Name: Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Keşfedin bimoleküler floresan tamamlama ve fotoaktive yerelleştirme mikroskobu ile tek molekül çözünürlüğünde protein etkileşimlerini görüntülemeyi. Bu yöntem U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini nanometre ölçeğinde analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, yararlı tartışmalar için Dr. Steven Chu ve Joe W. Gray'e, BiFC-PALM projesindeki ilk çalışması için Henry Marr'a ve teknik yardımı için Alexis Shoemaker'a teşekkür eder. Bu çalışma, OHSU'dan X.N.'ye başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir. Nan laboratuvarındaki araştırmalar ayrıca NIH 5U54CA143836-05, Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı, MJ Murdock Charitable Trust ve FEI şirketi tarafından da desteklendi.

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+From+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li>
<li>Lasserre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raft+nanodomains+contribute+to+Akt%2FPKB+plasma+membrane+recruitment+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.</a> Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53, 285-298 (2012).</li>
<li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+As+a+Membrane-Organizing+Principle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle.</a> Science. 327 (5961), 46-50 (2009).</li>
<li>Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+nanoswitches+generate+high-fidelity+Ras+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+Localization+Microscopy+with+Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC-PALM%29+for+Nanoscale+Imaging+of+Protein-Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells.</a> PloS one. 9 (6), e100589(2014).</li>
<li>Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+photoactivated+localization+microscopy+for+mapping+single-molecule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics.</a> Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).</li>
<li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+complementation%3A+an+emerging+tool+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).</li>
<li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+human+cell+lines+with+Tetracycline-inducible+%28Tet-on%29+shRNA+or+cDNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+March%22%5BJournal%5D)">Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression.</a> J. Vis. Exp. March. (73), e50171(2013).</li>
<li>Robida, A. M., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+of+inducible+protein+interactions%3A+effects+of+factors+affecting+protein+folding+on+fluorescent+protein+fragment+association%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association.</a> J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+biosensors+based+on+dimerization-dependent+fluorescent+protein+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange.</a> Nat. Methods. 12 (3), (2015).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D(2001).</li>
<li>Morrison, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+frozen+bacterial+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preparing frozen bacterial stocks.</a> Curr. Protoc. Immunol. Coligan, J. E., et al. Appendix 3, Appendix 3M(2001).</li>
<li>Campeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+viral+system+for+expression+and+depletion+of+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells.</a> PloS One. 4 (8), e6529(2009).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Deschout, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+and+accurately+localizing+single+emitters+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+intracellular+diffusive+states+and+transition+rates+from+single-molecule+tracking+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data.</a> Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+and+tracking+of+protein%E2%80%93protein+interactions+in+sub-diffraction+cellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space.</a> Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).</li>
<li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+reveals+structural+features+of+EB1+in+microtubule+plus-end+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking.</a> Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

PALM sağlam biyolojik örneklerin nano ölçekli sokulmuşlardır son tek bir molekül superresolution mikroskopi tekniği ise BiFC, tespit ve hücrelerde PPIs görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik, olmuştur. PALM ile BiFC kombinasyonu nanometre mekansal çözünürlükte ve tek bir molekülün duyarlılığı ile bir hücrenin içinde PPİ seçici görüntüleme elde etti. BiFC PALM her iki tekniğin yararını uzanır ve bu çalışmada gösterildiği gibi, kendi ana hücresel bağlamda PPİ moleküler ayrıntıları ortaya büyük olacağını ...

