Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Bu prosedürün genel amacı, Japon ensefalit virüsü gibi, genomları hücresel mRNA ile aynı polaritede olan pozitif zincirli RNA virüslerinin klonlanmış cDNA'larından tamamen enfektif virüs partiküllerinin geri kazanılmasıdır. cDNA tabanlı bu ters genetik yöntemi, viral genomik RNA'nın doğrudan manipülasyonuna olanak tanıyan ve böylece viral replikasyon ile patogenezin moleküler ve genetik çalışmaları için rekombinant virüslerin üretilmesini sağlayan temel bir yöntemdir. Bu teknik aynı zamanda, yabancı genlerin iletimi için genetik olarak tanımlanmış vaccinia viral vektörlerinin geliştirilmesine olanak tanıyan değerli bir platform sunmaktadır.

Bu yöntemler, negatif veya pozitif suşlar, RNA virüsleri ve özellikle genomları 10 kb'den büyük olanlar için tam uzunlukta cDNA klonlamada uygulanabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan araştırma asistanı Sang-Im Yun, doktora sonrası araştırmacılar Byung-Hak Song ve Jin-Kyoung Kim ve lisans öğrencisi Jordan Frank uygulamalı olarak gösterecektir.

Bu yayının video bölümü, ilgilenilen dizileri içeren bakteriyel yapay kromozomun hazırlanmasını, geri plazmitten transkribe edilen RNA sentezini ve RNA enfektivitesinin ve virüs veriminin nasıl ölçüleceğini kapsamaktadır. BAC plazmidi oluşturulmadan önce kullanılan tüm prosedürler, metin protokolünde ayrıntılı olarak sunulmuştur. Bu prosedür için, öncelikle BAC plazmidini taşıyan tek bir E. coli DH10B kolonisini, kloramfenikol içeren üç mililitre 2X YT besiyerinde büyütün. Kültürü 35 °C'de, 225 ila 250 RPM hızında çalkalayarak 10 saat boyunca inkube edin.

10 saat sonra kültürü ölçeklendirin. Ardından 500 µL büyüme kültürüyle 500 mL medyumu inoküle edin ve inokülumu kuvvetli çalkalama ile altı saat boyunca kültüre edin. Altı saat sonra, bakteriyel kültürü 2 adet 250 mL'lik şişede 4 °C'de 15 dakika boyunca 3.100 g ile santrifüjleyin. Daha sonra her bir peleti 30 mL GTE çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

500 µL lizozim ekleyin ve süspansiyonları buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Bu sırada, bir sonraki adım için taze lizis solüsyonu hazırlayın. 10 dakika sonra, 60 mL lizis solüsyonu ekleyin ve çözelti berrak görünene kadar çalkalayarak karıştırın.

Reaksiyonların oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sürmesini bekleyin. Ardından, her şişeye 45 mililitre nötralizasyon çözeltisi ekleyin ve şişeler tamamen karışana kadar altüst ederek karıştırın. Sonra, 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Nötralize edilmiş lizatlar, yüksek g değerli soğutmalı santrifüjasyon ile toplanır. Ardından süpernatanlar iki yeni 250 mililitrelik şişeye aktarılır. Her birine 0.6 hacim oranında %100 izopropanol eklenir ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.

Ardından, çökelekleri çöktürmek için santrifüjleyin, ardından süpernatantları atın ve peletleri beş mililitre TE tamponu ile çözün. İki hacmi tek bir 50 mililitrelik tüpte birleştirin ve eşit hacimde beş molar lityum klorür ekleyip karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek RNA'yı çöktürün. RNA çökeleğini toplamak için 20 dakikalık soğuk santrifüj uygulayın.

Ardından süpernatantı yeni bir 250 mililitre tüpe aktarın, iki hacim %100 isopropanol ekleyin ve DNA çökeleğinin oluşması için tüpü buza yerleştirin. 20 dakika sonra çökeleği santrifüjle çöktürün, süpernatantı aspire edin, DNA peletini 9,5 mililitre TE tamponunda yeniden süspande edin ve DNA çözeltisini 50 mililitre bir tüpe aktarın.

Sezyum klorür gradyanını etidyum bromür ile kurarak hazırlama işlemine devam edin. Karışımı, 18 gauge iğneli bir şırınga kullanarak sızdırmaz polipropilen tüpe yükleyin ve tüpü kapatın. Sezyum klorür gradyanı oluşturmak için kapatılan tüpü bir ultrasentrifüjde gece boyunca döndürün.

Ertesi gün, sezyum klorür gradyanından BAC plazmitinin DNA bandını toplayın. Gradyanın üst kısmında bir hava deliği açmak için 18 gauge iğne, gradyanın yan tarafından BAC DNA'sını toplamak için ise şırınga ile birlikte 20 gauge iğne kullanın ve ardından topladığınız örneği 1,7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yıkama işlemini gerçekleştirin, 2,5 hacim suyla doyurulmuş bütanol ekleyin ve normal vorteksleme ile karıştırın.

