Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Bu prosedürün genel amacı, genomları Japon ensefalit virüsü gibi hücresel Mr.NA ile aynı polaritede olan RNA virüslerinin klonlanmış bir CDNA'sından tamamen yapılan bulaşıcı virüs parçacıklarını kurtarmaktır. Bu CNA tabanlı regen genetiği, viral genomik RNA'nın doğrudan manipülasyonunu sağlayan ve böylece viral replikasyon ve patogenezde moleküler ve genetik çalışma için rekombinant virüsler üreten semial bir yöntemdir. Bu teknik aynı zamanda yabancı genlerin verilmesi için genetik olarak tanımlanmış aşı ve viral vektörlerin geliştirilmesine izin veren değerli bir platform sağlar.

Bu damarlar, uzunluk veya pozitif suş, RNA virüsleri, özellikle de 10 kb'den büyük genomlara sahip olanlar için tam uzunlukta CDNA'nın klonlanması için geçerlidir. Prosedürü göstermek, laboratuvar araştırma asistanım Profesör San Nun'un doktora sonrası araştırmacısı UNG ve Xing y Kim ve lisans öğrencileri Jordan Frank'in birkaç üyesi olacak. Bu yayının video kısmı, ilgilenilen dizileri içeren bakteriyel yapay kromozomun hazırlanmasını, arka plazmitten kopyalanan RNA'nın sentezini ve RNA'ların enfektivitesinin ve virüs veriminin nasıl ölçüleceğini kapsar.

Geri plazmid oluşturulmadan önce kullanılan tüm prosedürler metin protokolünde ayrıntılı olarak verilmiştir. Bu prosedür için, önce tek bir e coli DH 10 B kolonisi büyütün, sırt plazmidini kloramfenikol ile üç mililitre iki XYT suyunda taşıyın. Kültürü 225 ila 250 RPM'de çalkalayarak 35 santigrat derecede 10 saat inkübe edin.

10 saat sonra, kültürü ölçeklendirin, daha sonra 500 mikrolitre büyümeyi 500 mililitre ortama aşılayın ve altı saat sonra kuvvetli çalkalama ile aşıyı altı saat boyunca yetiştirin. Bakteri kültürünü 2 250 mililitrelik şişelerde 3, 100 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Daha sonra her peleti 30 mililitre GTE çözeltisinde yeniden süspanse edin.

500 mikrolitre lizozim ekleyin ve süspansiyonları buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Bu arada, bir sonraki adım için taze lizis çözeltisi hazırlayın. 10 dakika sonra, 60 mililitre lizis solüsyonu ekleyin ve solüsyon berrak görünene kadar döndürerek karıştırın.

Reaksiyonların oda sıcaklığında 10 dakika kalmasına izin verin. Daha sonra, her şişeye 45 mililitre nötralizasyon çözeltisi ekleyin ve şişeleri iyice karışana kadar ters çevirin. Sonra onları 10 dakika buza koyun.

Nötralize lizatları yüksek G soğutmalı santrifüjleme ile toplayın. Ardından süpernatanları iki yeni 250 mililitrelik şişeye toplayın. Her birine 0,6 hacim %100 izopropanol ekleyin ve 20 dakika buzda bekletin.

Daha sonra, çökeltileri döndürün, ardından süpernatanları atın ve peletleri beş mililitre TE tamponu içinde çözün. İki hacmi 50 mililitrelik tek bir tüpte birleştirin ve eşit hacimde beş molar lityum klorür ekleyerek ve karışımı buz üzerinde 10 dakika inkübe ederek RNA'yı çökeltin. RNA çökeltisini toplamak için 20 dakikalık bir soğuk santrifüjleme kullanın.

Ardından süpernatanı 250 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. İki hacim %100 izopropanol ekleyin ve tüpü buzun üzerine koyun, böylece DNA çökeltisi oluşacaktır. 20 dakika sonra, çökeltiyi aşağı döndürün, süpernatanı aspire edin, DNA peletini 9.5 mililitre TE tamponunda yeniden süspanse edin ve DNA çözeltisini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Sezyum klorür gradyanını bir inci dium bromür ile ayarlayarak hazırlığa devam edin. Karışımı, 18 gauge iğneli bir şırınga kullanarak sızdırmaz bir polipropilen tüpe yükleyin ve tüpü kapatın. Bir sezyum klorür gradyanı oluşturmak için kapalı tüpü gece boyunca bir ultrasantrifüjde döndürün.

Ertesi gün, sezyum klorür gradyanından bir geri plazmit DNA bandı toplayın. Degradenin tepesinde bir havalandırma deliği oluşturmak için 18 gauge bir iğne ve gradyanın yanından arka DNA'yı toplamak için şırıngalı 20 gauge bir iğne kullanın ve ardından koleksiyonu 1.7 mililitrelik bir mikro fuge tüpüne aktarın. Bir yıkama yapın, 2.5 hacim suya doymuş bütanol ekleyin ve normal girdap ile karıştırın.

Daha sonra karışımı oda sıcaklığında santrifüjleyin ve alt sulu fazı yeni bir 1.7 mililitrelik mikro füj tüpüne aktarın. Tüm etidyum bromürü çıkarmak için bu yıkamayı toplam altı kez tekrarlayın. Şimdi sırt DNA'sını çökeltin.

