Name: Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Öğrenin, bakteriyel yapay kromozom kullanarak Japon ensefalit virüsü gibi pozitif iplikli RNA virüslerinin klonlanmış cDNA'sından bulaşıcı virüs partiküllerini nasıl kurtaracağınızı. Bu yöntem viral genetik ve aşı geliştirme araştırmaları için değerli bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, YML'yi desteklemek için Utah Bilim, Teknoloji ve Araştırma fonuna ve SIY'yi desteklemek için Kore Ulusal Araştırma Vakfı hibelerine (2009-0069679 ve 2010-0010154) teşekkür eder. Bu araştırma, Utah Eyalet Üniversitesi, Utah Tarımsal Deney İstasyonu tarafından desteklenmiş ve UAES #8753 numaralı dergi makalesi olarak onaylanmıştır. Ayrıca yazarlar, editoryal yardım için Dr. Deborah McClellan'a teşekkür eder.

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan etmişlerdir.

Mevcut protokolü başarılı bir şekilde, iki farklı suşları (CNU / LP2 27 ve SA 14 -14-2 28) JEV,, fonksiyonel cDNA kanıtlamıştır oluşturmak için doğal zor bir flavivirüs ve tam uzunlukta enfeksiyon cDNA klonlarının üretilmesi için kullanılmıştır Çünkü konakçı hücre toksisitesi ve klonlanmış cDNA&#39;dan genetik instabilitesi yaymak 8,74-76 Bu protokol, üç ana bileşeni içerir:. yüksek kalitede ters transkriptaz kullanılarak viral RNA&#39;nın bir cDNA sadık bir kopyasının sentezi / amplifikasyon maksimize, birinci / bir DNA polimerazı; ikinci olarak, son, tam uzunlukta cDNA takımı adımları alt klonlama başlangıç ​​cDNA&#39;dan çok düşük kopya sayılı vektör BAC (yayınlanmamış veriler), toksik sekanslar ihtiva eden viral prM-E kodlama bölgesini 74,77,78 klonlanması; ve üçüncü, görünüşe göre daha büyük bir DNA INSE tolere 120-350 kb, 19-21 arasında bir ortalama boyutu olan bir yabancı DNA için uygun bir klonlama vektörü kullanılarak BACdaha rts başka klonlama vektörleri yapmak. Bu klonlama yaklaşımı birçok pozitif sarmallı RNA virüsleri, ~ 10 ila 32 kb&#39;lik bir büyük RNA genomu olan, özellikle de genel olarak geçerli olacaktır. Genom konukçu hücre ribozomlar tarafından proteinler çevrilir viral mRNA görür, çünkü enfeksiyon cDNA klonunun Generation, özellikle de pozitif sarmallı RNA virüsleri için, RNA virüs bir karşıt genetik sistem geliştirilmesi önemli bir adımdır. Bu durumda, viral replikasyon duyarlı bir konakçı hücreye bir cDNA kaynaklı genom uzunlukta RNA molekülünün yerleştirilmesi suretiyle başlatılabilir. Bulaşıcı JEV cDNA klonunun durumu, yeniden birleştirici DNA teknolojisi ile birlikte kullanıldığında, bu tip gen ekspresyonu 73,79 ve genom replikasyonu gibi, moleküler seviyede viral yaşam döngüsünün çeşitli yönlerine ilişkin anlaşılmasını artmıştır. 63,64 Ayrıca, tam uzunluktaki cDNA klonu JEV antiviral aşı 28 ve gen iletim vektörleri gelişimi için değerli bir alet olduğu kanıtlanmıştır. &lt;sup&gt; 80,81 Tüm pozitif sarmallı RNA virüsleri gibi, yüksek derecede bulaşıcı RNA&#39;lar, in vitro olarak sentezlenebilir olan JEV için güvenilir bir fonksiyon cDNA&#39;yı oluşturmak birden çok kritik adım vardır. İdeal olarak, tam uzunluktaki cDNA klonu transkribe sentetik RNA&#39;ların dizisi viral genomik RNA, viral RNA replikasyonunun başlatılması için gerekli olan, özellikle 5&#39;- ve 3&#39;-terminal dizilerinin aynı olmalıdır . 60-62 mevcut protokol otantik 5 &#39;ve 3-uçları geçen alt baş viral genomunun birinci adenin nükleotid üst akışında SP6 promotör sekansını yerleştirilmesi ve yapay benzersiz Xba I sınırlama sitesi konumlandırılması sağlanmıştır sırasıyla, viral genomun timin nükleotid. Bir Xba I ile doğrusallaştırılmış ve MBN ile tedavi edilen cDNA te run-off transkripsiyonu ile üretildi otantik 5 &#39;ve 3&#39; uçları olan sentetik RNA&#39;ların Kapaklımplate m 7 G (5 &#39;) ile prime SP6 RNA polimerazı ppp (5&#39;), bir başlık kullanarak analog. Bu protokol, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Bu içinde mevcut değilse, in vitro transkripsiyon için, bir bakteriyofaj RNA polimeraz (örneğin, T3 ya da T7) iyi tanımlanmış promotör sekansı ile bağlantılı olarak kullanılabilir. 27, bir çalışma-dışı sitesi olarak, farklı bir kısıtlama alanı kullanılabilir doğrusallaştırılmış cDNA&#39;dan viral genom ve eğer sentetik RNA otantik 3 &#39;ucu ile biter. Sentetik RNA, 3 &#39;ucunda üç veya dört virüs ilişkisiz nükleotidini ihtiva ettiği zaman, 3&#39;-ucu nükleotid dizisinin önemi RNA enfekte bir ~ 10 kat azalma ile gösterilmiştir. Bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda 27, her iki m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;), A ve m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G kap analog 5 viral ikinci yerleri ne kadar alakasız bir ekstra G nükleotid yukarı aynı kalitede kullanılabilir &#39;-end, ancakİlave enfeksiyon veya sentetik RNA replikasyonunu değiştirmez. 27 Ayrıca, DNase I sindirimi ile RNA transkriptlerinden cDNA şablonu çıkarılması RNA enfekte testler için gerekli değildir, cDNA şablonu kendisi bulaşıcı değildir, çünkü. 27 BAC teknolojisi artık pozitif sarmallı RNA virüslerinin, yani, iki JEVs, CNU / LP2 27 ve SA 14 -14-2 28 (genom boyutu, ~ 11 kb) bir avuç enfeksiyon cDNA klonlarının oluşturulması uygulanmıştır; İki dang virüs, BR / 90 26 ve NGC 29 (~ 11 kb); sığır viral diyare virüsü, SD1 (~ 12 kb) 25 iki domuz vebası virüsleri, C ve Paderborn (~ 12 kb) 24 sınır hastalığı virüsü, Gifhorn (~ 12 kb) 24 domuz üreme ve solunum sendromu virüsü , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb) 30 bulaşıcı gastroenterit virüsü, PUR46-MAD (~ 29 kb) 16 kedi bulaşıcı peritonit virüsü,DF-2 (~ 29 kb) 32 ağır akut solunum sendromu coronavirus, Urbani (~ 30 kb) 9 MERS-CoV, EMC / 2012 (~ 30 kb) 17 ve insan koronavirüsü, OC43 (~ 31 kb) 31 cDNA yapımı için BAC&#39;ler kullanılarak ana avantajı, büyük, 1- ya da 2-kopyalama BAC plazmidlerin yüksek genetik stabilitesidir.; Bununla birlikte, son derece düşük kopya sayısı iç yapısı nedeniyle BAC DNA ve kromozomal DNA&#39;yı barındıran göre BAC DNA saflıkta azalmasının çok düşük verimleri, aynı zamanda büyük bir dezavantaj teşkil etmektedir. Geçerli protokolde, BAC DNA verimi E. büyüyen maksimize edilir coli DH10B bir besin açısından zengin bir ortamda, 2xYT içinde / bulaşıcı BAC pBAC ile SA 14 -14-2 dönüştürdü. Bu çabaya rağmen, ortalama verim sadece ~ 15 ug 2xYT suyu 500 ml BAC DNA taşımaktadır. Ayrıca, BAC DNA saflığı en iyi temizleme için CsCl-EtBr yoğunluk gradyan santrifüj ile elde edilirOldukça yaygın olarak kullanılan kolon bazlı plazmid izolasyon daha. Ancak, akılda tutulması gereken önemli olduğunu BAC-dönüştürülmüş E. klonlanmış cDNA genetik istikrarı tehlikeye olabilir çünkü coli sarmak olmamalı ve yüksek büyüme mutlaka büyük verimleri veya daha yüksek saflıkta BAC DNA yol açmaz. Burada açıklanan protokol JEV bir BAC olarak genetik olarak stabil, tam uzunlukta enfeksiyon cDNA klonunun inşaat ve yayılması için optimize edilmiş, etkili ve akıcı bir yöntemdir, bir prosedür bir kez pratik olarak imkansız düşünülmektedir. Bu, aynı klonlama stratejisi aynı zamanda pek çok diğer pozitif sarmallı RNA virüsü tatbik edilebilir. Genel olarak, bulaşıcı cDNA klonları, viral replikasyon ve patogenezinde biyolojik fonksiyonlarını incelemek için, bir viral RNA genomu içine mutasyon (örneğin, silmeler, girmeler ve nokta mutasyonları) çeşitli tanıtmak için olanak sağlar. Bu cDNA tabanlı ters genetik sistemi geliştirmek mümkün ve tes kılart aşısı ve belirli bir ilgi pozitif sarmallı RNA virüsü oluşturma faktörünü (ler) hedefleyen terapötik aday. Buna ek olarak, bu bulaşıcı cDNA&#39;dan teknolojisi de biyomedikal araştırmalarda birçok uygulama için, ilgili bir yabancı gen (ler) ifade edebilen bir virüs vektörü olarak kullanılabilir.

