Name: Çabuk In Situ Melezleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Öğrenin, fare beyin dokusunda htr2a geni tespiti için hızlı in situ hibridizasyon yöntemini. Bu basitleştirilmiş protokol, geleneksel yöntemlere göre işlem süresini önemli ölçüde kısaltarak güvenilir mRNA sinyalleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe (R15DA029863) tarafından desteklenmiştir, Florida Atlantic Üniversitesi lisans araştırma bursu (M30014) ve Veterinerlik Araştırma hibe Ross Üniversitesi. Biz bu iş için (±) 3,4-metilendioksimetamfetamin (± MDMA) sağlamak için Uyuşturucu Bağımlılığı Ulusal Enstitüsü (Rockville, MD) teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıda açıklanan Hayvan kullanım prosedürleri Veteriner Ross Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Florida Atlantic University tarafından onaylanmıştır. Steril teknikler ve eldiven gerekli olmasına rağmen, bu protokolü kullanarak, RNaz içermeyen ortamda gerekli değildir. 1. Hazırlık <ol><li> Doku hazırlanması ve kesit <ol><li> Üç gruba rastgele Fareleri atama:;, SAL / öneki ve / 3,4-metilendioksimetamfetamin önüne taze / tuz (% 0.9 NaCI SAL) (MDMA, Tablo 1&#39;de ayrıntıları bakınız). </li><li> 2 saat aralığında SAL ve MDMA grupları, intraperitonal, sırası ile 1 ml / kg SAL ve 10 mg / kg MDMA üç doz uygulayın. Hayvanlar 6 gün boyunca tedavi hayatta izin verin. </li><li> 7. günde, 5 mg kombinasyon halinde 100 mg / kg ketamin uygulama / periton içine derin bir anestezi için sıçanlarda (kadar ksilazin kg, yani kornea yanıp sönme ve ta kaybıil) refleksleri çimdik. </li><li> Taze / SAL grubunda, hızlı fareleri başını kesmek ve (referans 5 detaylarını görmek) taze beyin testi için beyin kaldırmak. </li><li> SAL / öneki ve öneki / MDMA grupları için, sternum yaklaşık 10 -12 cm boyunca bir kesim yapmak ve daha sonra sternum sonunu maruz. </li><li> Hemostatla sternum ucunu tutun ve keskin bir makas ile her iki tarafta yanal diyafram kesilmiş ve sonra akciğerlere kaburga ve paralel boyunca yukarı kesti. </li><li> Tek bir el ile, küçük forseps ile kalbin ventral ucunu tutun. Öte yandan ile, 18 G şırınga iğnesiyle sol ventrikül delmek (buz soğukluğunda SAL ve paraformaldehit konteyner ve peristaltik pompa için bir Y-şekilli silikon hortum ile bağlantılı olan iğne bağdaştırıcı yönüne dikkat edin, bakınız, referans 9). </li><li> Akış hızı (~ 5 ml / dk) orta düzeyde SAL pompası açın ve getiri circ kaçmasını sağlamak için forseps ile sağ atrium delinmeulation. 30 dakika boyunca SAL perfüzyon koruyun. </li><li> Orta düzeyde paraformaldehid pompası açın ve buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid 30 dakika süreyle hayvan serpmek için izin verir. </li><li> Perfüzyon aleti çıkarın ve hayvan başını kesmek. Kafatası orta hat boyunca kesilmiş bir posteroanterior yapın ve sonra kafatası boşluğu 10 maruz kafatası flap. </li><li> Kafatası boşluğundan bir spatula ile beyin çıkarın ve 25 ml% 4 paraformaldehid içeren 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne beyin yerleştirin. 24 saat süreyle 4 ° C buzdolabı da paraformaldehid içeren tüp içinde beyin tutun. </li><li> 3 gün boyunca 4 ° C&#39;de% 30 sukroz çözeltisi 25 ml içeren 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine beyin taşıyın. Son olarak, kullanıcı kadar -80 ° C&#39;de plastik torbalar içinde beyin saklayın. </li><li> Gömme medya ile bir aynanın üzerinde beyin takın ve -26 ºC sıcaklıkta bir kriyostat beyin içeren gömme medya dondurma. Taze dondu Cutn 20 mikron bölüme beyin ve 10 mikron bölüme beyin paraformaldehid-öneki. Bölümüne slayt dokunarak RT mikroskop lamı bölümü aktarın. </li><li> Hava, kuru 4 saat oda sıcaklığında karıştırıldı. Kullanım kadar -80 ° C&#39;de sıkı kapatılmış torbaya bölümü slaytlar saklayın. </li></ol></li><li> Dehidrasyon <ol><li> -80 ° C derin dondurucuda slaytları alın ve üç testleri içine bölümleri atayın: HT2A, ppiB (pozitif kontrol) ya da dapB (negatif kontrol); işareti ve bir tükenmez kalem ile etiket bölümleri (kalem kullanmayın). 