Çabuk In Situ Melezleme

Bu prosedürün genel amacı, paraform aldehit önceden eklenmiş beyin dokusu üzerinde hızlı bir C iki hibridizasyonunu gerçekleştirmektir. Bu, önce beyin dokusu bölümlerinin kurutulması ve bölümlerin ön işlem bir, iki ve üç reaktif ile muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bölümleri birincil oligonükleotid probları ve ardından ikinci, üçüncü ve dördüncü problarla hibritleştirmektir.

Ardından, hedef RNA'yı tespit etmek için hızlı kırmızı substrat ekleyin. Son adım, Image J yazılımı ile mRNA sinyallerinin seviyesini ölçmektir. Sonuç olarak, RNA gen ekspresyonundaki değişiklikler, deney ve kontrol gruplarının karşılaştırılmasıyla elde edilebilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, nispeten basit, ucuz, tekrarlanabilir olması ve tamamlanmasının iki günden az sürmesidir. Bu çalışma ben ve Ross Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi'nden John Jay Lenan ve Florida Atlantik Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Jean Soza ve RU Tao tarafından geliştirilmiştir. Bu prosedürde, dehidrasyonu, negatif 80 santigrat derece dondurucuda saklanan mikroskop slayt kutularından dört slayt alır.

Bölümleri P-P-I-B-D-A-P-B ve HT testlerine atayın, iki A geni işaretleyin ve bunları bir tükenmez kalemle etiketleyin. Ardından, slaytları oda sıcaklığında% 100 alkole beş dakika batırın. Ardından, slaytları çeker ocakta beş dakika kurutun, ön işlem için 20 mikrolitre ön işlem pipetleyin, her bölüme bir reaktif pipetleyin, slaytları bir nem tepsisindeki bir raf rayına yerleştirin.

Nem tepsisini yatay bir çalkalayıcı üzerinde düşük hızda 10 dakika boyunca hafifçe sallayın. Daha sonra slaytları iki dakika boyunca çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın. Slaytları, 450 mililitre ön işlem iki reaktifi içeren 1000 mililitrelik bir behere batırın.

Ardından, RNA yapısını eski haline getirmek için slaytları 100 santigrat derecede toplam beş dakika kaynatın. Bundan sonra, slaytları her seferinde iki dakika boyunca çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın. Slaytları beş dakika boyunca% 100 alkole yerleştirin.

Ardından slaytları beş dakika kurutun. Çeker ocakta, doku bölümünde seçilen alanın etrafına bir daire çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Daha sonra, prob penetrasyonunu artırmak ve nem tepsisini bir kapakla kapatmak için seçilen her alana 10 mikrolitre ön işlem üç reaktifi pipetleyin.

Ardından, tepsiyi yatay bir çalkalayıcı ile donatılmış hibridizasyon fırınına yerleştirin. Fırın sıcaklığını 40 santigrat dereceye ayarlayın ve tepsiyi 30 dakika hafifçe sallayın Daha sonra slaytları iki kez çift damıtılmış suyla her seferinde iki dakika yıkayın. Bu adımda, seçilen alanlara 10 mikrolitre P-P-I-B-D-A-P-B veya HTR iki A prob pipetleyin.

Ardından, reaktifin buharlaşmasını önlemek için nem tepsisini bir kapakla örtün. Slaytları 40 santigrat derecede fırında iki saat inkübe ederken yatay çalkalayıcı üzerinde düşük hızda hafifçe sallayın. Daha sonra, slaytları her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon bir reaktif pipetleyin.

Slaytları 30 dakika boyunca 40 santigrat derecede çalkalayın ve inkübe edin. Daha sonra slaytları her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon iki reaktifi pipetleyin. Slaytları 40 derecede 15 dakika çalkalayın ve inkübe edin.

Bundan sonra, slaytları iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Her seferinde, seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon üç reaktifi pipetleyin. Slaytları 30 dakika boyunca 40 santigrat derecede çalkalayın ve inkübe edin.

Ardından slaytları iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon dört reaktifi pipetleyin. Slaytları 40 derecede 15 dakika çalkalayın ve inkübe edin.

Daha sonra, slaytları iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon beş reaktifi pipetleyin. Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayın ve inkübe edin.

Daha sonra, slaytları iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon altı reaktifi pipetleyin. Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika çalkalayın ve inkübe edin.

Daha sonra slaytları her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez tekrar yıkayın. Şimdi seçilen her alana 10 mikrolitre kırmızı reaktif pipetleyin, slaytları oda sıcaklığında yatay çalkalayıcı üzerindeki nem tepsisine yerleştirin ve 10 dakika boyunca düşük hızda hafifçe çalkalayın. Daha sonra slaytları iki kez çift damıtılmış suyla 10 dakika yıkayın.

Her seferinde slaytları 60 derecelik fırında 15 dakika kurutun. Bundan sonra, slaytları beş dakika boyunca çeker ocakta ksilen içine yerleştirin. Ardından, seçilen her alana 20 mikrolitre ksilen bazlı montaj ortamı pipetleyin ve bir kapak fişi ile örtün.

Bu adımda, görüntü dosyasını ana görüntü J penceresine sürükleyip bırakın. Menü çubuğuna gidin ve resmi seçin. Ardından, açılır menüden türü seçin ve sekiz biti seçin.

Ardından, ayarla'yı seçin ve ardından iletişim kutusunu açmak için eşiği seçin. İstenmeyen arka plan kaldırılacak şekilde iletişim kutusundaki alt çubuk değerini ayarlayın. Menü çubuğuna gidin ve Analiz Et'i seçin, ardından ikinci bir iletişim kutusu açmak için parçacıkları analiz et'i seçin.

Parçacık boyutunu 10 olarak ayarlayın. Ardından, ana hatları göster'i seçin ve sonuçları görüntüle'yi ve kutuları özetle'yi seçin. Son olarak, iletişim kutularındaki parçacık verilerini görüntülemek için Tamam'a tıklayın.

Elektronik tablo hesaplaması için, verileri Excel sayfasına girin ve temel olarak tuzlu su grubundaki parçacıkların sayısının ortalamasını alın. Ardından her bölümün yüzde seviyesini hesaplayın ve buna göre bir grafik oluşturun. İşte kırmızı noktalarla gösterilen hibridizasyon sinyallerinin ışık mikroskobik görünümleri.

Daha önce salin ve MDMA ile tedavi edilen derin anestezi uygulanmış sıçanlarda dokular paraform aldehit ile önceden sabitlendi. Kullanılan oligonükleotid probları D-A-P-B-P-P-I-B ve HT iki A'dır.Bu şekil, daha önce MDMA ile tedavi edilen sıçanlarda hipotalamik HT iki A gen ekspresyonu üzerindeki etkiyi ve HT ikide% 20'lik bir azalma olduğunu göstermektedir, bir ekspresyon gözlenmiştir. Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, yükseklik önceden eklenmiş beyin dokusu olan paraform üzerinde yerinde izasyonu kullanarak, haberci RA'nın gen ekspresyonunu ölçmelerini kolaylaştırır.