Tüpe 10'uncu hacimde üç molar sodyum asetat ve 2.5 hacim %100 etanol ekleyin. Karışımı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Daha sonra çökeltiyi oda sıcaklığında santrifüjleyin ve DNA peletini bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın.

Dönüşü tekrarlayın ve peleti tekrar toplayın. Son olarak, peletlenmiş DNA'yı 10 dakika havayla kurutun ve 200 mikrolitre TE tamponunda ute edin. Sırt plazmidinin xbo ile büyük ölçekli bir kısıtlama enzimi sindirimi ile başlayın.

Toplam 100 mikrolitre hacimde bir. Bu sindirimi 37 santigrat derecede 12 ila 15 saat boyunca gerçekleştirin. Daha sonra, sindirimi iki saat boyunca 30 santigrat derecede 25 birim maş fasulyesi nükleazı ile daha da inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, damıtılmış su ile hacmi 300 mikrolitreye getirin. Şimdi seyreltilmiş numuneye eşit hacimde fenol kloroform, izoamil alkol ekleyerek bir fenol ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bir dakika boyunca kuvvetlice girdap, tüpü aşağı döndürme ve üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarma.

Sonra ekstraksiyonu kloroform ile tekrarlayın. Daha sonra, etanol çökeltme ile doğrusallaştırılmış arka DNA'yı geri kazanın. DNA peletini santrifüjleme ile toplayın, süpernatanı atın ve peleti bir mililitre% 70 etanol ile yıkayın.

Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve peleti havayla kurutun. 10 dakika kuruduktan sonra, DNA peletini 30 mikrolitre damıtılmış suda çözün. Ardından, geri kazanılan bir mikrolitreyi %0.8'lik bir AROS jeli üzerinde inceleyin.

Daha sonra, RNA nicelemesi için tritiye UTP dahil olmak üzere doğrusallaştırılmış arka DNA'nın 25 mikrolitrelik bir akış transkripsiyonunu ayarlayın. Reaksiyonu bir saat boyunca 37 santigrat derecede gerçekleştirin. Daha sonra% 0.6'lık bir AROS jeli üzerinde akış transkripsiyon reaksiyonunun bir veya iki mikrolitresini inceleyin.

Tabak başına 3 milyon hücre ile kaplanmış 150 milimetrelik tabaklarda 24 saat boyunca büyütülen BHK 21 hücre ile başlayın. Hücre tek tabakasını soğuk çözelti A ile durulayın ve ardından tripsin ile ayırın. Izasyon. Hücreleri iki dakika boyunca 270 GS'de santrifüjleme ile toplayın.

Daha sonra hücreleri 50 mililitre soğuk çözelti A içinde yeniden süspanse edin ve tekrar döndürün. Son yıkamadan sonra bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Hücreleri çözelti A'da mililitre başına 20 milyonda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunun 400 mikrolitrelik bir alikotunu iki milimetrelik bir vete iki mikrogram sentetik RNA ile karıştırın.

Karışımı en uygun koşullar altında derhal elektro saflaştırın ve hücrelerin 10 dakika dinlenmesine izin verin. Daha sonra hücreleri 600 mikrolitre tam kültür ortamı içeren bir mikro füj tüpüne aktarın. Şimdi, dört ila altı saatlik inkübasyondan sonra normal bhk 21 hücrelerinin tek katmanları üzerinde her seyreltmenin 100 mikrolitrelik bir mililitre hacminde elektroporasyonlu hücrelerin on kat seri seyreltmesini hazırlayın, hücreleri MEM artı FBS'de% 0.5 aros ile kaplayın ve dört gün daha kültürleyin.

Bhk 21 hücreleri, tam uzunlukta JEV'in iki bağımsız klonundan türetilen RNA transkriptleri ile sahte elektroporasyonlu veya elektroporasyonlu hale getirildi Dört gün sonra, hücrelerdeki enfeksiyöz RNA'yı görüntülemek için hücreler kristal viyole ile boyandı. Bu leke kullanılarak, bulaşıcı merkezler ölçüldü. Daha sonraki viral protein ekspresyonu, transfeksiyondan 20 saat sonra RNA Elektroporasyonlu hücrelerde anti NS, bir tavşan antis serumu ve kırmızı renkte görülen bir SI üç konjuge ikincil antikor kullanılarak incelendi.

Çekirdekler, mavi renkte görülen DAPI ile karşı boyandı. Daha sonra transfeksiyondan 22 ve 40 saat sonra, kültürde biriken enfeksiyöz varyanların üretimi meydana geldi. RNA elektroporasyonlu hücrelerin süpernatanları plak testleri ile incelendi.

Bu videoyu izledikten sonra, enfeksiyöz virüsü, Japon ensefalit virüsü gibi klonlanmış bir pozitif suş olan RNA'dan tamamen nasıl kurtaracağınızı iyi anlamalısınız. Bu nedenle, bir Japon ensefalit virüsü ve diğer insan patojenleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce uygun biyogüvenlik eğitimi gereklidir.