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 alkol slaytlar daldırın. Davlumbaz 5 dakika boyunca slaytlar kurulayın. </li></ol></li><li> Tedavi öncesi <ol><li> Pipet slaytlar bölümlerine Tedavi öncesi-1 reaktif 20 ul (alkalin fosfataz inaktivasyonu). Bir nem tepsisine bir raf ray üzerinde slaytlar yerleştirin (tepsi reaksiyon solutio buharlaşma önlemek için yüksek nem korumak için bir kapak ile örtülü olduğuna dikkatn). </li><li> Yavaşça 10 dakika için düşük hızda yatay çalkalayıcı üzerinde nem tepsisini sallayın. 2 dakika boyunca iki kez damıtılmış su (GKD 2 O) ile iki kez slaytlar yıkayın. (Paraformaldehid sabitleme ile indüklenen çapraz-bağların kırılması) ön tedavi-2 reaktifin 150 ml içeren 200 ml&#39;lik bir cam slayt daldırın. 100 ° C (RNA yapısı 11 ısı ile indüklenen restorasyonu) 5 dakika toplam slaytlar kaynatılır. </li><li> 2 dakika boyunca GKD 2 O ile iki kez slaytlar yıkayın. 5 dakika boyunca% 100 alkol slaytlar yerleştirin. Bir çeker ocak içinde 5 dakika için slaytlar kurutun. Doku bölümünde seçilen alanın etrafında bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın (örneğin, Şekil 2&#39;de belirtildiği gibi talamus ve hipotalamus dahil olmayan kortikal yapılar). </li><li> Pipet Ön İşlem-3 reaktifi Seçilen her alana (prob penetrasyon artış) 10 ul ve kapaklı nem tepsisini kapatın. Hibridizasyon fırında tepsi yerleştirinYatay çalkalayıcı ile donatılmış ve 40 ºC de fırın sıcaklığını ayarlamak; yavaşça 30 dakika süreyle tepsiyi sallayın. 2 dakika boyunca GKD 2 O ile iki kez slaytlar yıkayın. </li></ol></li></ol> 2. Hibridizasyon ve amplifikasyon <ol><li> Pipet seçilmiş alanlarda sırasıyla htr2a ppiB ve dapB prob reaktifler 10 ul,. Reaktifin buharlaşmasını önlemek için kapaklı nem tepsisini örtün. Yavaşça düşük hızda ayarlanmış yatay çalkalayıcı üzerinde sallayın. 2 saat boyunca fırında 40 ºC &#39;de slaytlar inkübe edin. </li><li> 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda Amplifikasyon-1 reaktif 10 ul, sallamak ve 30 dakika boyunca 40 ºC de slaytlar kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda Amplifikasyon-2 reaktif 10 ul, sallamak ve 15 dakika boyunca 40 ºC de slaytlar kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> İki kez w slaytlar yıkayın2 dakika için bir yıkama tamponu i. Pipet seçilen her alanda Amplifikasyon-3 reaktif 10 ul, sallamak ve 30 dakika boyunca 40 ºC de slaytlar kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda Amplifikasyon-4 reaktif 10 ul, sallamak ve 15 dakika boyunca 40 ºC de slaytlar kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda amplifikasyonu-5 reaktifi 10 ul sarsıntı ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe slaytlar. </li><li> 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. Pipet seçilen her alanda amplifikasyonu-6 reaktifi 10 ul sarsıntı ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe slaytlar. 2 dakika için bir yıkama tamponu ile iki kez slaytlar yıkayın. </li></ol> 3. Sinyal Algılama <ol><li> Seçilen her alana Kırmızı reaktif Pipet 10 ul (reaktif kırmızı-B ve Kızıl-A karışımı bir 1:60 oranında ve i kullanılması gerektiğini unutmayınmmediately). RT&#39;de yatay çalkalayıcı üzerinde nem tepsisine slayt yerleştirin ve 10 dakika boyunca düşük bir hızda yavaşça sallayın. </li><li> 10 dakika boyunca (GKD 2 O) ile iki kez slaytlar yıkayın. 15 dakika fırında 60 ºC &#39;de slaytlar kurulayın. 5 dakika boyunca davlumbaz altında ksilen slaytlar yerleştirin. Pipet 20 Seçilen her alanda ksilen bazlı montaj medya ul ve bir lamel ile kaplayın. </li></ol> 4. Görüntü Yakalama <ol><li> 4 × ve 20 × objektif lens büyütme ile seçilmiş alanlarda (örneğin, hipotalamus, 1 ve 3 Şekiller) dijital Mikro fotoğraflar çekin. Görüntü dosyasını kaydedin. </li></ol> 5. Görüntü Parçacık Analizi <ol><li> Sürükle ve ana ImageJ penceresinin içine görüntü dosya açılır. Menü çubuğuna gidin ve &#39;Resmi&#39; seçeneğini, yanındaki açılır menüden &#39;Tip&#39; seçin ve &#39;8-bit&#39; seçeneğini seçin. </li><li> Seçin &#39;Thr seçin&#39; ayarlama &#39;eshold &#39;iletişim kutusunu açmak için. Istenmeyen arka plan çıkarılır, böylece iletişim kutusunda alt bar değerini ayarlayın. Daha sonra ikinci bir iletişim kutusunu açmak