Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, erken viral girişin belirli adımlarına karşı test bileşiklerinin antiviral etkisini belirlemektir. Bu, önce viral enfeksiyon için konakçı hücrelerin tohumlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, viral enfeksiyon ve test bileşiği tedavilerinin farklı zaman ve sıcaklıklarda gerçekleştirilmesidir.

Daha sonra, ilaçla tedavi edilen inoküller yıkanır ve hücreler bazal ortam ile kaplanır. Son adım, hücreleri inkübe etmektir. Sonuç olarak, test bileşiklerinin viral enfeksiyonun erken viral giriş adımları üzerindeki etkisini belirlemek için viral enfektivite analiz edilir.

Örneğin, bir raportör virüsün neden olduğu enfeksiyondan kaynaklanan hücre snatındaki lusiferaz aktivitesini değerlendirmek için bir luminometre kullanılır. Bu tekniğin temel avantajı, antiviral ajanların, özellikle viral girişi hedefleyenlerin tanımlanmasında daha mekanizma temelli bir yaklaşıma izin verebilmesidir. Başlamak için, önce, test kültürü için konakçı hücreleri hazırlamak üzere steril çift damıtılmış suda pozitif bir kontrol için heparini çözünen DMSO'da test bileşikleri, üçleme asidi veya CHLA ve PUNIC kollajen veya PUG'un stok çözeltilerini hazırlayın.

İnsan hepato karsinomu, FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş taze DMAM'da gece boyunca HUH 7.5 hücreleri. Test bileşiklerinin sitotoksisitesini test etmek için deney boyunca biyogüvenlik seviyesi iki prosedürü takip etmeyi unutmayın. Hücreleri, bazal ortamda seyreltilmiş sıfırdan 500 mikromolar veya negatif kontrol olarak% 1 DMSO'ya kadar artan CHLA veya PUG konsantrasyonları ile tedavi edin ve daha sonra hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 72 saat inkübe edin.

Ortamı çıkarın ve hücreleri iki kez 200 mikrolitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, 100 mikrolitre XT T tahlil reaktifi ekleyin ve üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, 690 nanometrede bir referans dalga boyu ile 492 nanometrede absorbansı belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.

Bu değerlerden belirli bir formülle canlılık yüzdesini hesaplayın. Her bileşik için% 50 hücresel sitotoksisite konsantrasyonlarını belirleyin. Viral inaktivasyon testine başlamak için.

İlk plaka, bir kez 10 ila dördüncü hücreler. 96 oyuklu bir plakada, enfeksiyona bağlanmak için hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Gaia lusiferaz raportörünü etiketli hepatit C virüsü veya HCV parçacıklarını metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın.

Steril bir tüpte 100 mikrolitre 100 mikromolar CHLA veya PUG'u 100 mikrolitre 10'a dördüncü ile karıştırın. Pozitif bir kontrol karışımı için odak oluşturma birimleri veya HCV'nin FFU'su. Mililitre başına 1000 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda heparinli HCV.

37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Üç saat sonra, virüs bileşiği karışımını oda sıcaklığında 9.8 mililitre bazal ortam ile 50 kat seyreltin. Daha sonra yeni bir virüs bileşiği karışımı hazırlayın ve bu karışımı sıfır saatlik inkübasyon numunesi için hemen bazal ortamda seyreltin.

İnkübasyon ortamını hücrelerden çıkardıktan sonra, üç kopya halinde oyuk başına 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs ilaç çözeltisi ekleyin. Çözelti şimdi, hücrelerin viral enfeksiyonuna izin vermek için üç saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübe eden Kuyu başına 10 ila ikinci FFU içerir. İnkübasyondan sonra, viral süspansiyonu kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre PBS ile nazikçe yıkayın. Iki kez.

Viral replikasyon ve lusiferaz raportörünün süpernatana salınması için hücreleri 100 mikrolitre bazal ortamda 72 saat inkübe edin. Daha sonra süpernatı kültürlerden ve mikro tüplerden toplayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin. Hücresel kalıntıları gidermek için, her bir süpernatın 20 mikrolitresini 50 mikrolitre gaussi lusiferaz tahlil reaktifi ile karıştırın ve bir luminometrede lusiferaz raportör aktivitesinden gelen lüminesansı ölçün.

Üreticinin viral bağlanma tahlil plakası talimatlarına göre, oyuk başına bir kez 10 ila dördüncü hücre. 96 oyuklu bir plakada ve ertesi sabah hücre bağlantısı için gece boyunca inkübe edin. İlk olarak, hücre tek tabakasını içeren 96 oyuklu plakayı bir saat boyunca dört santigrat derecede soğutun.