Ardından karışımı oda sıcaklığında santrifüjleyin ve alttaki sulu fazı yeni bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüm etidyum bromürü uzaklaştırmak için bu yıkama işlemini toplam altı kez tekrarlayın. Şimdi BAC DNA'sını çöktürün. Tüpe, hacmin onda biri kadar 3 molar sodyum asetat ve 2,5 hacim %100 etanol ekleyin. Karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Ardından çökeleği oda sıcaklığında santrifüjleyin ve DNA peletini bir mililitre %70 etanol ile yıkayın. Santrifüj işlemine tekrarlyın ve peleti yeniden toplayın. Son olarak, peletlenmiş DNA'yı 10 dakika boyunca havada kurutun ve 200 mikrolitre TE tamponunda elüe edin.

BAC plazmidinin Xba-one ile toplam 100 microliters hacimde geniş ölçekli bir restriksiyon enzimi sindirimi ile başlayın. Bu sindirimi 37 degrees Celsius'te 12 ila 15 saat boyunca gerçekleştirin. Ardından, sindirim karışımını ek 25 units mung-bean nuclease ile 30 degrees Celsius'te iki saat daha inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, hacmi distile su ile 300 µL'ye tamamlayın. Ardından, seyreltilmiş numuneye eşit hacimde fenol-kloroform, izoamil alkol ekleyerek, bir dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyerek, tüpü santrifüjleyerek ve üstteki sulu fazı yeni bir tüpe aktararak fenol ekstraksiyonu gerçekleştirin.

Ardından ekstraksiyon işlemini kloroform ile tekrarlayın. Daha sonra, lineerleştirilmiş BAC DNA'sını etanol çöktürme yöntemiyle geri kazanın. DNA peletini santrifüjasyonla toplayın, süpernatantı dökün ve peleti bir mililitre %70 etanol ile yıkayın. Santrifüjasyon adımını tekrarlayın ve peleti havada kurutun. 10 dakikalık kurutma süresinin ardından, DNA peletini 30 µL distile su içerisinde çözün. Son olarak, geri kazanılan BAC'ın bir mikrolitresini %0,8 agaroz jel üzerinde inceleyin.

Ardından, RNA miktar tayini için trityum işaretli-UTP içeren, lineerleştirilmiş BAC DNA'sının 25 µL'lik bir runoff transkripsiyonunu hazırlayın. Reaksiyonu 37 °C'de bir saat boyunca gerçekleştirin. Daha sonra, runoff transkripsiyon reaksiyonundan bir veya iki µL'yi %0,6'lık agaroz jel üzerinde inceleyin.

150 milimetrelik kaplarda, kap başına 3 milyon hücre olacak şekilde ekilip 24 saat boyunca büyütülen BHK-21 hücreleri ile başlayın. Hücre tek tabakasını soğuk solüsyon A ile durulayın ve ardından tripsinizasyon yoluyla hücreleri ayırın. Hücreleri 270 g'de iki dakika santrifüj ederek toplayın.

Ardından hücreleri 50 mililitre soğuk solüsyon A içinde yeniden süspande edin ve tekrar santrifüjleyin. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri solüsyon A içinde mililitrede 20 milyon olacak şekilde yeniden süspande edin. Daha sonra, hücre süspansiyonundan alınan 400 mikrolitrelik bir alikotu, iki mikrogram sentetik RNA ile birlikte iki milimetrelik bir küvette karıştırın.

Karışımı optimal koşullar altında hızla elektropore edin ve hücrelerin 10 dakika boyunca dinlenmesini sağlayın. Ardından hücreleri, 600 µL tam kültür ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Şimdi, elektropore edilmiş hücrelerin birer mililitrelik hacimlerde on katlık seri dilüsyonlarını hazırlayın. Her dilüsyondan 100 µL'lik alikotları normal BHK21 hücre monokatmanlarına ekin. Dört ila altı saatlik inkübasyonun ardından, hücrelerin üzerine MEM artı FBS içeren %0,5'lik agaroz ekleyin ve hücreleri dört gün daha kültüre edin.

BHK21 hücrelerine yalancı elektroporasyon yapıldı veya tam uzunluktaki JEV-BAC'ın iki bağımsız klonundan türetilen RNA transkriptleri ile elektroporasyon gerçekleştirildi. Dört gün sonra, hücrelerdeki enfektif RNA'yı görüntülemek için hücreler kristal viyole ile boyandı. Bu boyama kullanılarak enfektif merkezler nicel olarak belirlendi. Ardından, RNA elektroporasyonu yapılan hücrelerde viral protein ekspresyonu, transfeksiyondan 20 saat sonra anti-NS-one tavşan anti-serumu ve kırmızı renkte görülen Cy3-konjuge bir sekonder antikor kullanılarak incelendi. Çekirdekler, mavi renkte görülen DAPI ile karşıt boyandı. Daha sonra, transfeksiyondan 22 ve 40 saat sonra, RNA elektroporasyonu yapılan hücrelerin kültür süpernatantlarında biriken enfektif virion üretimi plak deneyleri ile incelendi.

Bu videoyu izledikten sonra, Japon ensefaliti virüsü gibi pozitif suşlu bir cDNA klonundan, RNA'dan enfeksiyöz virüsün nasıl tamamen geri kazanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Japon ensefaliti virüsü ve diğer insan patojenleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce uygun biyogüvenlik eğitimi gereklidir.