için &#39;Parçacıklar Analiz&#39; seçeneğini menü çubuğuna gidin ve &#39;Analiz&#39; seçeneğini seçin. </li><li> 10&#39;da partikül boyutunu ayarlama, yanındaki &#39;Show özetliyor&#39; seçin ve &#39;sonuçlarını görüntüle &quot;ve&quot; özetlemek&#39; kutularını seçin. Son olarak, iletişim kutularındaki parçacık verileri görüntülemek için &#39;Tamam&#39; ı tıklatın. </li></ol> 6. Çizelge Hesaplama <ol><li> Excel sayfası içine verileri girin ve bir başlangıç ​​olarak SAL grubundaki parçacıkların sayıları ortalama. Her bölümün yüzde düzeyini hesaplamak ve bir grafik buna göre (Şekil 4) yapmak. </li></ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
<li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome%2C+severe+rhabdomyolysis%2C+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung%22%5BJournal%5D)">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li>
<li>Bosch, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verbal+memory+deficits+are+correlated+with+prefrontal+hypometabolism+in+18FDG+PET+of+recreational+MDMA+users%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+On%22%5BJournal%5D)">Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users.</a> PLoS On. 8, e61234(2013).</li>
<li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmaco%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li>
<li>Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+radioactive+in+situ+hybridization+using+full+length+hydrolyzed+riboprobes+to+detect+%CE%B12+adrenoceptor+subtype+mRNAs+in+adult+and+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Proto%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain.</a> Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).</li>
<li>Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-ethylmaleimide+%28NEM%29+can+significantly+improve+in+situ+hybridization+results+using+35S-labeled+oligodeoxynucleotide+or+complementary+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes.</a> J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diag%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> J Vis E. , (2014).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis E. , (2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pericytes+and+capillary+diameter+in+brain+slices+and+isolated+retinae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proto%22%5BJournal%5D)">Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae.</a> Nat Proto. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).</li>
<li>Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+in+rat+dentate+granule+cells%3A+comparison+between+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Method%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue.</a> J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).</li>
<li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li>
<li>Mijnster, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+cellular+distribution+of+serotonin+5-hydroxytryptamine2a+receptor+mRNA+in+the+nucleus+accumbens%2C+olfactory+tubercle%2C+and+caudate+putamen+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neuro%22%5BJournal%5D)">Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat.</a> J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroche%22%5BJournal%5D)">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li>
<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
<li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacolog%22%5BJournal%5D)">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li>
<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

İn situ hibridizasyon testinin en büyük endişelerinden biri, RNaz enzimleri nedeniyle RNA'nın korunması için kullanılan uygun tekniklerin seçilmesidir. Bu enzimlerin hücrelerde ve çevrede yaygın olarak bulunduğu ve sonuçları etkileyebileceği iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, enzim aktivitesi, dokuyu kuru buz/alkol çözeltisine5,12 yerleştirerek hızlı bir şekilde ayırt edilebilir. Bir riboprob13 kullanılarak hibridizasyon için hızlı koruma kritik öneme sahip olsa da, oligonükleotit problar...

