Name: Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster'dan mitokondriyal zenginleştirilmiş kesirler hazırlayarak metabolomik analizlerde hassasiyeti artırma yöntemini. Bu teknik, ince metabolik değişiklikleri tespit etmeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Adelphi Üniversitesi fakülte geliştirme hibesi ve EVC'ye verilen NIGMS'den hibe R15GM113156, NIGMS'den hibe R01GM067862 ve DMR'ye verilen NIA'dan hibe R01AG027849 tarafından desteklenmiştir.

1. Reaktifler ve Çözümleri <ol><li> Sinek gıda ve medya hazırlanması <ol><li> Isı uçucu bileşenler 90 ° C &#39;ye ayarlanmış bir ocak su içinde ağırlık / hacim olarak% 0.79 agar% 11 şeker,% 2 otolize uğramış mayası,% 5.2 mısır unu. Homojen biraz yoğun karışım elde edilinceye kadar düzenli olarak karıştırın. Her bir yiyecek kalkan 5 ml ile 100 şişelerde bir toplam uçucu gıda 550 ml&#39;lik bir nihai hacim hazırlayın. </li><li> Isıtma cihazından çıkar Gıda aşağı 80 ° C&#39;ye gelene kadar zaman karışması ve% 95 etanol,% 0.2 tegosept-metil 4-hidroksibenzoat ekleyin. </li><li> Iki eşit hacimlerde gıda bölün. Diğer hacim etanol, 50 mM bir hacme kadar etanol rapamisinin 1,1 ml 1,1 ml ilave edilir. Rapamisini ve gıda içine etanol çözümleri karıştırın. Sıcaklık ilaçlar eklemeden önce 50 ° C&#39;ye düşer emin olun. </li></ol></li><li> İzolasyon Tampon <ol><li> İzolasyon Tamponu [225 mM Mannitol, 75 mM sakaroz, 10 mM 3- (N &lt;500 ml hazırlayın/ em&gt; morfolino) propansülfonik asit (MOPS) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 2.5 mg / ml sığır serumu albümini (BSA)] su içinde. </li><li> Sodyum hidroksit kullanarak pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. Başlangıç ​​pH&#39;ı asidik olacaktır. </li><li> Solüsyonu sterilize etmek ve 4 ° C de saklamak için 0.22 um gözenek boyutuna sahip olan steril filtre depolama şişeler kullanın. </li></ol></li><li> Yıkama Tamponu <ol><li> Yıkama tampon maddesi [225 mM Mannitol, 75 mM sakaroz, 10 mM KCI, 10 mM Tris HCI ve 5 mM KH 2 PO 4] su içinde 500 ml hazırlayın. </li><li> Sodyum hidroksit kullanarak pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. Başlangıç ​​pH&#39;ı asidik olacaktır. </li><li> Solüsyonu sterilize etmek ve 4 ° C de saklamak için 0.22 um gözenek boyutuna sahip olan steril filtre depolama şişeler kullanın. </li></ol></li></ol> Drosophila SUŞLARINDA 2. Yetiştirme <ol><li> , Gelişim sırasında larva yoğunluğu kontrol bir kültür şişe ebeveynlerin 25 çift yerleştirmek ve onları 48 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin vermek için. </li> &lt;li&gt; Yumurta yoğunluğunu düzenlemek için 48 saat sonra anne çıkarın. </li><li> Yineleyin ortaya çıkan F1 yavru kullanarak 2.1 ve 2.2 adımları, bu nedenle bu yoğunluk kontrolü iki kuşak elde edilir. </li><li> Yetişkin toplamak için, karbondioksit (CO2) ve cinsiyete göre ayrı kullanarak sinekler uyutmak. <ol><li> 5 psi sürekli bir akış bir yüksek basınçlı tanktan teslim saf CO 2 tek aşamalı regülatör kullanın. Statik elektriği önlemek için, su ile balonun filtreleme 500 ml CO 2 katalize etmek için plastik boru kullanılır. </li><li> Şişeyi kapatmak için tek delikle bir lastik tıpa kullanın. CO2 pede şişenin yanal açıklığı bağlamak için plastik boru kullanın. </li><li> 10-15 dk daha fazlası için ped sinek yerleştirin. Deneysel koşullar koymadan önce 24 saat anestezi kurtarmak için izin verin. </li></ol></li><li> Mitokondriyal zenginleştirilmiş kesirler için yeterli metabolitleri oluşturmak numune başına 300 sinekler kullanın. Burada, kadın kullanın, ancak gender, diğer deneylerde farklı olabilir. Bir ev yapımı 1 L demografi kafesine 150 sinekler aktarın. Bir şişe içinde uçucu gıda 5 ml erişimine izin verir. </li><li> Başka bir 1 L kafesine geri kalan 150 sinekler aktarın. 