Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, test bileşiklerinin erken viral girişin belirli aşamalarına karşı antiviral etkisini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle viral enfeksiyon için konak hücrelerin ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise viral enfeksiyonu ve test bileşiği uygulamalarını farklı zamanlarda ve sıcaklıklarda gerçekleştirmektir.

Ardından, ilaçla tedavi edilmiş inokülümler yıkanarak uzaklaştırılır ve hücrelerin üzerine bazal besiyeri eklenir. Son adım ise hücrelerin inkübe edilmesidir. Nihayetinde, test bileşiklerinin viral enfeksiyonun erken viral giriş basamakları üzerindeki etkisini belirlemek için viral enfektivite analiz edilir.

Örneğin, bir raporlayıcı virüs ile enfeksiyondan sonra hücredeki lusiferaz aktivitesini değerlendirmek için bir lüminometre kullanılır. Bu tekniğin temel avantajı, antiviral ajanların, özellikle de viral girişi hedefleyenlerin belirlenmesinde daha mekanizma odaklı bir yaklaşıma olanak tanımasıdır. Başlamak için öncelikle test bileşiklerinin stok çözeltilerini, trilogy acid veya CHLA ve PUNIC collagen veya PUG'u DMSO içinde hazırlayın; pozitif kontrol için heparin'i steril çift distile su içinde çözün ve analiz için konak hücreleri kültürleyin.

İnsan hepatokarsinom HUH 7.5 hücrelerini FBS ve antibiyotikler ile desteklenmiş taze DMAM içerisinde gece boyunca bekletin. Test bileşiklerinin sitotoksisitesini test etmek için deney boyunca biyogüvenlik seviyesi iki prosedürlerini takip etmeyi unutmayın. Hücreleri, bazal medium ile seyreltilmiş sıfırdan 500 micromolar'a kadar artan konsantrasyonlarda CHLA veya PUG ile veya negatif kontrol olarak %1 DMSO ile muamele edin ve ardından hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe 37 degrees Celsius'de 72 saat boyunca inkübe edin.

Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri iki kez 200 µL PBS ile yıkayın. Ardından, 100 µL XT T assay reaktifi ekleyin ve 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, 690 nm referans dalga boyuyla 492 nm'deki absorbansı belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.

Bu değerleri kullanarak verilen formül ile canlılık yüzdesini hesaplayın. Her bir bileşik için %50 hücresel sitotoksisite konsantrasyonlarını belirleyin. Viral inaktivasyon deneyi ile başlayın.

İlk plaka için, kuyucuk başına 1x10⁴ hücre ekleyin. Enfeksiyon için hücrelerin yapışması amacıyla, hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO₂ içeren bir 96 kuyucuklu plakada gece boyunca inkübe edin. Metin protokolünde belirtildiği şekilde, Gaia lüsiferaz raporlayıcı etiketli hepatit C virüsü veya HCV partiküllerini hazırlayın.

Pozitif kontrol karışımı için steril bir tüpte, 100 µL 100 µM CHLA veya PUG'u, 10⁴ fokus oluşturucu birim (FFU) HCV içeren 100 µL ile karıştırın. HCV'yi nihai konsantrasyonu 1000 µg/mL olacak şekilde heparin ile karıştırın.

37 °C'de üç saat boyunca inkübasyon yapın. Üç saatten sonra, virüs bileşiği karışımını oda sıcaklığında 9,8 mL bazal besiyeri ile 50 kat dilüye edin. Ardından yeni bir virüs bileşiği karışımı hazırlayın ve sıfırıncı saat inkübasyon örneği için bu karışımı hemen bazal besiyerinde dilüye edin.

İnkübasyon medyumu hücrelerden uzaklaştırıldıktan sonra, her kuyucuğa üç tekrar halinde 100 µL seyreltilmiş virüs ilaç çözeltisi ekleyin. Çözelti şu an kuyucuk başına 10² FFU içermektedir; hücrelerin viral enfeksiyona uğraması için 37 °C ve %5 CO₂ ortamında üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, viral süspansiyonu kuyucuklardan uzaklaştırın ve hücreleri 200 µL PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.

Viral replikasyon ve lüsiferaz raporunun süpernatana salınımı için hücreleri 100 µL bazal medyuma 72 saat boyunca inkübe edin. Ardından kültürlerden ve mikro tüplerden süpernatı toplayın ve 4 °C'de beş dakika boyunca 17.000 ×g hızda santrifüjleyin. Hücresel döküntüleri uzaklaştırmak için, her bir süpernatın 20 µL'sini 50 µL gaussi lüsiferaz analiz reaktifi ile karıştırın ve lüsiferaz rapor aktivitesinden kaynaklanan lüminesansı bir lüminometrede ölçün.

Viral tutunma deneyi plakası için üretici talimatlarına göre, 96 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 1 × 10⁴ hücre ekleyin ve hücrelerin tutunması için gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, hücre monokatmanı içeren 96 kuyucuklu plakayı bir saat boyunca 4 °C'de soğutun.

