Konfokal Analizi Kullanımı

Bu metodolojinin genel amacı, xip pos lavis'teki ekspresyonu kullanarak, bozulmamış bir epitelyumda floresan işaretli ligandların salgılanmasını ve difüzyonunu görselleştirmektir. Bu yöntem, erken embriyonik gelişim sırasında hücre soy hatlarının belirlenmesinde temel olduğu bilinen morfojen gradyanlarının oluşumuna ilişkin kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bozulmamış bir epitelyumdaki ligand dağılımını görselleştirmek için basit bir yöntem olmasıdır.

Protokolün temel bir parçası, normalde işlenen ve salgılanan, floresan bir etiket eklenmiş olmasına rağmen alıcı hücrelerde yanıt oluşturabilen biyolojik olarak aktif ligandlar üretmektir. Konfokal mikroskopi, bağımsız lazerler ve dedektörler kullanarak üç boyutlu dokular içindeki floresan etiketli proteinlerin lokalizasyonunu incelemek için ideal bir yöntemdir; bu yöntem, karmaşık doku türleri içinde temiz bir analiz yapılmasını ve sağlam verilerin toplanmasını sağlar. Floresan etiketli ligandlar için mRNA kaplaması oluşturulduktan ve yazılı protokole uygun olarak XUS lavis embriyoları temin edildikten sonra, mRNA'yı membran RFP gibi bir soy hattı izleyicisi ile birlikte 16 ila 32 hücre aşamasındaki tek bir hücreye enjekte edin; istenirse, etkilerini analiz etmek için bir modülatör, floresan ligand ve soy hattı markörü ile birlikte ko-enjekte edilebilir.

Bazen komşu bir hücreye de enjeksiyon yapmak faydalı olabilir. Burada, daha önce enjekte edilen hücrenin bitişiğine ikinci bir hücre enjekte edilir. Bir hücreye GFP etiketli ligandı ve membran RFP gibi bir soy izleyiciyi kodlayan mRNA'lar enjekte edilirken, diğer hücreye modülatörü ve membran cerulean gibi farklı bir soy izleyiciyi kodlayan mRNA'lar enjekte edilir. Embriyolar 12,5 °C'lik bir inkübatöre aktarılır ve yeni kooperatiflere kadar kültüre edilir. Ertesi gün, embriyolar Faber evre sekize ulaştığında, %1 agaroz ile kaplanmış kaplar NAM 2 ile doldurulur ve tungsten iğneler kullanılarak kesik cam pipet yardımıyla embriyolar aktarılır.

Enjekte edilmiş ve kontrol embriyolarının hayvan kutbundan, herhangi bir mezoderm içermemesine dikkat ederek dairesel eksplanlar çıkarın; hayvan eksplanlarını %1 aros kaplı 55 milimetrelik Petri kaplarına aktarın ve floresan proteinlerin olgunlaşıp rölyef oluşturabilmesi için embriyoları dört saat boyunca kültüre edin. Lamlar için, mikroskop lamlarının üzerine iki kat PVC izolasyon bandı uygulayarak onları tamamen düzleştirin.

Hayvan kapaklarını monte etmek için banttan 14 by 10 milimetrelik bir dikdörtgen kesin. Ardından, relief lamına iki ayrı NM iki damlası pipetleyin. Daha sonra, ucu kesilmiş bir P 20 ucu kullanarak her lama 15 adede kadar hayvan eksplantı aktarın ve pens yardımıyla, X eksplantlarının apikal tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.

Elmas uçlu kalem kullanarak bir lamel üzerine çizik atın ve daha küçük bir lamel oluşturmak için onu kırın. Rölyef lamın üzerine uydurmak için, bükülmüş 19 gauge bir iğne yardımıyla cam lameli rölyef lamın üzerine nazikçe indirin. Bu işlemle hayvan şapkası hücrelerinin apikal tabakası sıkıştırılmış olur.

Lamı karanlıkta 20 dakika boyunca kuruması için oje ile mühürleyin ve dört ila altı saat içinde görüntüleyin. Sağlıklı hayvan kapakları elde etmek için, hayvan kapakları özel lamlar ve ardından lameller içerisinde doğru şekilde yönlendirilmelidir. Lamlara nazikçe yerleştirin.