RNA virologists, 1970&#39;lerin rekombinant DNA teknolojisindeki gelişmeler, daha sonra mümkün RNA virüslerinin genetik manipülasyonu için bakterilerde plazmidler gibi yayınlanabilirdi cDNA klonları, viral RNA genomları dönüştürmek için yapılmıştır. 1, ilk RNA virüsü olduğu Klonlanmış moleküler bakteriyofaj Qβ, Escherichia coli bozar pozitif sarmallı RNA virüsü oldu. E. verildiğinde Qβ genomik RNA&#39;nın bir cDNA kopyasını ihtiva eden bir plasmid, bulaşıcı Qβ fajlar yol açan E. coli. 2 Kısa bir süre sonra, bu teknik, poliovirüs uygulanan, insanlarda ve hayvanlarda bir pozitif tek iplikli RNA virüsüdür edildi. Çocuk felci virüsü genomik RNA&#39;nın bir tam boy bir cDNA taşıyan bir plazmid, bulaşıcı memeli hücrelerine transfekte edilmiş ve enfeksiyöz virionlann üretebilen zaman 3, klonlanmış cDNA&#39;lar, viral RNA replikasyonunu başlatmak için hücre transkribe edilmesi gerekmektedir, bu &quot;DNA başlatıldı&quot; yaklaşımında.;transkripsiyon başlatılır ve nasıl transkript doğru viral diziye nasıl işlendiğini, ancak belirsizdir. Bu kaygı, bir alternatif &quot;RNA fırlatılan&quot; bir gelişmesine yol açmıştır yaklaşımı viral RNA genomunun tam bir cDNA kopyası bir E. tarafından tanınan bir promoter altında klonlanır, böylece Ev sahibi hücre içine sokulduğunda virüsün replikasyon çembere devam tanımlandığı 5 &#39;ve 3&#39; uçlarının ile in vitro olarak sentetik RNA&#39;ların üretimi için E. coli ya da faj RNA polimeraz. Bu yaklaşım ilk başarılı brom mozaik virüsü için bildirilmiştir 4,5 6,7 bitki pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. O zamandan beri, RNA fırlatılan bir yaklaşım kalisivirüs alfavirüsler, flavivirüsler, arteriviruses ve koronavirüslerin dahil pozitif iplik RNA virüslerinin geniş bir yelpazesi için geliştirilmiştir. 1,4,5,8 Nitelikteki DNA- ve her ikisinde de, ful inşaatı karşıt genetik sistemler RNA başlatılan~ 10 l-uzunluklu cDNA klonu enfeksiyon DNA veya pozitif sarmallı RNA virüslerinin RNA üreten anahtarı, ancak viral genomun boyutu arttıkça önemli bir teknik sorun. Özellikle 9-17, geniş bir RNA genomu olur -32 kb, tam uzunlukta cDNA işlevsel klonlama ile üç büyük sorun sunulur. RT-PCR aslına viral RNA&#39;nın uzunluğu ile ters orantılı olduğundan, 18 ilk zorluk, kopyalama sadık bir cDNA sentezi. Uzun RNA molekülleri E. kararsız plazmidler cDNA fragmanının yapabilen beklenmeyen dizileri içeren daha büyük olasılıkla, çünkü ikinci bir engel, potansiyel olarak toksik sekansların varlığı E. coli. O&gt; 10 kb viral cDNA insert ev bir klonlama vektörü bulmak zor olduğundan üçüncü ve en kritik konu, uygun bir vektör mevcudiyetidir. Son üç yılda, bu engeller enzimolojisi, metodoloji, An çeşitli gelişmeler aşılmıştırd vectorology. Bunlardan 1,4,5,8, en yenilikçi gelişimi büyük pozitif sarmallı RNA virüsleri gibi bulaşıcı bakteriyel yapay kromozomları (BAC&#39;ler) klonlanması olup. BAC vektörü E. göre bir düşük kopya plazmid klonlama (1-2 kopya / hücre) bir arasında bir ortalama DNA insert boyutu ile coli doğurganlık faktörü, ~ 120-350 kb 19-21 bir DNA parçası, genel klonlama vektörleri içine klonlama için benzer bir şekilde BAC vektörü içine sokulur.; Ortaya çıkan BAC klonları E. birçok nesiller boyunca stabil E. coli. Bugüne kadar 22,23, BAC teknolojisi yani üç pozitif iplikli RNA virüsüdür aileleri, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 ve Coronaviridae&gt; 10 üyeleri için bulaşıcı cDNA klonları oluşturmak için kullanılır olmuştur. 9,16,17 , 31,32 Örnek olarak Japon ensefaliti virüsü (JEV) kullanarak, mevcut iş olabilir detaylı prosedürler raporlarıpozitif sarmallı RNA virüslerinin çeşitliliği için bir genetik olarak stabil, tam uzunlukta enfeksiyon BAC oluşturmak için kullanılır. Meydana JEV, JEV enfeksiyonu ağır sıklıkla ölümcül bir nörolojik hastalıktır Japon ensefalit neden olabilir İnsanlarda bir zoonotik sivrisinek vektörleri tarafından kuş, domuz ve diğer omurgalı konaklar arasında doğada iletilir flavivirüs 33. 34,35 olan (JE), 36 ~ 50,000-175,000 klinik vakaların tahmini yıllık insidansı Asya ve Batı Pasifik, 37,38 parçaları. 39,40 Jev genomu bir ~ 11-kb, tek iplikli, pozitif-sens RNA molekülüdür ve oluşan 5 &#39;ve 3&#39; iki kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCRs) ile çevrili bir tek bir açık okuma çerçevesi (ORF) sona erer. 41,42 ORF olarak 10 bağımsız proteinlerin üretilmesi için host ve viral proteazlar tarafından bölünen bir poliproteini şifreler C prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ve NS5 Ayrıca C-terminal yönüne N-. 34,43,44, eNS1 (NS1 &#39;) ne sahip Xtended şekilde kodonları NS2A 8-9 de tarafından -1 ribozomal çerçeve ifade edilir. Bu 11 proteinlerden 45,46, üç yapısal proteinleri (Cı prM ve E) enfeksiyon oluşumu için gerekli olan virionlar, 47,48 ve kalan sekiz yapısal olmayan proteinler (NS5&#39;in için NS1 ve NS1 &#39;), viral RNA replikasyonu, 49-51 parçacık montaj, 52-56 ve doğal bağışıklık kaçırma için çok önemlidir. 57-59 İkisi 5&#39; ve 3 &#39;NCRs birincil dizileri ve viral RNA replikasyonu modüle için önemli olan formu RNA ikincil / üçüncül yapıları, 60-62 korunmuş içerirler. 63,64 Bu protokol, SA 14 -14-2 tam uzunlukta JEV enfeksiyöz BAC üretilmesi için araçlar, yöntem ve stratejiler açıklanmaktadır. 28 Bu fonksiyonel BAC klonu bir promoter tarafından kapsanmaktadır JEV genomik RNA&#39;nın bir cDNA kopyasını, 65 içerir SP6 RNA polimeraz için üst başViral 5&#39;-uç ve in vitro Çoğaltma transkripsiyonu ayrıca viral 3&#39;-ucunun alt baş benzersiz bir Xba I kısıtlama sahasının. Bu BAC teknolojisi pozitif sarmallı RNA virüslerinin bir dizi için tamamen işlevsel bir cDNA klonu molekül oluşturmak için de geçerlidir.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>1. Moleküler Klonlama</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Et</td><td>Suyu Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>50 ml Tüp</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Şişe</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz (Düşük Erime Noktası)</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>Yeni İngiltere BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sezyum</td><td>Klorür Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Kanserojen</td></tr><tr><td>DE-81 Filtre Kağıdı</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10B&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Toksik ve yüksek mutajenik</td></tr><tr><td>Filtre Sütunu (Plazmid Maxiprep Kiti)</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu Asetik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Tahriş</td></tr><tr><td>Edici Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>İzoamil Alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>İzopropanol&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>LB Et Suyu</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Ters Transkriptaz</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Maş Fasulyesi Nükleaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>İğne (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Biyolojik Tehlikeli (Kesici alet atıkları)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonükleotid</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Özel Oligonükleotid Sentezi</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Fenol (Tampon-Doymuş)</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Toksik ve oldukça aşındırıcı</td></tr><tr><td>Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td> <td>15593-031</td><td>Toksik ve yüksek derecede aşındırıcı</td></tr><tr><td>Fenol: Guanidin İzotiyosiyanat</td><td>Yaşam Teknolojileri (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Toksik, aşındırıcı ve tahriş edici</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Asetat</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Seti</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Sızdırmaz Polipropilen Tüp (16 & kez; 76 mm)& nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polimeraz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Spin Kolonu (Plazmid Miniprep Kiti</td><td>)Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (maya)</td><td>Yaşam Teknolojileri (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2. Hücre Kültürü</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alfa Minimal Esansiyel Orta</td><td>Yaşam Teknolojileri (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Konik Tüp (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Menekşe&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Kültür Kabı (150 mm)&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Küvet (2 mm Boşluk)</td><td>Harvard Aparatı</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Toksik ve kanserojen</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Orta Ömür</td><td>Teknolojileri (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Altı Kuyulu Plaka</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.25)</td><td>Yaşam Teknolojileri ( Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitaminler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr> <tr><td><güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr><tr><td>< güçlü >3. Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agaroz Jel Elektroforez Sistemi</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Santrifüj ve nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R Elektroporatör</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard Aparatı</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Uzun Dalga Ultraviyole Lambalar (El Tipi)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Yaşam Teknolojileri (Uygulamalı Biyosistemler)</td><td>GeneAmp PCR Sistemi 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortekser</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bakteriyel yapay kromozom: rna virüsler pozitif iplikli araştırmaları fonksiyonel genomik aracı