Serotonin (5-hidroksitriptamin; 5-HT) sendromu, antidepresanlar 1 gibi 5-HT'yi teşvik eden ilaçlarınneden olduğu akut bir nörolojik bozukluktur ve aynı zamanda MDMA'nın eğlence amaçlı kullanımı durumlarında da ortaya çıkar2. Akut sendromla ilişkili olarak ortaya çıkan duygudurum değişimleri, öğrenme ve hafıza eksikliklerinden sorumlu moleküler mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır3,4. İn situ hibridizasyon, potansiyel olarak tek hücre düzeyinde eksprese edilen spesifik mRNA'ların saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren güçlü bir araştırma aracıdır. İn situ hibridizasyonun gerçekleştirilmesinin geleneksel yolu, ilgilenilen geni spesifik olarak hibritleştiren radyoaktif etiketli bir riboprob kullanmaktır. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, yöntemin karmaşık ve zaman alıcı prob hazırlama ve hibridizasyon adımlarının yanı sıra RNaz içermeyen bir ortamda tutulan taze donmuş dokulara erişim gerektirmesidir5,6. 
Oligonükleotid problar, riboproblar7 için gerekli olanlardan daha kısa RNA fragmanlarını hibritleştirmek için yakın zamanda geliştirilmiştir. Ayrıca, problar, özgüllükten8 ödün vermeden düşük bir arka plan sinyali üretir. Bu yeni geliştirilen prob teknolojisi, immünositokimya laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan paraformaldehit preekli beyin dokuları üzerinde yerinde hibridizasyonda kullanılabilir.
Burada, paraformaldehit önceden sabitlenmiş sıçan beyninde oligonükleotid probları kullanarak yerinde hibridizasyon için bir protokol açıklıyoruz ve bulguları taze donmuş beyinde belirtilenlerle karşılaştırıyoruz5,6. Bu protokol, MDMA madde kötüye kullanımının beyindeki 5-HT2A reseptör geni htr2a mRNA'da değişikliklere neden olduğu hipotezini test etmek için kullanılır. Prosedüre MDMA tedavisi ile başladık, ardından hayvanın paraformaldehit doku perfüzyonu, thr2a probunun in situ hibridizasyonu, veri analizi yapıldı. DapB'nin (dihidrodipikolinat redüktazı kodlayan bakteri geni) negatif kontrol olarak ve ppiB'nin (peptidilprolil izomeraz B'yi kodlayan temizlik geni) pozitif kontrol olarak kullanıldığını unutmayın.

<table><tbody><tr><td>RNAscope Negatif Kontrol Probu-DapB</td><td>Gelişmiş hücre teşhisi, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pretreat 4</td><td>İleri hücre teşhisi, INC</td><td>320046</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD Reaktif Kiti - Kırmızı</td><td>Gelişmiş hücre teşhisi, INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Probu - Rn-Ppib</td><td>İleri hücre teşhisi, INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Rat Htr2a</td><td>Gelişmiş hücre teşhisi, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Yatay çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus mikroskop lamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik kalem</td><td>Vektör</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

Çabuk<em&gt; in situ</emserotonin sendromu ile ratlarda paraformaldehyde-öneki beyin oligonükleotid problar kullanarak&gt; melezleme

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Metilendioksimetamfetamin (MDMA; ecstasy) toksisitesi, akut serotonin (5-hidroksitriptamin; 5-HT) sendromuna bağlı serotonerjik mRNA ekspresyonunda bölgeye özgü değişikliklere neden olabilir. Bu hipotez, serotonin 5-HT2A reseptör geni htr2a'yı tespit etmek için in situ hibridizasyon kullanılarak test edilebilir. Geçmişte, radyoaktif riboprob kullanan bu tür prosedürler, gerçekleştirilmesi birkaç gün süren karmaşık iş akışı ve tekniğin RNaz içermeyen bir ortamda tutulan taze donmuş dokuların kullanılmasını gerektirmesi nedeniyle zordu. Son zamanlarda, kısa oligonükleotid probların geliştirilmesi, in situ hibridizasyon prosedürlerini basitleştirmiş ve laboratuvarlarda daha yaygın olarak bulunan paraformaldehit preekli beyin bölümlerinin kullanımına izin vermiştir. Burada, önceden eklenmiş beyin dokuları üzerinde radyoaktif olmayan oligonükleotid probları kullanan ayrıntılı bir protokol tarif ediyoruz. Bu çalışma için kullanılan hibridizasyon probları arasında dapB (dihidrodipikolinat redüktaz için kodlayan bir bakteri geni), ppiB (peptidilprolil izomeraz B'yi kodlayan bir temizlik geni) ve htr2a (5-HT2A reseptörlerini kodlayan bir serotonin geni) bulunur. Bu yöntem nispeten basit, ucuz, tekrarlanabilir ve tamamlanması için iki günden az bir süre gerektirir.

