noktaya göre 1 veya 2 haftalık tedaviden sonra gözlenebilir. 3D kültürler, epitelyal morfogenez, hücre proliferasyonu ve gen ekspresyonunun analizi için hasat edilebilir.

Şekil 1, hormona duyarlı 3D kültürleri hazırlanması için prosedürü özetlenmektedir. Epitel yapıları yalnız E2 mevcudiyetinde 2 hafta kültürlendi ve hormonlar ile kombinasyon içinde jeller, tüm bağlar gözlenmektedir. Resim hormonlar kültür ortamında (CDFBS ortamı) (Şekil 2) eklendiğinde sadece tek hücreler veya 2-3 hücre grupları bulunmaktadır. Bu durum, bir negatif kontrol olarak hizmet etmektedir. şekil, boyut, ve lümen mevcudiyetinde farklılık 3D kültür şe...

İnsan meme epitelinin hormon etkisini incelemek için uygun bir 3D kültür modelini tanımlıyoruz.

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Fizyolojik olarak anlamlı olan bu 3D kültür yönteminin genel amacı, temel mammojenik hormonların meme epitelyal morfojenezi üzerindeki etkisini test etmektir. Bu yöntem; östrojen, progesteron ve prolaktinin meme epitelyal morfojenezini nasıl etkilediği gibi, endokrinoloji ve meme bezi biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu standartlaştırılmış yöntemin temel avantajı, hormona duyarlı meme epitelyal hücrelerinin, in vivo'da gözlemlenene benzer şekilde, hormonlara yanıt olarak 3D yapılar oluşturmasıdır.Bu teknik, insan meme epitelinin karmaşık yapısını yansıtan fizyolojik olarak uygun bir kültür sistemi olduğu için meme kanseri tedavileri açısından önem taşımaktadır. İnsan meme morfojenezinin hormonlardan nasıl etkilendiğini incelemek için standart in vitro modellerin eksikliğini fark ettiğimiz için ilk olarak bu yöntem fikrini geliştirdik. T47D hücrelerinin tek hücre süspansiyonundaki hücre sayısını sayarak başlayın.Hücrelerin korunma biçimi, hormonlara yanıt veren fenotiplerin sürdürülmesi açısından kritik öneme sahiptir. Yeni bir vial çözüldükten sonraki dördüncü pasajda ve ardından her on pasajda bir, T47D hücrelerinde deneme amaçlı yanıt kon

a-hormone-responsive-3d-culture-model-human-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Biz insan meme hormon eylem incelemek için yeni bir ex vivo modeli geliştirdik. Bu doku mimarisi, hücreler arası etkileşimleri ve parakrin sinyal korumak cerrahi göğüs doku numunesinin izole doku mikro dayanmaktadır.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Biz iki meme epitel hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon teknikleri açıklayın. Her ikisi de süt proteinleri üretmek için fetal buzağı serumu, insülin ve prolaktin gerektirirken, EpH4 hücreleri üç boyutlu kültürde mammospheres içine tam olarak ayırt edebilirsiniz. Bu tamamlayıcı modeller farklılaşma ve neoplazi sinyal iletimi çalışmaları için yararlıdır.

Fare Meme Epitel HC11 ve EpH4 Hücrelerinin Farklılaşması

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Mevcut protokol, Trombosit Aktive Edici Faktör (PAF) kaynaklı transformasyonu incelemek için modifiye edilmiş, dönüştürülmemiş bir meme epitel hücre hattı olan MCF10A'nın 3D 'üstte' kültürlerinin kurulmasını açıklamaktadır. İmmüno-floresan transformasyonu değerlendirmek için kullanılmış ve ayrıntılı olarak tartışılmıştır.

Üç Boyutlu Kültürlerde Fosfolipid Aracısı İndüklenmiş Transformasyon

Bu protokol, diferansiyel santrifüjleme yoluyla primer normal ve tümör meme dokusundan epitel organoidleri üretmek için bir yaklaşımı tartışmaktadır. Ayrıca, gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülenmesinin yanı sıra üç boyutlu kültürleme için talimatlar da dahil edilmiştir.

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.

Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem

Keşfedin, insan meme epitel hücrelerinde hormon duyarlı 3D kültür modeli kullanarak meme kanseri tedavileri için önemli bilgiler sağlayan bu standartlaştırılmış yöntemi.

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

Daha fazla video keşfet