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Enfeksiyöz virüsü klonlanmış bir cDNA'dan tamamen kurtarmaya yönelik bir yaklaşım olan ters genetik, genomları hücresel mRNA ile aynı polariteye sahip olan pozitif sarmallı RNA virüsleri alanında devrim yarattı. cDNA tabanlı ters genetik sistem, viral genomik RNA'nın doğrudan manipülasyonunu sağlayan, böylece viral replikasyon ve patogenezde hem viral RNA elementlerinin hem de gen ürünlerinin moleküler ve genetik çalışmaları için rekombinant virüsler üreten ufuk açıcı bir yöntemdir. Ayrıca, yabancı genlerin verilmesi için genetik olarak tanımlanmış aşıların ve viral vektörlerin geliştirilmesine izin veren değerli bir platform sağlar. Bununla birlikte, Japon ensefalit virüsü (JEV) gibi birçok pozitif sarmallı RNA virüsü için, klonlanmış cDNA'lar kararsızdır ve fonksiyonel cDNA'nın inşası ve yayılması için büyük bir engel oluşturur. Burada, bu rapor, aşağıdaki genel deneysel prosedürleri kullanarak bir bakteriyel yapay kromozom (BAC) olarak genetik olarak stabil tam uzunlukta bulaşıcı bir JEV cDNA'nın oluşturulması ve çoğaltılmasına ilişkin stratejik hususları açıklamaktadır: viral RNA izolasyonu, cDNA sentezi, cDNA alt klonlaması ve modifikasyonu, tam uzunlukta bir cDNA'nın montajı, cDNA doğrusallaştırması, in vitro RNA sentezi ve virüs geri kazanımı. Bu protokol, bir dizi pozitif sarmallı RNA virüsü için, özellikle >10 kb uzunluğunda bir genoma sahip olanlar için, enfeksiyöz RNA'ların bir bakteriyofaj RNA polimeraz ile in vitro olarak kopyalanabildiği bir BAC vektörüne tam uzunlukta cDNA'nın klonlanması için uygulanabilir genel bir metodoloji sağlar.