Oligonükleotid RNA sondaları (&lt;25 nt) kullanılarak, hibridizasyon paraformaldehit önekli ve taze dondurulmuş beyinlerinden hazırlanan hipotalamik hücrelerde kırmızı noktalar halinde tespit edilebilir. Htr2a mRNA molekülleri (bir katı oklar ile gösterilmektedir), bazı hücrelerde mevcut olan, ancak diğerleri (açık oklar) görülmektedir. Biz paraformaldehıt-öneki ve taze donmuş dokular (Şekil 1) arasında hiçbir fark olmadığını gözlemledik. Başarılı bir melezleşme çıplak gözle (Şekil</str...

Bu protokol, paraformaldehit preekli beyin için ideal olan hızlı ve basitleştirilmiş bir in situ hibridizasyon yöntemini tanımlar, böylece taze donmuş dokular kullanılırken uzun süreli karmaşık adımlara olan ihtiyacı azaltır. Yöntem, sıçanlarda serotonin 5-HT2A reseptör geni htr2a'nın tanımlanması kullanılarak doğrulanmıştır.

Çabuk<em&gt; In Situ</emSerotonin Sendromu ile Ratlarda Paraformaldehyde-öneki Beyin oligonükleotid Problar kullanarak&gt; Melezleme

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Bu prosedürün genel amacı, paraformaldehit ile fikse edilmiş beyin dokusu üzerinde hızlı bir in situ iki hibridizasyon gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle beyin dokusu kesitlerinindehidrate edilmesi ve kesitlerin bir, iki ve üç numaralı ön işlem reaktifleri ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, kesitler primer oligonükleotid probları ile, ardından ikinci, üçüncü ve dördüncü problarla hibridize edilir.Ardından, hedef RNA'yı tespit etmek için fast red substratı ekleyin. Son adım, Image J yazılımı ile mRNA sinyal seviyelerini nicelleştirmektir. Nihayetinde, deney ve kontrol grupları karşılaştırılarak RNA gen ekspresyonundaki değişiklikler elde edilebilir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı; nispeten basit, ucuz, tekrarlanabilir olması ve tamamlanmasının iki günden az sürmesidir. Bu çalışma, şahsım ve Ross University School of Veterinary Medicine'den John Jay Lenan ile Florida Atlantic University College of Medicine'den Jean Soza ve RU Tao tarafından geliştirilmiştir. Bu prosedürde, hidrasyon işlemi için -80 °C dondurucuda saklanan mikroskop lam kutularından dört lam alınır.Bölümleri P-P-I-B-D-A-P-B ve HT iki A gen işaretlemeleri için ayırın ve bir tükenmez kalemle etiketleyin. Ardından, lamları oda sıcaklığındaki %100 alkol içerisinde beş dakika boyunca bekletin. Daha sonra lamları çeker ocakta beş dakika boyunca kurutun; ön işlem için her bölüme 20 µL ön işlem bir reaktifi pipetleyin ve lamları nem tepsisindeki bir raf rayına yerleştirin.Nem tepsisini düşük hızda, yatay bir çalkalayıcıda 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Ardından lamları çift distile su ile iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Lamları, 450 milliliters ön işlem iki reaktifi içeren 1000 milliliter bir behere daldırın.Ardından, RNA yapısını geri kazandırmak için lamları 100 °C'de toplam beş dakika boyunca kaynatın. Bundan sonra, lamları her seferinde iki dakika süreyle iki kez çift distile su ile yıkayın. Lamları beş dakika boyunca %100 alkol içerisinde bekletin.Ardından lamları beş dakika boyunca kurutun. Çeker ocakta, hidrofobik bir kalem kullanarak doku kesitindeki seçili alanın etrafına bir daire çizin. Daha sonra, prob penetrasyonunu artırmak için her bir seçili alana 10 µL ön işlem üç reaktifi pipetleyin ve nem tepsisini bir kapakla kapatın.Ardından, tepsiyi yatay çalkalayıcı donanımlı hibridizasyon fırınına yerleştirin. Fırın sıcaklığını 40 °C olarak ayarlayın ve tepsiyi 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Sonrasında, lamları çift distile su ile ikişer dakikadan iki kez yıkayın. Bu adımda, seçili alanlara 10 µL P-P-I-B-D-A-P-B veya HTR two A probu