Protein-protein etkileşimleri (PPİ) biyoloji 1 için temel olan ve sıkı birçok zaman ve uzunluk ölçeklerinde genelinde zamanmekansal mekanizmalar üzerinden düzenlenir. Hücre zarı üzerinde hücre sinyal ile ilgili çalışmalar, örneğin, belirli bir PPIs ve hücresel süreçlerin 2 kolaylaştıran dinamik nano ölçekli mekansal bölmeleri göstermektedir. Bu nedenle, yeterli mekansal ve zamansal çözünürlükte, yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyet ile biyolojik sistemlerde PPIs prob yeteneği biyoloji mekanistik anlayış ulaşmanın anahtarıdır. 5 - Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) hücre içi çözünürlük ve canlı hücre uyumluluğu 3 bir hücreye PPIs görselleştirmek için birkaç mevcut araçlardan biridir. Tekniği oldukça basit ve iki floresan olmayan parçalara bir floresan proteininin yarma içerir; genetik iki etkileşen proteinlere etiketlendi zaman veyakınına getirildiğinde, fragmanları, flüoresan sinyali verecek şekilde tam bir floresan protein oluşturmak üzere sulandırmak olabilir. Doğru tasarlandığında, BiFC probları kendiliğinden PPİ yokluğunda sulandırmak gerekir. Bunun gibi, bir BiFC tahlilinde floresan sinyali sadece yüksek özgüllük ile PPİ doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan PPİ varlığında ortaya çıkacaktır. Okuma olarak floresan kullanmanın ek yararlar diğerleri arasında yüksek verimlilik ve yüksek içerik tarama deneyleri, yüksek hassasiyet, subsellüler çözünürlük ve uyumluluk. Bu faydalar, farklı üst floresan proteinleri göre BiFC probları bir dizi geliştirilmiştir. Geleneksel ışık mikroskopisi göre tüm diğer algılama teknikleri gibi, ancak, BiFC uzaysal çözünürlüğü ışık difraksiyonu ile ~ 250 nm ile sınırlıdır. Bu lipit sallar 6 a göre daha önce değindiğim ve örneklendiği gibi, nano, at PPİ düzenlenmesini incelemek için bunu bir meydan okuma yaparnd Ras nanokümeler 7, örneğin sinyalizasyon gibi birçok hücresel süreçleri anlamak için kritik bir uzunluk ölçektir. BiFC PPIs 10 görüntülenmesi için mekansal çözünürlükte bu sınırı aşmak için fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) 8,9 ile kombine edilmiştir. PALM stokastik aktivasyonu ve tek flüoresan moleküllerinin subdiffractive lokalizasyonu ile floresan görüntüleme kırınım sınırı atlatır son superresolution mikroskopi tekniğidir. Her bir aktivasyon çevriminde, bir flüoresan molekül birkaç bin fotonlara birkaç yüz verir ve dedektör üzerinde tek bir molekülün bir görüntüye yol açmaktadır. Görüntü kırınım sınırlı olsa da (~ genişliği 250 nm) olarak, ağırlık merkezi, tipik olarak tespit edilen fotonların sayısına bağlı olarak 10-50 nm mertebesinde, daha yüksek hassasiyet ile tespit edilebilir. Aktive ve numunedeki her floresan molekülü lokalize ederek, yüksek çözünürlüklü bir görüntü yeniden inşa edilebilir. Performecanlı hücreler üzerinde d tek bir hücreden 11 protein difüzyon yörüngeleri binlerce tek bir molekül izleme (smt-) PALM ileri izin edinimi. Önemlisi, PALM stokastik aktivasyonunu elde etmek için bu tür ışıkla aktive floresan proteinleri (PA-FP) gibi özel flüoresan millerini kullanır. BiFC ve PALM kullanım floresan proteinleri hem beri onlar amino asitler 159 ve 160 arasında iki parça halinde, PALM için PAmCherry1, yaygın olarak kullanılan bir PA-FP bölerek kombine edilmiştir. Bölünmüş PAmCherry1 dayalı BiFC sistemi iki parçalarının kendiliğinden sulandırıldıktan düşük arka plan sinyalini gösterir. Genetik olarak etkileşen proteinlerin bir çift etiketli, iki fragman (RN = 1-159 kalıntıları RC = Met + kalıntıları 160-236) da 37 ° C &#39;de ve daha düşük sıcaklıklarda kuluçkaya olmadan PAmCherry1 proteinleri oluşturmak için etkin bir şekilde yeniden, burada Böyle ebeveyn mCherry 13 gibi diğer BiFC çiftleri 12 için durum böyle değil. Furthermoyeniden yeniden PAmCherry1 proteini gibi doğru tek bir molekül lokalizasyonu ve yüksek çözünürlüklü PALM görüntüleme için kritik olan diğerleri arasında yüksek kontrast oranı, orta foton verimi ve hızlı fotoaktivasyon gibi ana PAmCherry1 ait Fotofiziksel özelliklerini korudu. Bu protokolde, split PAmCherry1 (Şekil 1A) kullanarak U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntüleme için BiFC PALM kullanılması tarif edilmektedir. İlk adım PAmCherry1 fragmanları (örneğin, RN ve Re) ve ilgili proteinler arasındaki füzyon proteinleri ifade etmek için yapıları tasarlamaktır. Teorik olarak, aday protein (A ve B) her çifti için, füzyon proteinlerinin sekiz çifti, test edilecek vardır: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; ve A-RC / B-RN. Bu süreç genellikle dikkate aday proteinlerin yapısal veya biyokimyasal özellikleri alarak basitleştirilmiş olabilir. Ras&#39;ın bir durumda, proteintranslasyon sonrası C-terminal CAAX kutusunun modifiye (C = Cys; A = alifatik, X = herhangi bir), ve bundan sonra AAX motifi kesilir. Bu nedenle, RN RC