150&#39;den fazla sinekler kafeslere overpopulate etmeyin. </li><li> Deneysel koşul başına altı çoğaltma örnekleri kullanın. Bütün hayvan ekstreleri fazla metabolitleri verim yana, bütün hayvan 1 örnek izolatlarının oluşturmak 50 kadın, bir kafes uçar aktarmak için. Mitokondriyal izolatların gelince, deneysel koşul başına altı çoğaltma örnekleri kullanın. </li><li> 12 saat ışık ve 12 saat karanlık çevrimi ile 25 ° C &#39;de yer kafesleri. </li><li> Gıda kalitesini korumak için gıda 5 ml bir şişe içinde her 2 ya da 3 gün taze yiyecek sağlamak. </li><li> 10 gün boyunca gıda sinekler koruyun. Bu adım, rapamisin tedavisi 7 için gereklidir. Diğer tedaviler veya şartlar farklı olacaktır. </li></ol> Mitokondriyal Kesirler 3. İzolasyonu <ol><li> Damperli bir içine bir kafes (150 sinekler) çıkışlı uçarCam-Teflon Dounce homojenleştirici soğutulmuş yalıtım 1 ml tampon ile doldurulmuştur. </li><li> Aşağı 15 vuruş için havaneli yukarı ve hareket ettirerek homojenleştirin. Sağlam mitokondri tutmak için buz üzerinde harç tutmak. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de, 1.5 ml tüp ve santrifüj transfer homojenat. </li><li> Mitokondri için zenginleştirmek için 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj süpernatan ve al. </li><li> Süpernatant sitozolik fraksiyonu içerdiğinden, süpernatant atın veya alternatif deneyler için kullanabilirsiniz. Yıkama tamponu 300 ul pelletini. </li><li> İkinci kafes için 3,5 - 3,1 tekrarlayın adımları. Bir kriyojenik mikrosantrifüj tüpü içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş, her iki kafesleri pelet birleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın ve sıvı azot içinde pelet flash dondurma. </li><li> -80 ° C veya daha düşük bir sıcaklıkta mitokondriyal zenginleştirilmiş kısımlar saklayın. <ol><li> Alternatif olarak, bütün hayvan öncesi içinTerkip, bir kriyojenik mikrosantrifüj tüp içinde yetişkin yerleştirin. C veya daha düşük sıcaklıkta -80 ° sıvı azot ve mağaza erişkinlerde şişeyi Flash dondurma. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheffler%2C+IE+%22Mitochondria+%28Scheffler%2C+Mitochondria%29%22">Mitochondria (Scheffler, Mitochondria)</a>. , Wiley-Liss. 484(2007).</li>
<li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria--a+nexus+for+aging%2C+calorie+restriction%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li>
<li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology%3A+stress+signals+from+the+energy+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li>
<li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+evolution%2C+changes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li>
<li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+Meaning+of+Life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life</a>. 368, Oxford University Press. USA. (2006).</li>
<li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+international+journal+of+organic+evolution%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li>
<li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li>
<li>Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%C3%97G%C3%97E+for+Lifespan+in+Drosophila%3A+Mitochondrial%2C+Nuclear%2C+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).</li>
<li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254(2014).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer%3A+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li>
<li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020(2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokolde en kritik adımlar şunlardır: 1) bol uzayda yeterli sinekler yetiştirme. 150&#39;den fazla sinekler her biri demografi kafesleri overpopulate değil çok önemlidir; 2) sık sık gıda rekabeti ve beslenme stresi önlemek için kafes gıda değişen; ve 3), 4 ° C &#39;de, tüm numuneler muhafaza mitokondriyal fraksiyonunun izolasyonu sırasında bütünlüğünü sağlamak için. Ayrıca yalıtım tamponu, yıkama tamponu ve kullanımdan önce kullanılan cam teflon homojenleştirici soğuk Dounce tavsiye edilir. Zenginleştirilmiş mitoko...