Tüm pozitif sarmallı RNA virüsü için bir karşıt genetik sistem güvenilirliği ve etkinliği olan dizisi viral genomik RNA&#39;nın konsensüs sekansına denk bir klonlanmış tam boy cDNA&#39;dan genetik stabilitesi, bağlıdır. 27 Şekil 1, bir beş göstermektedir JEV SA BAC gibi tam uzunlukta enfeksiyon cDNA yapımı için aşamalı bir strateji 14 -14-2 28: Aşama 1, JEV enfekte BHK-21 hücreleri (Şekil 1A), hücre kültürü üstte yüzen kısmından viral RNA&#39;nın saflaştırılması; Aşama 2, tüm viral genomun (Şekil 1B) kapsayan birbiriyle çakışan dört cDNA amplikonlarının (F1 ila F4) sentezi; PBAC / F4 (Şekil 1C) için pBAC / F1 oluşturma Aşama 3, bir BAC vektörüne bitişik dört cDNA parçalarının her birinin alt-klonlama; Aşama 4, SP6 RNA polimeraz, yani in vitro Çoğaltma transkripsiyonu için klonlanmış cDNA modifikasyonu, bir SP6 yerleştirerekpromoter dizisi, bir sessiz bir nokta mutasyonu sokulmasıyla nükleotid 9131 de önceden var olan bir iç Xba I bölgesi elimine viral 5&#39;-ucunda (pBAC / F1 SP6) hemen üst tarafından, bir 9134 T (pBAC / F3 KO) ve ekleme → Viral 3&#39;-ucunda (pBAC / F4 RO) (Şekil 1D) hemen aşağı tarafında, yeni bir yapay Xba I run-off yer; ve Aşama 5, tam uzunlukta bir montaj SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Şekil 1E). Tablo Klonlama işleminde kullanılan oligonükleotidler 1 listeler. 28 Fonksiyonel JEV cDNA yapımı için, ilk önemli adım RT-PCR için bir şablon olarak saflaştınlmış viral RNA kullanılarak, dört örtüşen cDNA fragmanlarının sentezidir. 2 olan dört RT-PCR ürünleri için temsili bir sonuç sağlar Şekil % 0.8 üzerinde elektroforezagaroz jel. Bu jel, bir tam uzunlukta cDNA JEV dört örtüşen cDNA fragmanları amplifiye olduğunu açık bir şekilde göstermektedir. Bazen, Rt-PCR reaksiyonu için cDNA sentezi / amplifikasyon prosesi esnasında primerlerin spesifik olmayan tavlamanın, istenen ürün daha çok küçük olan bir ya da daha fazla ilave virüse spesifik veya spesifik olmayan ürünler elde olabilir. Diğer taraftan, çok az veya hiç RT-PCR ürünü, viral RNA izolasyonu veya uygun olmayan RT-PCR performans sırasında kazara RNaz kirlenme amplifiye beklediği. Bir sonraki anahtar aşaması, bir kısmi ya da tam uzunluktaki standart rekombinant DNA teknikleri kullanır nispeten basit bir işlemdir BAC JEV cDNA klonlanması ve bir modifikasyonudur. 69 Şekil 3 içeren BAC klon saflaştırılması için temsili bir sonuç sunulur CsCI-EtBr gradyanı bantlayarak JEV SA 14 -14-2 tam boyda bir cDNA.Bu deneyde, 401.700 x g&#39;de 16 saat santrifüj işleminden sonra, iki farklı bantları, yani, E. Yukarıda coli kromozom DNA&#39;sı ve aşağıdaki süper-BAC plasmid DNA&#39;sı uzun dalgalı ultraviyole ışığı altında borunun ortasında görebilir. Alt BAC DNA bandının minimum bir hacmi (~ 400 | il) dikkatli bir şekilde borunun yan tarafında bulunan bir şırınga ile bir delik alay ile toplandı. Daha sonra, EtBr bütanol ekstre BAC DNA elde edildi ve EtBr içermeyen BAC DNA, etanol çökeltme ile konsantre edilmiştir. Son adım, permisif hücreler içine RNA transfeksiyonundan (Şekil 4) sonra, tam uzunluktaki SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) in vitro olarak transkripsiyonu sentetik RNA&#39;ların spesifik enfeksiyon belirlenmesidir. 3 &#39;de Adım 1, tam uzunluktaki doğrusallaştırma SA 14 -14-2 cDNA: Bu adım, üç ardışık adımları içerir-end viral genom (Şekil 4A); Aşama 2, run-off transkripsiyon (Şekil 4B) ile doğrusallaştırılmış cDNA&#39;dan sentetik RNA&#39;ların üretimi; ve Aşama 3, sentetik RNA&#39;ların (Şekil 4C) ile transfekte edilen BHK-21 hücrelerinde rekombinant virüslerin kurtarma. Deneysel olarak, pBAC / SA 14 -14-2 iki adet bağımsız klon Xba I sindirimi ile doğrusallaştırılmış ve Xba I sindirimi ile oluşturulan dört bazlı 5 &#39;çıkıntı kaldırmak için MBN ile muamele edilmiştir. Doğrusallaştırılmış BAC etanolle çökeltme izlenmiş ve fenol-kloroform ekstraksiyonu ile temizlendi. Saflaştırılmış olan iki BAC&#39;lerin doğrusallaştırma bir% 0.8 agaroz jeli (Şekil 5A) ile gösterilmiştir. Fenol-kloroform ekstraksiyon linearize BAC&#39;ler RNaz ücretsiz olmasını sağlamak için çok dikkatli yapılmalıdır. İki linearize BAC&#39;lerin her bir m, 7 G (5 &#39;) ppp mevcudiyetinde SP6 RNA polimerazı kullanılarak Çoğaltma transkripsiyonu için bir cDNA şablon olarak kullanıldı (5&#39;) Bir kapak benzeri. Sentetik RNA&#39;ların bütünlüğü referans 1kb DNA çaprazı (Şekil 5B) ile birlikte,% 0.6 agaroz jeli üzerinde, iki transkripsiyon reaksiyonu karışımları alikotları çalıştırarak gördü. Bu basit bir deneyde, büyük bir belirgin RNA bandı her zaman sadece geçirilmiş 3 kb altında DNA bandı başvuru ve keskin olduğu ortaya çıktı. Ancak, RNA aynı jel üzerinde bir bulaşmış bir görünüm olurdu bozulmuş. Bulaşıcı bir merkez tahlil sentetik RNA&#39;ların spesifik enfeksiyon belirlenmesi için altın standarttır. Bu deney, (3 x 10 5 hücre / çukur) saf BHK-21 hücreleri ihtiva eden 6 oyuklu plakalar içinde 10-kat seri olarak seyreltilmiş elektroporate edilmiş hücrelerde eşit hacimde tohumlama, RNA örnekleri ile BHK-21 hücrelerini elektroporat ve agaroz çakıştırılarak yapıldı Hücre mono tabakaları üzerine. 