Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Bu mikroskopi tekniğinin genel amacı, protein, protein etkileşimlerini tek molekül ve nanometre ölçeğinde görselleştirmektir. Dolayısıyla bu yöntem, onkojenik sinyalleme süreçlerindeki moleküler etkileşimler gibi biyoloji alanındaki bazı önemli soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hassas, spesifik olması ve tek molekül ve nanometre çözünürlükleri sunmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda çalışan kıdemli bir araştırmacı olan Dr.Tahan olacak RA'ları ve RAF R-B-D-P-A-M Cherry'yi klonladıktan sonra, viral partiküllere paketlenen ve metin protokolüne göre U2 OS hücrelerini enfekte eden parçalar. Görüntüleme plakası için bir numune hazırlamak için, sekiz kuyulu bir cam alt haznenin oyuğu başına yaklaşık 5.5 kez 10 ila dördüncü kararlı ekspresyon hücresi 350 mikrolitre fenol kırmızısı içermeyen DMEM'i kaydırın. Hücreleri sabitlemek için glutaraldehit ile taze paradehit kullanın ve fiksatifi PBS veya görüntüleme tamponu ile değiştirdikten sonra 100 nanometre altın parçacıklarını girdap haline getirin ve görüntüleme sırasında aşama kaymasını izlemek için kuyu başına 35 mikrolitre ekleyin.

Mikroskoba yaklaşın ve 405 ve 561 nanometre lazerleri açın, bu noktada panjurları kapalı tutun, 561 nanometre dikroik ayna ve çentik filtresinin yerinde olduğundan emin olun. Görüntü alma yazılımını açın. E-M-C-C-D kamerayı açın ve soğumasını bekleyin ve pozlama süresini 100 milisaniyeye ve EMCCD kazancını uygun bir değere ayarlayın.

Objektife daldırma yağı ekleyin ve numuneyi mikroskop aşaması yaşına sabitleyin. Daha sonra, parlak alan veya 561 nanometre lazer ile, RA'ları ve diğer zar proteinlerini görüntülemek için numuneyi odak noktasına getirin. 1,49 sayısal açıklığa sahip 60 x APO kromat çim objektifi kullanın ve mikroskobu çim konfigürasyonuna getirin.

Uyarma lazerini, çim objektifinin arka açıklığına çarptığında merkezden sapacak şekilde ayarlayın, bu da lazerin kapak kayma tamponuna yüze ulaştığında sapmasına neden olur. Kritik açıya ulaşılana ve lazer geri yansıtılana kadar lazer olay konumunu ayarlamaya devam edin. Görünümde birkaç altın parçacığı olan bir hücre arayın.

Ardından, yüksek ekspresyon seviyeleri nedeniyle yeterli aktivasyonun meydana gelmesi durumunda, hücreyi veya onun bir bölgesini ve altın parçacıklarını çevreleyen bir ilgi alanı ayarlayın. 405 nanometre lazer kapalı ve 561 lazer açıkken satın almaya başlayın. Aksi takdirde, 405 nanometre lazeri en düşük fabrika güç ayarında açın ve kare başına onlarca molekül olana veya tek moleküller iyi bir şekilde ayrılana kadar kademeli olarak artırın.

Veri toplama devam ettikçe, nokta yoğunluğunu kabaca sabit tutmak için 405 nanometre lazer gücünü kademeli olarak artırın. En yükseğe kadar görüntü alımına devam edin 4 0 5. Güç daha fazla başlamaz.

Etkinleştirme olayları, görüntüleri işlemek için sona erer. Görüntü işleme yazılımını indirin. MATLAB'ı açın ve WFI okuma yazılımını yükleyin.

Ham görüntü dizisini görüntüleyin ve ilgilenilen bölgeyi veya yatırım getirisini belirleyin, istenen alanın etrafında bir kutuyu sol tıklayıp sürükleyerek işlenecek yığının alanını seçin. Alım sırasında ilgilenilen bölge küçültülmediyse, bir alanın seçimini kaldırmak ve tüm çerçeveyi işlemek için hesaplama süresini kısaltmak üzere daha küçük bir alan seçin Kapak fişi üzerinde emilen altın nanoparçacıklar gibi iyi yalıtılmış, tekdüze ve şekilli ve görüntü yığını boyunca görüş alanında bulunan bir dizi güvene dayalı işaretçi tanımlamak için görüntünün yanındaki herhangi bir yere tıklayın. Resmine sol tıklayarak ve etrafına küçük bir kutu sürükleyerek bir aday altın parçacığı seçerek başlayın.

Parçacık izleme altında, izle düğmesine tıklayın. Seçilen altın parçacığının, sürüklenmenin boyutunu gösteren görüntü yığını boyunca konumunu gösteren bir grafik görünecektir. Mümkün olduğu kadar çok altın parçacığını izlemek ve birlikte izleyen parçacıkları belirlemek için bu işlemi tekrarlayın. Ideal.

Genel sapma, her seferinde bir tane olmak üzere en fazla 0,1 piksel büyüklüğündedir. Birlikte ve parçacık izleme altında izlenen altın parçacıklarını seçin. İşaretleyici ekle düğmesine tıklayın.

Parçacığın bir işaretleyici olarak eklendiğini ve sürüklenmeyi düzeltmek için kullanılacağını gösteren yeşil bir çarpı işareti görünecektir. Değeri biraz değiştirerek sigma aralığını, yumuşatma aralığını ve eşiğini gerektiği gibi ayarlayın. Ayarları test etmek ve PAM kiraz gibi proses parçacıklarını görsel olarak incelemek için parçacık bul düğmesine tıklayın: Nispeten yuvarlak ve parlak olan moleküller kutulanacak ve olmayanlar dışarıda bırakılacaktır.