Test bileşiklerini ve virüs karışımını buz üzerinde hazırlayın. Örneğin, 1%DMSO içeren H-C-V-C-H-L-A-H-C-V veya 10² FFU virüs içeren pozitif kontrol HCV Heparin çözeltileri. Her işlem için, hücre kültürü kuyucuklarındaki besiyerini nazikçe aspire edin.

Ardından, sıcaklığı artırmamaya dikkat ederek, her bir örneği üç tekrarlı kuyucuklara 100 µL virüs test bileşiği karışımı şeklinde hemen ekleyin. Plakayı dört derece Celsius sıcaklıkta tutulan bir buzdolabında üç saat boyunca inkübe edin. Virüs partikülleri dört derece Celsius'ta hücre yüzeyine tutunacak ancak hücre içine alınmayacaktır.

Ardından, süpernatanları aspire edin. Hücreleri iki kez 200 µL buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. Her kuyucuğa 100 µL bazal besiyeri ekleyin ve ardından 37 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin.

Son olarak, enfekte hücrelerden salınan lusiferaz raporcunun miktarını belirlemek için; her bir örnek kuyucuğundan supernatı toplayın ve viral füzyon ve girişi değerlendirmek için Gaussian Lusiferaz testi uygulayın. Hücre kültür plakasını bir saat boyunca dört derece Celsius'ta ön soğutmaya tabi tutun.

Hücrelerin yapışması için yapılan gecelik inkübasyonun ardından, kuyucuklardaki mevcut besiyeri çıkarın ve hücreleri buz üzerinde 10² F-F-U-H-C-V ile enfekte edin. Plakayı üç saat boyunca dört derece Celsius'ta inkübe edin. Yapışmamış virüsleri uzaklaştırmak için hücreleri 200 µL buz gibi soğuk PBS ile nazikçe iki kez yıkayın.

Ardından, buz üzerinde hücreleri bazal ortamda çözünmüş test bileşikleriyle veya kontrol olarak %1 DMSO içeren bazal ortamla muamele edin ve plakayı 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Bu işlem, 37 °C'de gerçekleşen viral girişi üzerindeki test bileşiklerinin etkisinin değerlendirilmesine olanak tanır. Ortamı aspire edin ve içselleştirilmemiş virüsleri 200 µL sitrat tamponu veya PBS ile iki kez yıkayın.

Kuyu başına 100 µL bazal medyum ekleyin ve 37 °C'de 72 saat daha inkübe edin. Süpernatantı toplayın ve salınan lusiferaz raporunu tespit etmek için daha önce gösterildiği gibi Gaussian Lusiferaz analizini gerçekleştirin. Test bileşiklerinin HCV üzerindeki etkileri burada gösterilmiştir. Aktivasyonda, virüs enfeksiyondan önce sıfır veya üç saat boyunca test bileşikleri ile inkübe edilmiştir.

Her bir işlem için viral enfeksiyon inhibisyon yüzdesi grafiğe dökülmüştür. Negatif kontrol DMSO inhibisyon göstermemektedir. CHLA, sıfır saatlik inkübasyon sonrası temas anında ve üç saatlik daha uzun inkübasyonun ardından yüksek inhibisyon sergilemektedir.

Başka bir testle elde edilen ek sonuçlar. Bu genel deneysel tasarım uyarlanarak; bileşik PUG burada gösterilmiş olup, CHLA ve PUG'un embriyonik akciğer fibroblastlarında insan sitomegalovirüsünün veya HCMV'nin enfektivitesini ek olarak inhibe ettiği gösterilmiştir. CHLA ve PUG'un HCV tutunması üzerindeki etkisi burada gösterilmektedir.

Hücrelerin, test bileşiklerinin varlığında veya yokluğunda virüsle dört derece Celsius'ta inkübe edildiğini ve ardından bağlanmamış virüsün uzaklaştırılmasının ardından virüs enfeksiyonu için 37 derece Celsius'ta inkübe edildiğini hatırlayın. Gölgeli çubuklar, C-H-L-A-P-U-G veya heparinlerin HCV'nin hücrelere girişine etkisini göstermektedir. Bu durumda, viral bağlanmanın öncelikle dört derece Celsius'ta gerçekleştirildiğine dikkat edin.

Ardından, bağlanmamış virüsler uzaklaştırıldıktan sonra hücreler, viral giriş için 37 °C'de test bileşikleriyle inkübe edildi. Benzer şekilde, HCMV durumunda, embriyonik akciğer fibroblastlarının enfeksiyonunun CHLA veya PUG ile tedavisi, viral tutunma ve viral girişte güçlü inhibisyon göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, sonuçların doğruluğunu etkileyecek olan adımların belirtilen sıcaklıkta gerçekleştirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.