Bu prosedürün amacı, Drosophila melanogaster&#39;in kullanılmasının metabolomiks çalışmalar için yeterli mitokondriyal metabolitleri elde zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar geliştirmektir. Bizim tecrübelerimize göre, tüm hücresel çıkarma yöntemlerini kullanarak metabolomik analiz Drosophila ince mitokondriyal metabolit değişikliklerini tespit edemiyoruz. Ancak önceki metabolomik analiz mitokondriyal fraksiyon mitokondriyal metabolit vardiya tanımlamak için hassasiyetini artırır. Mitokondri hücreleri normal fonksiyon 1 için gereken enerjinin% 90 sağlanmasından sorumlu hücresel organellerdir. Son yıllarda bu mitokondrinin sadece adenozin trifosfat (ATP) üretmek daha hücresel ve organizma işlevi çok daha dinamik bir rol oynayabilir ve şimdi metabolik homeostazı 2,3 düzenlenmesi için hub olarak tanınan kabul edilmiştir. Mitokondri dis olan bir endosimbiyotik işleminin sonucudurTinct mikrobik soy 1,5 milyar yıl önce 4 ~ birleşti. Mitokondri gerçek organellere haline gibi, endosymbiont gelen genler ortaya çıkan nükleer genomu dahil edildi. 37 gen oksidatif fosforilasyon 5 enzim komplekslerinin alt birimleri olan mitokondriyal proteinleri kodlayan 13 olan mtDNA, kalırken hayvanlarda bugün yaklaşık 1.500 mitokondriyal proteinlerin, nükleer kodlanmış bulunmaktadır. Mitokondri ve nükleer bölmeleri arasında koordinasyon düzgün mitokondriyal fonksiyonunu korumak için gereklidir. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak mitokondriyal ve nükleer genomlarındaki arasındaki koordinasyon manipülasyon sonucu Drosophila mitokondriyal metabolik değişiklikleri tespit etmek mümkün. Biz hangi mtDNA D. kardeş türünden Drosophila bir yük kullanılan simulans tek D. yerleştirildi Nükleer arka plan 6 melanogaster. Bu &quot;kesintiye &#39;mitonuclearGenotip D. &#39;doğal&#39;, ya da ko-evrimleşmiş mitonuclear genotip ile karşılaştırılmıştır kendi doğal D. ile aynı nükleer genomu taşıyan melanogaster mtDNA melanogaster. D. melanogaster ve D simulans mtDNAs 100 ~ tarafından amino asitler ve mitonuclear iletişim 7,8 etkileyen&gt; 500 eşanlamlı değiştirmelerin farklıdır. Biz farmakolojik strese yanıt olarak metabolit vardiya çalışmak için tüm sinek özleri ve mitokondriyal zenginleştirilmiş özleri üretti. Burada mitokondrial zenginleştirilmiş kesirler kullanırken biz D. taşıyan yerli, eş-evrim genotip arasındaki mitokondriyal metabolitleri belirgin değişimler tespit olduğunu göstermektedir melanogaster mtDNAs ve D. taşıyan kesintiye genotip simulans mtDNA. Buna karşılık, bu iki genotipleri arasındaki metabolit değişiklikleri tüm sinek özü kullanan, normal yöntemlerle ince olur. Bu nedenle, bu yöntem mtDNAs mitokondriyal değişiklikler arabuluculuk nasıl anlamak için bir yol sağladıFarklı ilaçlara yanıt.