Test bileşiklerini ve virüs karışımını buz üzerinde hazırlayın. Örneğin, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V% 1 DMSO veya pozitif kontrol HCV Heparin solüsyonları ile 10 ila ikinci FFU virüsü. Her tedavi için, ortamı hücre kültürü kuyucuklarından nazikçe aspire edin.

Ardından, sıcaklığı yükseltmemeye dikkat ederek hemen üç nüktel kuyucuklara 100 mikrolitre virüs testi bileşik karışımı ekleyin. Plakayı üç saat boyunca dört santigrat derecede tutulan bir buzdolabında inkübe edin. Virüs parçacıkları hücre servisine dört santigrat derecede yapışacak, ancak içselleştirilmeyecektir.

Sonra, süpernatantları aspire edin. Hücreleri 200 mikrolitre buz gibi soğukla iki kez nazikçe yıkayın. PBS, her oyuğa 100 mikrolitre bazal ortam ekler ve daha sonra 72 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe eder.

Son olarak, enfekte olmuş hücrelerden salınan lusiferaz raportörünü ölçmek için. Her numune kuyusundan süpernatı toplayın ve viral füzyon ve girişi test etmek için Gauss Lusiferaz testini gerçekleştirin. Hücre kültürü plakasını bir saat boyunca dört santigrat derecede önceden soğutun.

Hücre bağlanması için gece boyunca inkübasyondan sonra, mevcut ortamı kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri buz üzerinde 10 ila ikinci F-F-U-H-C-V ile enfekte edin. Plakayı üç saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Reklama yapışmayan virüsü çıkarmak için hücreleri 200 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.

Daha sonra buz üzerinde, hücreleri bazal ortamda veya bazal ortamda çözülmüş test bileşikleri ile kontrol olarak% 1 DMSO ile muamele edin ve plakayı üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu, 37 santigrat derecede meydana gelen viral girişte test bileşiklerinin değerlendirilmesine izin verir. Ortamı aspire edin ve içselleştirilmemiş virüsleri 200 mikrolitre sitrat tamponu veya PBS ile iki kez yıkayın.

Oyuk başına 100 mikrolitre bazal ortam ekleyin ve 37 santigrat derecede 72 saat daha inkübe edin. Supernat'ı toplayın ve gösterilen serbest bırakılan lusiferaz raportörünü tespit etmek için daha önce gösterildiği gibi Gauss Lusiferaz testini gerçekleştirin İşte test bileşiklerinin HCV üzerindeki etkileri. Aktivasyonda, virüs, enfeksiyondan önce sıfır veya üç saat boyunca test bileşikleri ile inkübe edildi.

Viral enfeksiyonun inhibisyon yüzdesi her tedavi için çizilir. Negatif kontrollü DMSO inhibisyon göstermez. CHLA, sıfır saatlik inkübasyonun ardından ve üç saatlik daha uzun inkübasyondan sonra temas halinde yüksek inhibisyon sergiler.

Başka bir testle ek sonuçlar. Bileşik PUG burada gösterilmiştir, bu genel deneysel tasarımı uyarlayarak, CHLA ve PUG'un embriyonik akciğer fibroblastlarında insan sitomegalovirüsü veya HCMV'nin enfektivitesini ek olarak inhibe ettiği gösterilmiştir. CHLA ve PUG'un HCV ataşmanı üzerindeki etkisi burada gösterilmiştir.

Hücrelerin, test bileşiklerinin varlığında veya yokluğunda virüsle dört santigrat derecede inkübe edildiğini ve daha sonra bağlanmamış virüs hücrelerinin çıkarılmasının, virüsün neden olduğu enfeksiyon için 37 santigrat derecede inkübe edildiğini hatırlayın. Gölgeli çubuklar, C-H-L-A-P-U-G veya heparinin hücrelere HCV girişi üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu durumda, viral bağlanmanın ilk olarak dört santigrat derecede gerçekleştirildiğine dikkat edin.

Daha sonra, bağlanmamış virüsü çıkardıktan sonra, hücreler viral giriş için 37 santigrat derecede test bileşikleri ile inkübe edildi. Benzer şekilde, HCMV durumunda, embriyonik akciğer fibroblastlarının CHLA veya PUG ile tedavi edilmesi, viral bağlanma ve viral girişin güçlü bir şekilde inhibisyonunu gösterir. Bu prosedürü denerken, sonuçların doğruluğunu etkileyecek olan adımları belirtilen sıcaklıkta gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.