Slaytları mühürlemek için çok fazla oje kullanmamak hayati önem taşır; aksi takdirde bant kırışacak ve daha sonra slayttaki mühür bozulacaktır. Bu işlemde uzmanlaştıktan sonra, ilgilendiğiniz her durum için 20 adet kaliteli hayvan başlığı (animal cap) elde edebilmek adına yaklaşık 25 embriyoya enjeksiyon yapmanız gerekecektir. Bunlar daha sonraki gün konfokal mikroskopi ile analiz edilebilir.

Görüntüleme işlemini gerçekleştirmek için, X explan'ı bulmak amacıyla düşük büyütmeli bir objektif kullanın. Ardından, daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme için 63 x 1.4 yağlı objektife geçin. MIAN için 405, GFP için 488 ve 561 dahil olmak üzere gerekli lazerleri açın.

MRFP için, tüm floroforların saptanabilmesi amacıyla lazer güçlerini optimize edin. Gereken voltaj ve kazanç miktarını minimize ederek 32 dedektör dizisini kullanın, ardından Lambda modunu seçip 405 nanometre, 488 ve 561 nanometre lazerleri belirleyin. Daha geniş bir görüş alanı sağlamak için görüntüyü 0,6 x oranında uzaklaştırın.

Ardından, çerçeve boyutunu istenen görüntü boyutuna ayarlayın. Bu, sinyal-gürültü oranını artırmak için ortalama dört ila sekiz olarak ayarlanan analiz seti için yeterli çözünürlük sağlar ve bu veri seti için pinhole'u optimize eder. 405, 488 ve 561 kullanılarak, 561 nanometre lazerine göre bir alan birimi kullanılmıştır.

Dik aynalar, membran Saru, GFP ve membran RFP'den yayılan ışığı toplar. Bu deneyde, 415 ile 720 nanometre arasında yaklaşık her 10 nanometrede bir ışık toplanmıştır. Görüntü analizini burada gösterilen metin protokolüne göre gerçekleştirin; GFP etiketli sonic hedgehog'un bir hayvan kab X açıklamasındaki dağılımı şu şekildedir: kontrol koşulları altında sonic hedgehog GFP salgılanır ve enjekte edilen mRNA'ları eksprese eden bölgenin dışına yayılır.

Ancak, modülatör SULF1 varlığında, Sonic Hedgehog GFP'nin dağılımı daha kısıtlıdır. Ve bu örnekte, Sonic Hedgehog GFP'nin sadece birkaç odağı, onu üreten hücre klonunun kısa bir mesafesinde görülebilir. Bu şekil, burada belirtildiği gibi hücrelere enjekte edilen floresan işaretli iki Wnt ligandının karakterizasyonunu göstermektedir; hem Wnt8A hem de Wnt11B-H-A-E-G-F-P, hayvan kalite hücrelerinin membranında birikir ve Wnt8A-H-A-E-G-F-P, Wnt11B'den daha verimli bir şekilde birikir. Bu şekil, membrana bağlı Cerulean ile işaretlenmiş bir hücre klonunda eksprese edilen Wnt8A-H-A-E-G-F-P'nin dağılımını göstermektedir.

Floresan işaretli ligandın, kaynak hücrelerden uzaklaşarak epitelyumun çevreleyen hücrelerine doğru difüze olduğu görülmektedir. Burada gösterildiği gibi, birden fazla deneysel örnekteki floresan işaretli wind ligandlarının dağılımına ilişkin verileri çıkarmak için görüntü analiz yazılımı kullanılır. Wind difüzyonunun menzilini ve gradyanın şeklini belirlemek amacıyla, mem Saru eksprese eden klondan olan mesafe ve GFP floresans seviyesi ölçülür.

Bir ligandın dağılımı ölçüldükten sonra, alıcı hücrelerin yanıtını izlemek için bu protokol başka bir analizle birleştirilerek bir sinyal yolağının çıktısı da değerlendirilebilir. Bu şekilde, bir morfogenin eşik aralığını belirlemeye çalışabilirsiniz.