<table><tbody><tr><td>% 0.2 tegosept-metil 4-hidroksibenzoat</td><td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>3- ( N -morfolino) propansülfonik asit (MOPS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>38057&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO 4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>sinekleri uyuşturmak için CO2 pedleri</td><td>Tritech Araştırma</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>1 L kafes</td><td>Web Restoran Mağazası</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>1 L kafes kapağı</td><td>Web Restoran Mağazası</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>bir cam-teflon dounce homojenizatör&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>rapamisin ve nbsp;</td><td>LC Laboratuvarları&nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>anti-porin</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa tübülin</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti &nbsp;</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO2 ped</td><td>Tritech Research, Inc</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>filtre şişesi</td><td>enasco</td><td>SB08184M</td><td></td></tr><tr><td>kauçuk tıpa</td><td>enasco</td><td>S08512M</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolik analiz mitokondriyal zenginleştirilmiş kesirler hazırlanması<em&gt; drosophila</em

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitokondri amino asit metabolizmasında, karbonhidrat metabolizmasında ve yağ asidi oksidasyonunda rol oynadığından, mitokondriyal fonksiyondaki kusurlar genellikle bu karmaşık hastalıklardan muzdarip olanların yaşamlarını tehlikeye atar. Mitokondriyal metabolik değişikliklerin saptanması, mitokondriyal bozuklukların ve farmakolojik ajanlara mitokondriyal yanıtların anlaşılması için hayati önem taşır. Mitokondriyal metabolizma metabolik düzenlemenin merkezinde yer almasına rağmen, mitokondriyal metabolizmadaki ince değişikliklerin tespiti, tüm organizma veya tüm doku ekstraksiyonları kullanılarak elde edilen diğer sitozolik metabolitlerin aşırı temsili ile engellenebilir. 
Burada, Drosophila'da tam sinek ve mitokondriyal zenginleştirilmiş preparatlar arasında belirgin mitokondriyal metabolik değişiklikleri tespit eden bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntemin hassasiyetini göstermek için, genetik olarak çeşitli mitokondriyal DNA'ları (mtDNA) barındıran bir dizi Drosophila kullandık ve bunları rapamisin ilacına maruz bıraktık. Bu yöntemi kullanarak, rapamisinin mitokondriyal metabolizmayı mitokondriyal-genotipe bağlı bir şekilde değiştirdiğini gösterdik. Bununla birlikte, bu değişiklikler, metabolitlerin mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonlardan ekstrakte edildiği metabolomik çalışmalarda çok daha belirgindir. Buna karşılık, tüm doku ekstraktları, mtDNA'lardan bağımsız olarak sadece rapamisin ilacının aracılık ettiği metabolik değişiklikleri tespit etti.

Protokol Yukarıda açıklandığı kullanarak, farklı mtDNAs 7 rapamisin ilacın etkisini test etmek için, mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonları ve bütün hayvansal özler üzerine metabolomic analizi yapıldı. Biz sinek gıda ilaç çözerek rapamisinin 200 mcM teslim etti. Sinekler için 10 gün rapamisin maruz bırakılmıştır. Bütün uçucu ekstrelerinden ve mitokondriyal ekstrelerinden metabolitleri standart çözücü çıkarma yöntemleri kullanarak gaz kromatografisiyle kütle spektro...

Mitokondri, metabolizma ve homeostazın düzenlenmesinde merkezi rol oynar. Organizma fizyolojisini etkileyen mitokondriyal metabolizmadaki ince değişikliklerin tüm organizma metabolomik çalışmalarında tespit edilmesi zor olabilir. Burada, Drosophila melanogaster'deki ince metabolik değişimlerin tespitini geliştiren bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz.

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila melanogaster kullanılarak metabolomik çalışmalar için yeterli miktarda mitokondriyal metabolit sağlayan zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar elde etmektir. Bu, öncelikle mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonlar için yeterli metabolit üretecek miktarda sinek yetiştirilerek gerçekleştirilir. İkinci adım olarak sinekler, mitokondriyal bütünlüğe zarar vermeden hücre membranını parçalayan cam Teflon downs homojenizatöründe homojenize edilir.Ardından, zenginleştirilmiş mitokondriyal örnekler elde etmek amacıyla homojenatlar diferansiyel santrifüjasyona tabi tutulur. Sonuçlar, mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonlar ve tüm hayvan ekstraktları üzerinde tamamen tabanlı metabolomik analizler kullanılarak tespit edilemeyen belirgin mitokondriyal metabolik değişikliklerin bu protokol kullanılarak tespit edildiğini göstermektedir. Bu prosedürün tüm sinek metabolomik analizine göre temel avantajı, metabolomik analiz öncesinde mitokondrilerin izole edilmesinin, hassasiyeti artırması ve mitokondriyal metabolit kaymasının tespit edilmesine olanak sağlamasıdır.Deneye başlamak için, sinek yem malzemelerini bir ısıtıcı plaka üzerinde 90 °C'de

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, insan embriyonik kök hücreleri mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri jel faaliyet deneyleri kullanarak nasıl analiz edilebilir size gösterecektir.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Biz maya mitokondri arıtma için hızlı ve etkili bir yöntem...

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Bu işlem yetişkin fare beyin mitokondri ilişkili ER membranlar veya MAM ve MAM ve mitokondriyal hazırlıkları glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain fraksiyonları izole etmek için nasıl göstermektedir.

Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM&#39;lerle): Fare Beyin izolasyon

Mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin analizi, mitokondriyal işlevselliğin düzenleyici mekanizmalarının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Canlı ve sabit Drosophila yumurtalıklarında mitokondriyal yapı ve fonksiyonu incelemek için özel yöntemler bu yazıda açıklanmış ve gösterilmiştir.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi Drosophila Yumurtalıklar

Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Bu iletişim kuralı, Drosophila larva metabolomic GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak açıklar.

Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Burada, PINK1B9-null mutant meyve sineklerinde biyoenerjetik analiz etmek için yüksek çözünürlüklü bir respirometri protokolü sunuyoruz. Yöntem, Substrat-Bağlayıcı-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolünü kullanır.

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Öğrenin, Drosophila melanogaster'dan mitokondriyal zenginleştirilmiş kesirler hazırlayarak metabolomik analizlerde hassasiyeti artırma yöntemini. Bu teknik, ince metabolik değişiklikleri tespit etmeyi kolaylaştırır.

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması

Daha fazla video keşfet