4 gün süreyle inkübe edildikten sonra, kalan hücreler formaldehid ile sabitlendi ve kristal mor ile boyandı sların çözüme hücreleri (Şekil 6A) içine verilecek, enfeksiyöz RNA moleküllerinin sayısına karşılık gelir enfeksiyonlu merkezlerden (plaklar) sayısını ölçmek için. In vitro transkripsiyonu için kullanılan cDNA şablonu olmayan bulaşıcı olması için, kanıtlanmıştır yana transkripsiyon reaksiyon karışımı 27, bir kısım, doğrudan elektroporasyon için kullanılmıştır. Elektroporasyon RNA transfeksiyonundan için tercih edilen yöntemdir; Alternatif olarak, RNA DEAE-dekstran ve katyonik lipozomlar kullanılarak diğer yöntemler ile transfekte edilebilir. RNA elektroporasyon çok etkili olmakla birlikte, elektrik akımının &quot;ark&quot; Tuzlar elektroporasyon reaksiyonunda ya da elektroporasyon küveti yeniden, mevcut nadir oluşur. RNA-transfekte edilmiş hücrelerde viral proteinlerin ekspresyonu bir anti-NS1 tavşan antiserumu (Şekil 6B) kullanılarak imüno-deney ile araştırılmıştır. RNA-transfekte edilmiş hücrelerin yüzer maddeleri içinde biriken viral parçacıkların üretimi olan birplak deneyleri (Şekil 6C) tarafından alyzed. Bu deneylerin sonuçları, bir cDNA türevli sentetik RNA&#39;ların rekombinan virüslerin yüksek titresi üreten permisif BHK-21 hücrelerinde enfeksiyon olduğunu açık bir şekilde göstermektedir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonükleotid </td><td> Sekans, bir (5 &#39;ila 3&#39;), </td><td> Pozisyon b </td><td> Polarite </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> KarıncaISENSE </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Duyu </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisens </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10.670-10.694 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td colspan="4"> Bir JEV dizileri büyük harflerle gösterilir ve BAC dizileri küçük harflerle belirtilir. b nükleotid pozisyonu JEV SA 14 -14-2 (Genbank erişim numarası JN604986) tam genom sekansı anlamına gelir. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: cDNA sentezi, PCR büyütmesi ve BAC mutagenezi için kullanılan oligonükleotidler. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figür 1.0, Strateji BAC olarak JEV SA 14 -14-2 bir tam boy cDNA&#39;dan yapımı için JEV partiküllerden viral RNA&#39;nın (A) izolasyonu.. JEV SA 14 -14-2 genomik RNA bir şematik diyagramı gösterilmiştir. Tüm viral genomu kapsayan (B) dört örtüşen cDNA parçalarının Sentezi (F4 F1). PBAC / F4 pBAC / F1 yaratan bir BAC vektörü içine dört örtüşen cDNA fragmanlarının (C) Altklonlaması. In vitro olarak run-off transkripsiyonu için klonlanmış cDNA&#39;lar (D) modifikasyonu. pBAC / F1 SP6 viral 5&#39;-ucunda akış yukarı SP6 başlatıcısı dizisini ihtiva pBAC / F1 bir türevidir. pBAC / F3 KO sessiz nokta mutasyonu (T → A 9134, yıldız) içeren pBAC / F3 bir türevidir. pBAC / F4 RO viral 3&#39;-ucunun alt baş yapay Xba I run-off siteyi içeren pBAC / F4 bir türevidir. (E </<html> strong&gt;) tam uzunlukta SA 14 -14-2 BAC Meclisi (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> JEV SA 14 -14-2 tam uzunlukta genomik RNA kapsayan Şekil dört örtüşen cDNA fragmanlarının 2. N- (F1 ila F4). Dört RT-PCR ürünleri,% 0.8 agaroz jeli içinde elektroforez ile değerlendirilir. M, 1 kb DNA merdiveni. Dört cDNA fragmanlarının beklenen boyutları jel görüntüsünün altında belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; JEV bir tam boy bir cDNA SA 14 -14-2 ihtiva eden BAC Şekil 3. saflaştırılması. BAC plazmid E. izole edilir SDS-alkalin lisiz yöntemi ile coli DH10B ve ayrıca bir CsCl-EtBr gradyanı şeritleme ile saflaştırılmıştır. 16 × 76 mm yapışmalı polipropilen tüp kullanarak CsCl-EtBr degrade bir örnektir sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> JEV SA 14 -14-2 cDNA BAC monte tam uzunlukta bir bulaşıcı virüslerin geri kazanımı Şekil 4. bakış., CDNA şablonunun (A) doğrusallaştırılması. JEV BAC ile kesilir tam uzunluktaXba I ve MBN ile muamele edilmiştir. RNA transkriptlerinin (B) Sentezi. Doğrusallaştırılmış cDNA m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;), bir başlık analogunun varlığında, SP6 RNA polimeraz tarafından transkribe edilmektedir. Sentetik JEVs (C) Kurtarma. In vitro transkripsiyonu RNA&#39;lar sentetik bir virüs titresi yüksek üretir elektroporasyon ile BHK-21 hücrelerine transfekte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Bir cDNA, şablon olarak tam boyda JEV BAC kullanılarak in vitro transkripsiyon Şekil RNA&#39;lar 5. sentezi. Linearize tam uzunlukta JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (A) üretimi. PBAC İki bağımsız klon/ SA 14 -14-2 (Cl.1 ve CL.2) MBN ile Xba I ile sindirim ve daha sonra tedavi ile lineerleştirilebilir edilir. Doğrusallaştırılmış BAC% 0.8 agaroz jeli içinde elektroforez ile incelenmiştir. Çoğaltma transkripsiyonu ayrıca, sentetik RNA&#39;ların (B) üretimi. İki linearize BAC&#39;lerin her SP6 RNA polimeraz Çoğaltma transkripsiyonu için bir şablon olarak kullanılır. İki transkripsiyon reaksiyonları alikoları% 0.6 agaroz