Görüntüleri işlemeye başlamak için, kablo dosyası yap düğmesine tıklayın ve görüntüleri sonradan işlemek ve avuç içi görüntüsünü oluşturmak için dosyayı istediğiniz bir adla kaydedin. Avuç içi paketini MATLAB'da başlatın, yeni oluşturulan nokta çekirdek dosyasını yükleyin. Kurs olarak oluşturulmuş bir görüntü, kontrol düğmelerinin yanındaki görüntü kutusunda görünür.

Aşağıdaki tipik değerleri kullanarak tek tek koordinatları sıralayın. PAM Cherry one için, çerçeveyi birleştirmek sekize eşittir. Mesafeyi nanometre cinsinden birleştirmek 100'e eşittir, minimum RMS dörde eşittir.

Minimum uyum iyiliği 0.25'e ve maksimum eksantriklik 1.4'e eşittir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri işlemeye hazır yeni bir seçilmiş koordinat kümesi oluşturmak için sırala düğmesini tıklayın. Son görüntünün düzgün bir şekilde oluşturulması için, daha önce belirlenen ham piksel boyutu, oluşturulan görüntüde istenen özellik boyutu gibi değerleri girin, bu normalde ortalama yerelleştirmeden biraz daha yüksek bir değere ve 10 nanometre gibi piksel boyutuna ayarlanır.

Oluşturulan görüntü için, avuç içi görüntüsünü oluşturmak için oluştur düğmesine tıklayın. Ardından, canlı hücrelerdeki tek molekülleri izlemek için yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için şekil penceresinin araç çubuğundaki artı ve eksi büyütme simgelerini kullanın. Doku kültürü yüzeyini tedavi edin ve hücreleri bu videoda daha önce anlatıldığı gibi plakalayın.

Kapak camının mikroskopi için uygun kalınlığa sahip olduğundan emin olun Hücreleri kestikten ve deney için gerekli herhangi bir tedavi ve inkübasyonu gerçekleştirdikten sonra kurulum yapın, kültür kabını sahnedeki bir inkübatöre yerleştirin. Bu adımda sıcaklık ve CO2 konsantrasyonu stabilize olana kadar yemeğin birkaç dakika sahneye oturmasına izin verin. Lazerleri engelleyin.

CO2 kontrolü mevcut değilse, arka plan floresansını azaltmak için leibovitz'in L 15'i gibi görüntülemeden hemen önce CO2'den bağımsız bir ortama geçin ve daha önce gösterildiği gibi görüntüler elde edin ve zaman çözünürlüğünü kaybetmeden iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için uygun bir pozlama süresi ayarlayın. Bu şekildeki BFC avuç içi, RA bağlanma alanı veya CRAF'ın RBD'si ile etkileşime giren KRAS G 12 D mutantıdır. Burada gösterilen dört kombinasyonun her biri, lentiviral enfeksiyon hücreleri kullanılarak U2 OS hücrelerine sokuldu, konfigürasyonlardan ikisi, BFC'nin foto aktivasyonu nedeniyle 405 nanometre lazer açıldığında floresanstaki ani artışla tanımlandığı gibi güçlü pozitif BFC sinyallerine sahipti

RN R ve RAF RBD RC ile enfeksiyondan sonra güçlü bir BFC sinyali üretildi. Burada, RN ve RC, tek tek moleküllere yakınlaştırıldığında sırasıyla PAM Cherry'nin n ve C terminal fragmanını gösterir ve bunların nano ölçekli uzamsal dağılımı, tek tek RA'ların difüzyon yörüngelerini elde etmek için tek molekül izleme avucunun gerçekleştirildiği bu deneyde açıkça görülebilir. RAF RBD, 561 nanometre ve 405 nanometre lazerlerle sürekli aydınlatma altında kompleksler. Bireysel PA m kiraz bir molekül st.

Hareketi açın ve hareketsiz veya hareketli oldukları tespit edilen karanlık durumlara girmeden önce birkaç kare bekleyin. Çoklu moleküller için bu kayıt grafiği, her iki yörünge türünü de açıkça göstermektedir. Difüzyon durumlarının aynı heterojen dağılımı, ardışık çerçeveler arasındaki molekül yer değiştirmesinin histogramından çıkarılabilir.

Bu teknik, yapıların aşkın, transfekte edilmiş veya düzgün bir şekilde uygulanmışsa stabil bir şekilde baskı altında olmasına bağlı olarak bir ila üç hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben etkileşimden yoksun olan mutant Putin'ler gibi kontroller hazırlamayı unutmamak önemlidir. Protein etkileşimlerinin hücrede mekansal olarak nasıl organize edildiği gibi ek soruları yanıtlamak için küme analizi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Laboratuvar hücresi takibi için, değerlendirme tabanı, geliştirilmesinden sonra difüzyon durumlarını ve geçiş olasılıklarını belirlemek için tek parçacık takibi yapılabilir. Bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki laboratuvarımızda, RA sürücü etkileşimlerinin yanı sıra insan tümör hücrelerinde homo ve aile reseptörlerinin izasyonunu araştırmak için kullanılmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz bir protein etkileşimini araştırmak için bir biyopsi işleminin nasıl tasarlanacağını ve uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Antivirüs ve tümör hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman standart biyo güvenlik protokolleri gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.