Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila melanogaster kullanılarak metabolomik çalışmalar için yeterli miktarda mitokondriyal metabolit sağlayan zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar elde etmektir. Bu, öncelikle mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonlar için yeterli metabolit üretecek miktarda sinek yetiştirilerek gerçekleştirilir. İkinci adım olarak sinekler, mitokondriyal bütünlüğe zarar vermeden hücre membranını parçalayan cam Teflon downs homojenizatöründe homojenize edilir.

Ardından, zenginleştirilmiş mitokondriyal örnekler elde etmek amacıyla homojenatlar diferansiyel santrifüjasyona tabi tutulur. Sonuçlar, mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonlar ve tüm hayvan ekstraktları üzerinde tamamen tabanlı metabolomik analizler kullanılarak tespit edilemeyen belirgin mitokondriyal metabolik değişikliklerin bu protokol kullanılarak tespit edildiğini göstermektedir. Bu prosedürün tüm sinek metabolomik analizine göre temel avantajı, metabolomik analiz öncesinde mitokondrilerin izole edilmesinin, hassasiyeti artırması ve mitokondriyal metabolit kaymasının tespit edilmesine olanak sağlamasıdır.

Deneye başlamak için, sinek yem malzemelerini bir ısıtıcı plaka üzerinde 90 °C'de ısıtın. Karışım homojen ve hafifçe yoğunlaşana kadar düzenli olarak karıştırın. Yemi ısıtma kaynağından alın ve yem 80 °C'ye soğuduğunda ara ara karıştırarak içine 95%Ethanol içinde çözünmüş 0.2%TE decept methyl four hydroxy benzoate ekleyin; ardından, yemi iki eşit hacme bölün.

Yiyecek sıcaklığının 50 °C'ye düştüğünden emin olun; birinci hacme etanolde çözünmüş 1,1 mL 50 mM rapamisin, ikinci hacme ise 1,1 mL işlem görmemiş etanol ekleyip karıştırın. Erişkinleri toplamak için yüksek basınçlı bir tanktan saf karbondioksit iletmek üzere tek kademeli bir regülatör kullanın. Beş psi'lık sürekli bir akışta, karbondioksiti su üzerinden kabarcıklandıracak borularla 500 mL'lik bir filtre balonuna iletmek için plastik bir tüp kullanarak statik elektrik oluşumunu önleyin.

Bunu yapmak için, flaskı mühürlemek amacıyla tek delikli bir kauçuk tıpa kullanın. Gelişim sırasında larva yoğunluğunu kontrol etmek için flaskın yan açıklığına plastik bir boru bağlayıp bunu bir karbondioksit pedine bağlayın. Bir kültür şişesine 25 çift ebeveyn yerleştirin ve 48 saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin.

Ardından, yumurta yoğunluğunu düzenlemek için ebeveynleri uzaklaştırın ve bu yoğunluk kontrolünü iki nesil boyunca gerçekleştirmek için çıkan F1 yavrularını kullanarak bu adımları tekrarlayın. Yoğunluk kontrollü koşullar altında iki nesil geçtikten sonra, sinekleri ped üzerinde 10 ila 15 dakikadan fazla tutmadan cinsiyetlerine göre ayırın. Sinekleri deneysel koşullara yerleştirmeden önce, anesteziden etkilerinin geçmesi için 24 saat bekleyin.

Mitokondriyle zenginleştirilmiş fraksiyonlar için yeterli metabolit üretmek amacıyla örnek başına 300 sinek belirleyin. 150 sineği ev yapımı bir litrelik bir kafese aktarın. Ardından kalan 150 sineği ayrı bir bir litrelik kafese aktarın ve kafeslerin 150 sinekten fazla sayıda sinekle aşırı doldurulmamasına dikkat edin.