jeli üzerinde çalıştırılır. M, 1 kb DNA merdiveni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Tam uzunlukta bir JEV BAC ve sentetik virüsün geri transkribe sentetik RNA&#39;ların Şekil 6. Belirli enfeksiyon. BHK-21 hücreleri, fr türetilmiş RNA transkriptleri ile (Mock), elektroporasyona-sahte veya elektroporasyona olantam uzunlukta JEV BAC (Cl.1 ve CL.2) iki bağımsız klon, her om. (A) RNA enfekte. Hücreler agaroz ile örtüldü ve post-transfeksiyon 4 gün sonra kristal mor ile boyandı. RNA enfekte hücrelerin (sol panel), elektroporasyona enfeksiyöz RNA miktarını tahmin etmek için enfeksiyöz merkezi deneyleri ile belirlenir. Ayrıca enfeksiyonlu merkezlerden temsili görüntüleri (sağ panel) gösterilmiştir. (B) Protein ifadesi. Hücreler 4 oyuklu oda slaytlar kültürlenir. 20 saat post-transfeksiyon (hpt) RNA-elektroporate edilmiş hücrelerde viral protein ifadesi, bir birincil anti-NS1 tavşan antiserumu ve ikincil bir Cy3-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG (kırmızı) ile imüno-tahlilleri ile analiz edilir. Çekirdekleri 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (mavi) ile ters. Immunofloresan görüntüleri bunlara karşılık gelen diferansiyel girişim kontrast görüntülerde üst üste. (C) Virüs verimi. Hücreler 1 kültürlenir50 mm kültür yemekleri. 22 ve 40 hpt RNA-electroporated hücrelerinin kültür yüzer biriken enfeksiyöz virionlann üretim plak tahlilleri tarafından incelenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Bu prosedürün genel amacı, Japon ensefalit virüsü gibi, genomları hücresel mRNA ile aynı polaritede olan pozitif zincirli RNA virüslerinin klonlanmış cDNA'larından tamamen enfektif virüs partiküllerinin geri kazanılmasıdır. cDNA tabanlı bu ters genetik yöntemi, viral genomik RNA'nın doğrudan manipülasyonuna olanak tanıyan ve böylece viral replikasyon ile patogenezin moleküler ve genetik çalışmaları için rekombinant virüslerin üretilmesini sağlayan temel bir yöntemdir. Bu teknik aynı zamanda, yabancı genlerin iletimi için genetik olarak tanımlanmış vaccinia viral vektörlerinin geliştirilmesine olanak tanıyan değerli bir platform sunmaktadır.Bu yöntemler, negatif veya pozitif suşlar, RNA virüsleri ve özellikle genomları 10 kb'den büyük olanlar için tam uzunlukta cDNA klonlamada uygulanabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan araştırma asistanı Sang-Im Yun, doktora sonrası araştırmacılar Byung-Hak Song ve Jin-Kyoung Kim ve lisans öğrencisi Jordan Frank uygulamalı olarak gösterecektir.Bu yayının video bölümü, ilgilenilen dizileri içeren bakteriyel yapay kromozomun hazırlanmasını, geri plazmitten transkribe edilen RNA sentezini ve RNA enfektivitesinin ve virüs veriminin nasıl ölçüleceğini kapsamaktadır. BAC plazmidi oluşturulmadan önce kullanılan tüm prosedürler, metin protokolünde ayrıntılı olarak sunulmuştur. Bu prosedür için, öncelikle BAC plazmidini taşıyan tek bir E. coli DH10B kolonisini, kloramfenikol içeren üç mililitre 2X YT besiyerinde büyütün. Kültürü 35 °C'de, 225 ila 250 RPM hızında çalkalayarak 10 saat boyunca inkube edin.10 saat sonra kültürü ölçeklendirin. Ardından 500 µL büyüme kültürüyle 500 mL medyumu inoküle edin ve inokülumu kuvvetli çalkalama ile altı saat boyunca kültüre edin. Altı saat sonra, bakteriyel kültürü 2 adet 250 mL'lik şişede 4 °C'de 15 dakika boyunca 3.100 g ile santrifüjleyin. Daha sonra her bir peleti 30 mL GTE çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.500 µL lizozim ekleyin ve süspansiyonları buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Bu sırada, bir sonraki adım için taze lizis solüsyonu hazırlayın. 10 dakika sonra, 60 mL lizis solüsyonu ekleyin ve çözelti berrak görünene kadar çalkalayarak karıştırın.Reaksiyonların oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sürmesini bekleyin. Ardından, her şişeye 45 mililitre nötralizasyon çözeltisi ekleyin ve şişeler tamamen karışana kadar altüst ederek karıştırın. Sonra, 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Nötralize edilmiş lizatlar, yüksek g değerli soğutmalı santrifüjasyon ile toplanır. Ardından süpernatanlar iki yeni 250 mililitrelik şişeye aktarılır. Her birine 0.6 hacim oranında %100 izopropanol eklenir ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.Ardından, çökelekleri çöktürmek için santrifüjleyin, ardından süpernatantları atın ve peletleri beş mililitre TE tamponu ile çözün. İki hacmi tek bir 50 mililitrelik tüpte birleştirin ve eşit hacimde beş molar lityum klorür ekleyip karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek RNA'yı çöktürün. RNA çökeleğini toplamak için 20 dakikalık soğuk santrifüj uygulayın.Ardından süpernatantı yeni bir 250 mililitre tüpe aktarın, iki hacim %100 isopropanol ekleyin ve DNA çökeleğinin oluşması için tüpü buza yerleştirin. 