yalnızca Ras&#39;ın N-terminine kaynaşmış olabilir; Bu dört (Şekil 1B), füzyon proteini çiftlerinin sayısını azaltır. Raf için domain Ras bağlayıcı (RBD; artıkları 51-131) kullanılır ve her iki uçta etiketlenmiş olabilir. Bu dört füzyon konfigürasyonları elde edilmiştir: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; ve RC-KRAS / Raf RBD-RN. Buna ek olarak, fragmanlar ve ilgi proteinleri arasındaki bağlayıcı olarak kabul edilmesi gerekir. Yaklaşık on amino asit esnek bir bağlayıcı genellikle tamamlama oluşması için yeterli özgürlüğü sağlar olarak kullanılır. Çoklu bir klonlama bölgesinin (MCS) 14 elde edilen rasgele diziler dahil olmak üzere, başarılı bir şekilde uygulanmıştır diğerleri, olmasına rağmen böyle bir bağlayıcı (GGGGS) x2. Bağlayıcıların uzunluğu dependin optimize edilmesi gerekebilirilgi proteinlerin ve yönelimleri etkileşim boyutuna g. PAmCherry1 fragmanları MCSS yan küçük bir klonlama omurgası içerdiği (Malzeme listesi). Söz konusu genler sınırlama siteleri yoluyla, ya da bir ligasyon bağımsız yöntemi ile yerleştirilebilir. Klonlama ve Sekans doğrulama sonrasında, ekspresyon kaseti, bir yeniden bağlayıcı reaksiyonlar, yüksek aslına uygunluk ve yüksek verimlilik ile bir klonlama işlemi kullanılarak bir ekspresyon vektörüne transfer edilir. Daha sonra, elde edilen sentezleme konstruktları hedef hücre hattı enfekte etmek için sabit bir hücre serisi isteniyorsa, lentivirüs içine paketlenmiş, hedef hücre hattına transfekte veya edilir. Geçici transfeksiyon BiFC yapılandırmasının hızlı doğrulama için sağlar, ancak potansiyel problemler dikkat edilmelidir. Genellikle kimyasallar kullanarak Transfeksiyon yüksek otofloresans sonuçlanan hücreleri vurgular; ise toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobik kullanımıpy PPİ hücre zarındaki yer alırken aydınlatma hacmi, TIRF idealini sınırlayarak bu arka plan sinyalini azaltmak olabilir. Buna ek olarak, geçici nakiller genellikle çok PPIs saptanmasında eserler neden endojen proteinlerin aşan, protein ekspresyonunun yüksek seviyeleri yol açar. Bu nedenle, uygun bir BiFC yapılandırması ilk test ile belirlenmiştir sonra kararlı hücre soyları kurulmuştur önerilir. Stabil hücre hatları da doksisiklin indüksiyonu 15 vasıtasıyla ayarlanabilir ekspresyon için potansiyele sahiptir. Enfeksiyondan sonra, hücreler tipik haliyle puromisin ve her bir yapı için neomisin, bir antibiyotik kullanılarak seçilir. Numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi için bir sonraki adım protokoller detaylı olarak tarif edilecektir. Bu yaklaşımla, Ras-Raf RBD BiFC PALM görüntülerde nano kümelerin oluşumu rutin görülmektedir (Şekil 2A &lt;/ strong&gt;). Sürekli, Ras-Raf RBD smt-PALM yörüngeleri difüzyon devletler (Şekil 2B-D) heterojen bir dağılım gösterir. Bu sonuçlar, Ras-Raf kompleksleri potansiyel biyolojik etkileri olan, muhtemelen monomerlerin ve kümeleri gibi, hücre zarı üzerinde birden fazla eyalette mevcut olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, geleneksel BiFC, floresan co-lokalizasyon veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile elde etmek zor olurdu nanometre uzamsal çözünürlük ve tek bir molekülün duyarlılık, hücrelerin içinde PPİ seçici görüntülenmesinde BiFC PALM gücünü gösteriyor. BiFC deneyler tasarlama ve sonuçları yorumlama, bu BiFC süreci bölünmüş PAmCherry1 dahil çoğu durumda, geri dönüşümsüz akılda tutmak önemlidir. Iki parça bir araya ve tam bir PAmCherry1 protein, iki parça arasındaki bağlantı oluşturabilir ve sonra bu şekilde PPI kalıcı olur. Bu BiFC ve BiFC-PAL kullanımını sınırlamaktadırPPI dinamiklerini (örneğin, bağlayıcı bir kinetik olup oluşturulduğu bir kez protein kompleksinin difüzyon dinamikleri) izlenmesi için ve zaman zaman M da PPI komplekslerinin mislocalization yol açabilir. BiFC PALM deney tasarlama floresan proteinleri doğasında vardır kromofor olgunlaşmasında gecikme olduğunda ek bir faktör dikkate. İki protein etkileşim ve FP fragmanları bir araya gelip, onlar genellikle saniye (EYFP 3 60 saniyelik yarı zamanlı) mertebesinde yeniden katlayın. Ancak, sonraki kromofor olgunlaşma ve flüoresan sinyal dakika mertebesinde gelişir. Floresan bölünmüş Venüs, hızlı bir katlama YFP varyant sulandırılmasından sonra 10 dakika içinde tespit edilebilir iken, genel olarak olgunlaşması için yarı-zamanı genellikle yaklaşık 60 dakika 16. Split-PAmCherry1 benzer fiyat bilgisi gözlendi. Dolayısıyla, BiFC ve BiFC PALM gerçek zamanlı ÜFE kinetiği izlemek için şu anda kötü seçimlerdir; Diğer meörneğin FRET ve yeni geliştirilmiş bir dimerizasyon bağlı floresan proteini 17 gibi thods, bu amaç için daha uygun olabilir.