Her deneysel koşul için altı tekrarlı örnek kullanın ve drosophila yetiştirme işlemini tamamlamak için kafesleri 25 °C sıcaklıkta, 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde tutun. Yem kalitesini korumak için toplam 10 gün boyunca, her iki veya üç günde bir sineklere, beş mL yem içeren bir vial içinde taze yem sağlayın. Sinekleri, bir mL soğutulmuş izolasyon tamponu ile doldurulmuş cam Teflon uçlu bir homogenizöre aktararak izolasyon işlemine başlayın.

Ardından, mitokondrilerin bütünlüğünü korumak için havanı buz üzerine yerleştirin ve sinekleri 15 darbe ile homojenize edin. Eziciyi döndürmemeye dikkat ederek homojenatı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü 4 °C'de beş dakika boyunca 300 ×g hızda santrifüjleyin. Süpernatantı farklı bir tüpe aktarın ve mitokondrileri zenginleştirmek için süpernatantı 4 °C'de 10 dakika boyunca 6.000 ×g hızda santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra,le sitozolik fraksiyonu içeren süpernatantı atın. Peleti, 300 microliters yıkama tamponu içinde pipetle yukarı aşağı çekerek yeniden süspanse edin. Önceki adımları ikinci cage gyro için nazikçe tekrarlayın.

Ardından, her iki kafesin resüspande edilmiş peletlerini kriyojenik bir mikro santrifüj tüpünde birleştirin ve birleştirilmiş peletleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 6.000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti sıvı azot içerisinde şok dondurun. Son olarak, mitokondri ile zenginleştirilmiş fraksiyonları -80 °C'de saklayın.

Bu western blot, mitokondriyal fraksiyonlarda mitokondrilerin etkili bir şekilde ayrıldığının bir göstergesi olan mitokondriyal membran taşıma proteini poin'in zenginleşmesini göstermektedir. Poin proteinile sitozolik fraksiyonlarda saptanamazken, sitozolik bir mikrotübül proteini olan tubulin proteini mitokondriyal fraksiyonda saptanmamıştır; bu da sitozolik protein kontaminasyonunun minimum düzeyde olduğunu kanıtlamaktadır. Temel bileşen analizleri veya PCA; kütle spektrometrisi analizinden elde edilen, Bradford protein konsantrasyonuna göre normalize edilmiş, logaritmik olarak dönüştürülmüş ve her bileşik için gözlemlenen minimum değerlerle budanmış değerler kullanılarak oluşturulmuştur.

PCA grafikleri, tüm metabolit profilleri kullanılarak oluşturulmuştur. Standart tüm sinek ekstraktı ile elde edilen doğal ve bozulmuş sinek suşlarının mitokondriyal DNA metabolit profilleri bir PCA grafiği ile karşılaştırılabilir. Mitokondriyal olarak zenginleştirilmiş ekstraktlardaki metabolitlerin PCA grafiğinde, metabolit profilleri PC eksen iki boyunca tamamen ayrılmakta ve rapamisin tedavisinin temel etkilerini yansıtmaktadır. Alternatif M-T-D-N-A genotipleri arasında sadece hafif farklar bulunmaktadır.

Buna karşılık, mitokondriyal zenginleştirilmiş ekstraktlardan elde edilen metabolit profilleri; normal besinle beslenen doğal M mt DNA genotipi ile diğer üç örnek (rapamisin ile beslenen doğal MTD NA ve normal veya rapamisin besinle beslenen alternatif MTD NA) arasında bir ayrım göstermektedir. Bu durum, alternatif MTD NA etkisinin, metabolit profillerini rapamisin tedavisinin etkilerine benzer şekilde kaydırdığını göstermektedir. Bu protokol uygulanırken, tekrarlar arasındaki değişkenliği azaltmak için tüm ekstraksiyon işlemlerinin aynı gün yapılması önerilmektedir.

Numune hazırlama kalitesini artırmak için önceden bir plan hazırlanmasını, tüplerin etiketlenmesini ve tekrarlar arasındaki bekleme kayıtlarının tutulmasını önereceğim.