20 dakika sonra çökeleği santrifüjle çöktürün, süpernatantı aspire edin, DNA peletini 9,5 mililitre TE tamponunda yeniden süspande edin ve DNA çözeltisini 50 mililitre bir tüpe aktarın.Sezyum klorür gradyanını etidyum bromür ile kurarak hazırlama işlemine devam edin. Karışımı, 18 gauge iğneli bir şırınga kullanarak sızdırmaz polipropilen tüpe yükleyin ve tüpü kapatın. Sezyum klorür gradyanı oluşturmak için kapatılan tüpü bir ultrasentrifüjde gece boyunca döndürün.Ertesi gün, sezyum klorür gradyanından BAC plazmitinin DNA bandını toplayın. Gradyanın üst kısmında bir hava deliği açmak için 18 gauge iğne, gradyanın yan tarafından BAC DNA'sını toplamak için ise şırınga ile birlikte 20 gauge iğne kullanın ve ardından topladığınız örneği 1,7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yıkama işlemini gerçekleştirin, 2,5 hacim suyla doyurulmuş bütanol ekleyin ve normal vorteksleme ile karıştırın.Ardından karışımı oda sıcaklığında santrifüjleyin ve alttaki sulu fazı yeni bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüm etidyum bromürü uzaklaştırmak için bu yıkama işlemini toplam altı kez tekrarlayın. Şimdi BAC DNA'sını çöktürün. Tüpe, hacmin onda biri kadar 3 molar sodyum asetat ve 2,5 hacim %100 etanol ekleyin. Karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Ardından çökeleği oda sıcaklığında santrifüjleyin ve DNA peletini bir mililitre %70 etanol ile yıkayın. Santrifüj işlemine tekrarlyın ve peleti yeniden toplayın. Son olarak, peletlenmiş DNA'yı 10 dakika boyunca havada kurutun ve 200 mikrolitre TE tamponunda elüe edin.BAC plazmidinin Xba-one ile toplam 100 microliters hacimde geniş ölçekli bir restriksiyon enzimi sindirimi ile başlayın. Bu sindirimi 37 degrees Celsius'te 12 ila 15 saat boyunca gerçekleştirin. Ardından, sindirim karışımını ek 25 units mung-bean nuclease ile 30 degrees Celsius'te iki saat daha inkübe edin.İnkübasyonun ardından, hacmi distile su ile 300 µL'ye tamamlayın. Ardından, seyreltilmiş numuneye eşit hacimde fenol-kloroform, izoamil alkol ekleyerek, bir dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyerek, tüpü santrifüjleyerek ve üstteki sulu fazı yeni bir tüpe aktararak fenol ekstraksiyonu gerçekleştirin.Ardından ekstraksiyon işlemini kloroform ile tekrarlayın. Daha sonra, lineerleştirilmiş BAC DNA'sını etanol çöktürme yöntemiyle geri kazanın. DNA peletini santrifüjasyonla toplayın, süpernatantı dökün ve peleti bir mililitre %70 etanol ile yıkayın. Santrifüjasyon adımını tekrarlayın ve peleti havada kurutun. 10 dakikalık kurutma süresinin ardından, DNA peletini 30 µL distile su içerisinde çözün. Son olarak, geri kazanılan BAC'ın bir mikrolitresini %0,8 agaroz jel üzerinde inceleyin.Ardından, RNA miktar tayini için trityum işaretli-UTP içeren, lineerleştirilmiş BAC DNA'sının 25 µL'lik bir runoff transkripsiyonunu hazırlayın. Reaksiyonu 37 °C'de bir saat boyunca gerçekleştirin. Daha sonra, runoff transkripsiyon reaksiyonundan bir veya iki µL'yi %0,6'lık agaroz jel üzerinde inceleyin.150 milimetrelik kaplarda, kap başına 3 milyon hücre olacak şekilde ekilip 24 saat boyunca büyütülen BHK-21 hücreleri ile başlayın. Hücre tek tabakasını soğuk solüsyon A ile durulayın ve ardından tripsinizasyon yoluyla hücreleri ayırın. Hücreleri 270 g'de iki dakika santrifüj ederek toplayın.Ardından hücreleri 50 mililitre soğuk solüsyon A içinde yeniden süspande edin ve tekrar santrifüjleyin. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri solüsyon A içinde mililitrede 20 milyon olacak şekilde yeniden süspande edin. Daha sonra, hücre süspansiyonundan alınan 400 mikrolitrelik bir alikotu, iki mikrogram sentetik RNA ile birlikte iki milimetrelik bir küvette karıştırın.Karışımı optimal koşullar altında hızla elektropore edin ve hücrelerin 10 dakika boyunca dinlenmesini sağlayın. Ardından hücreleri, 600 µL tam kültür ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Şimdi, elektropore edilmiş hücrelerin birer mililitrelik hacimlerde on katlık seri dilüsyonlarını hazırlayın. Her dilüsyondan 100 µL'lik alikotları normal BHK21 hücre monokatmanlarına ekin. Dört ila altı saatlik inkübasyonun ardından, hücrelerin üzerine MEM artı FBS içeren %0,5'lik agaroz ekleyin ve hücreleri dört gün daha kültüre edin.BHK21 hücrelerine yalancı elektroporasyon yapıldı veya tam uzunluktaki JEV-BAC'ın iki bağımsız klonundan türetilen RNA transkriptleri ile elektroporasyon gerçekleştirildi. Dört gün sonra, hücrelerdeki enfektif RNA'yı görüntülemek için hücreler kristal viyole ile boyandı. Bu boyama kullanılarak enfektif merkezler nicel olarak belirlendi. Ardından, RNA elektroporasyonu yapılan hücrelerde viral protein ekspresyonu, transfeksiyondan 20 saat sonra anti-NS-one tavşan anti-serumu ve kırmızı renkte görülen Cy3-konjuge bir sekonder antikor kullanılarak incelendi. Çekirdekler, mavi renkte görülen DAPI ile karşıt boyandı. Daha sonra, transfeksiyondan 22 ve 40 saat sonra, RNA elektroporasyonu yapılan hücrelerin kültür süpernatantlarında biriken enfektif virion üretimi plak deneyleri ile incelendi.Bu videoyu izledikten sonra, Japon ensefaliti virüsü gibi pozitif suşlu bir cDNA klonundan, RNA'dan enfeksiyöz virüsün nasıl tamamen geri kazanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Japon ensefaliti virüsü ve diğer insan patojenleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce uygun biyogüvenlik eğitimi gereklidir.