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop çerçevesi</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X yağa daldırma TIRF objektif, 1.49 NA Nikon</td><td></td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD kamera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm lazer</td><td>Opto Engine</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm lazer</td><td>Tutarlı</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm dikroik ayna</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; Di01-R405 / 488/561 / 635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>561 nm filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-525 / 45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561 nm çentik filtresi</td><td>Semrock</td><td>NF01-405 / 488 / 568-25</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık ve CO2 kontrollü aşama</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td></tr> <tr><td>Phusion Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD Klonlama</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Klonaz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Ambalaj</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Odacıklı Kapak Camı</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td> <td># 1.5 cam alt tabaklar</td></tr><tr><td>U2OS hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T / 17 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızısı ile DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM fenol kırmızısı içermez</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Leibovit'in L-15'i, fenol kırmızısı içermez</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>İndirgenmiş serum ortamı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RB</td> Lentiviral yoğunlaştırıcı Clontech 631231 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retroviral yoğunlaştırıcı</td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>10 cm kültür çanak</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakası</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomisin</td></tr><tr><td>Doksisilin</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100 nm altın parçacıkları</td><td>BBI Çözümleri</td><td>EM. GC100</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler dereceli su</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>PCR arıtma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Midiprep kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>0.6 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tüpler</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>14 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüp</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>PCR tüpü</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC ortamı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB et suyu</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Yetkili hücreler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bimoleküler floresan tamamlama ile fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) biyoloji için anahtar moleküler olaylardır. Bununla birlikte, PPI'leri hücrelerde yeterli çözünürlük ve hassasiyetle görselleştirmek bir zorluk olmaya devam etmektedir, çünkü geleneksel ışık mikroskobunun çözünürlüğü ~ 250 nm ile kırınım sınırlıdır. Bimoleküler floresan tamamlayıcısı (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek, PPI'ler tek molekül duyarlılığı ve nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilebilir. BiFC, bir floresan proteinin floresan olmayan iki parçaya bölünmesini içeren, floresan kontrastlı PPI'leri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. PALM, fotoaktif floresan proteinler (PA-FP'ler) gibi fototransforme edilebilir floresan probları kullanan, nanometre ve tek molekül ölçeklerinde biyolojik numuneleri görüntülemek için yeni bir süper çözünürlüklü mikroskopi tekniğidir. BiFC-PALM, PALM ile uyumlu bir PA-FP olan PAmCherry1'in monomerik yapısı, iyi tek molekül parlaklığı, yüksek kontrast oranı ve stokiyometri ölçümleri için kullanışlılığı nedeniyle bölünmesiyle gösterildi. 159 ve 160 amino asitleri arasında bölündüğünde, PAmCherry1, PPI'lara yüksek özgüllük ve düşük spesifik olmayan sulandırma ile 37 ° C'de verimli bir şekilde yeniden oluşturulan bir BiFC probuna dönüştürülebilir. Ras-Raf etkileşimi, BiFC-PALM'ın nanometre ölçeğinde ve tek molekül çözünürlüğünde etkileşimleri araştırmaya nasıl yardımcı olduğunu göstermek için bir örnek olarak kullanılır. Difüzyonları, tek molekül izleme (smt-) PALM kullanılarak canlı hücrelerde de izlenebilir. Bu protokolde, BiFC-PALM için füzyon proteinleri tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken faktörler tartışılmakta, numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi adımları açıklanmakta ve birkaç örnek sonuç sergilenmektedir. Yüksek uzamsal çözünürlük, özgüllük ve hassasiyet sağlayan BiFC-PALM, BOZULMAMIŞ BIYOLOJIK numunelerde PPI'leri incelemek için yararlı bir araçtır.

Gösterilen BiFC PALM örnek Craf etki (RBD) (Şekil 1A) bağlayıcı Ras ile etkileşim Kras G12D mutant olduğunu. Tartışıldığı gibi Ras zar lokalizasyonu ve dolayısıyla biyolojik aktivitesini bozacak, çünkü, RN veya RC fragmanları Ras&#39;ın C-terminaline etiketlenmemiş. Bu dört (Şekil 1B) sekizden olası kombinasyonları azalır. Bu dört kombinasyon her lentiviral enfeksiyonu ile U2OS hücrelerine dahil edilmiştir. Protokolde ayrıntılı olarak hücreler sabitlendi ve BiFC sinyalleri PALM kurulumu...

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Bu mikroskopi tekniğinin genel amacı, proteinleri ve protein etkileşimlerini tek molekül ve nanometre ölçeğinde görselleştirmektir. Bu yöntem, onkogenik sinyalizasyon süreçlerindeki moleküler etkileşimler gibi biyoloji alanındaki bazı temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; hassas ve spesifik olmasıyla birlikte tek molekül ve nanometre çözünürlükleri sunmasıdır.Prosedür, laboratuvarımdaki kıdemli araştırma görevlisi Dr. Tahan tarafından gösterilecektir. Metin protokolüne uygun olarak RA'lar ve RAF R-B-D-P-A-M Cherry bir fragmanlarının klonlanması, viral partiküller içine paketlenmesi ve U2 OS hücrelerinin enfekte edilmesinin ardından; görüntüleme plakası hazırlamak için, sekiz kuyucuklu cam tabanlı bir hazne lamının her kuyucuğuna 350 µL fenol kırmızısı içermeyen DMEM içerisinde yaklaşık 5,5 × 10⁴ stabil ekspresyon hücresi ekleyin. Hücreleri sabitlemek için glutaraldehit ile taze paraldehit kullanın ve sabitleyiciyi PBS veya görüntüleme tamponu ile değiştirdikten sonra, görüntüleme sırasında sahne kaymasını takip etmek amacıyla 100 nm altın partiküllerini vorteksleyerek her kuyucuğa 35 µL ekleyin.Mikroskoba yaklaşın ve dekapanlar kapalıyken 405 v

photoactivated-localization-microscopy-with-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Konvansiyonel BODIPY konjugatları, geçici olarak oluşan, kırmızı-shifted yer durumu dimerlerinin sömürülmesi yoluyla canlı hücreli tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için kullanılabilir. Nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan memeli ve maya hücrelerindeki hücre altı nötr lipitleri ve yağ asitlerini izlemek ve çözmek için optimize edilmiş bir SMLM protokolü salıyoruz.

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Uygun bir sarcomere ağının oluşumu iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için önemlidir. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal olgunlaşmasının kantitatif değerlendirmesini sağlayan, kardiyak gelişimi teşvik eden kültür koşullarını iyileştirmek için süper çözünürlük temelli bir yaklaşım savuruyoruz.

Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerde α-Aktinin Ağının Analizi

Keşfedin bimoleküler floresan tamamlama ve fotoaktive yerelleştirme mikroskobu ile tek molekül çözünürlüğünde protein etkileşimlerini görüntülemeyi. Bu yöntem U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini nanometre ölçeğinde analiz eder.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Daha fazla video keşfet