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Kaynak: Yun, S. et al. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bakteriyel yapay kromozom klonundan transkribe edilen sentetik RNA'dan enfeksiyöz Japon ensefaliti virüsünün geri kazanımını göstermektedir. Hücrelerin sentetik RNA ile nasıl elektropore edildiğini ve böylece viral genomun yeni virionların üretimini nasıl yönlendirdiğini göstermektedir. Enfekte hücre monotonlarında oluşan plaklar,...

Bakteriyel Yapay Kromozom Kaynaklı Sentetik RNA ile Transfekte Edilen Hücrelerden İnfektif Viriyonların Elde Edilmesi

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

RNA virüsü çoğaltma sırasında üretilen çift iplikçikli RNA desen tanıma reseptörleri tarafından doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ikna etmek için kabul edilebilir. Negatif anlamda RNA virüsleri için alt düzey dsRNA ve PRRs arasındaki etkileşimi belirsizdir. Arenavirus dsRNA ve tek tek hücreleri içinde PRR görselleştirmek için confocal mikroskopi yöntemi geliştirdik.

Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Zika virüsü son salgını aşılar ve/veya terapötik stratejileri geliştirmek için ters genetik yaklaşımlar kurulması önemini vurgular. Burada, biz insan sitomegalovirus acil-erken Organizatör kontrolü altında bir bakteriyel yapay kromozom monte tam uzunlukta cDNA klon bir bulaşıcı rekombinant Zika virüsü kurtarmak için protokol tarif.

Bir bakteriyel yapay kromozom cDNA klon rekombinant Zika virüs kurtarma

Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.

Pozitif Anlamlı RNA Virüsü Varyantlarını Tasarlamak için Tersine Genetik

Burada, eklerin 3' ucunda uygun kısıtlama bölgelerini tanıtarak pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektörü doğrusallaştırabilir ve DNA parçalarını vektöre tek tek birleştirebiliriz.

Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüs Ekspresyon Vektör Yapısı için Kesintisiz Bir Klonlama Yaklaşımı

Biz çevre viral toplulukların tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA molekülleri ayırmak için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Nükleik asitler, fosfat içeren tamponlar artan konsantrasyonları ile hidroksiapatit kromatografisi kullanılarak fraksiyone. Bu yöntem, tüm çevre örneklerinden viral nükleik asit türleri izolasyonu izin verir.

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Öğrenin, bakteriyel yapay kromozom kullanarak Japon ensefalit virüsü gibi pozitif iplikli RNA virüslerinin klonlanmış cDNA'sından bulaşıcı virüs partiküllerini nasıl kurtaracağınızı. Bu yöntem viral genetik ve aşı geliştirme araştırmaları için değerli bir platform sunar.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Daha fazla video keşfet