pipetleyin.Ardından, reaktifin buharlaşmasını önlemek için nem tepsisini bir kapakla kapatın. Lamları fırında 40 °C'de iki saat boyunca inkübe ederken, yatay çalkalayıcıda düşük hızda hafifçe çalkalayın. Sonrasında, lamları yıkama tamponu ile her seferinde iki dakika olmak üzere iki kez yıkayın ve seçilen her bir alana 10 µL amplifikasyon bir reaktifi pipetleyin.Slaytları 40 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayıp inkübe edin. Ardından slaytları yıkama tamponu ile her seferinde iki dakika olacak şekilde iki kez yıkayın, seçilen her alana 10 µL amplifikasyon iki reaktifi pipetleyin. Slaytları 40 °C'de 15 dakika boyunca çalkalayıp inkübe edin.Ardından, lamları yıkama tamponu ile iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Her seferinde, seçilen her alana 10 µL amplifikasyon üç reaktifi pipetleyin. Lamları çalkalayın ve 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından lamları yıkama tamponu ile iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Seçilen her bölgeye 10 µL amplifikasyon dört reaktifi pipetleyin. Lamları çalkalayın ve 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, lamları yıkama tamponu ile iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 µL amplifikasyon beş reaktifi pipetleyin. Çalkalayın ve lamları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Ardından, lamları yıkama tamponu ile iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Seçilen her bölgeye 10 µL amplifikasyon altı reaktifi pipetleyin. Lamları sallayın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Ardından lamları yıkama tamponu ile iki kez, her seferinde iki dakika boyunca tekrar yıkayın. Şimdi seçilen her alana 10 µL kırmızı reaktif pipetleyin, lamları oda sıcaklığındaki yatay çalkalayıcı üzerindeki nem tepsisine yerleştirin ve düşük hızda 10 dakika boyunca nazikçe çalkalayın. Sonrasında lamları çift distile su ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.Her seferinde, lamları fırında 60 °C'de 15 dakika boyunca kurutun. Ardından, lamları çeker ocak içerisinde beş dakika boyunca ksilen içinde bekletin. Sonrasında, seçilen her alana 20 µL ksilen bazlı montaj medyumu pipetleyin ve bir lamellen ile kapatın.Bu adımda, görüntü dosyasını ana görüntü J penceresine sürükleyip bırakın. Menü çubuğuna gidin ve görüntüyü seçin. Ardından açılır menüden tipi seçin ve sekiz bit seçeneğini belirleyin.Ardından, diyalog kutusunu açmak için önce adjust, sonra threshold seçeneğini belirleyin. İstenmeyen arka planın temizlenmesi için diyalog kutusundaki alt çubuk değerini ayarlayın. Menü çubuğuna gidin ve Analyze seçeneğini, ardından ikinci bir diyalog kutusunu açmak için analyze particles seçeneğini belirleyin.Parçacık boyutunu 10 olarak ayarlayın. Ardından, ana hatları göster (show outlines) seçeneğini, sonuçları görüntüle (display results) ve kutuları özetle (summarize boxes) seçeneklerini belirleyin. Son olarak, parçacık verilerini diyalog kutularında görüntülemek için tamam (okay) düğmesine tıklayın.Elektronik tablo hesaplaması için verileri Excel sayfasına girin ve salin grubundaki partikül sayısının ortalamasını temel çizgi olarak belirleyin. Ardından her bir bölümün yüzde seviyesini hesaplayın ve buna göre bir grafik oluşturun. İşte kırmızı noktalarla belirtilen hibridizasyon sinyallerinin ışık mikroskopik görünümleri.Dokular, daha önce salin ve MDMA ile tedavi edilmiş derin anestezi altındaki sıçanlarda paraformaldehit ile fikse edilmiştir. Kullanılan oligonükleotit probları D-A-P-B-P-P-I-B ve HT two A'dır. Bu şekil, daha önce MDMA ile tedavi edilen sıçanlarda hipotalamik HT two A gen ekspresyonu üzerindeki etkiyi göstermekte olup, HT two, a ekspresyonunda %20 azalma gözlemlenmiştir. Bu teknik, paraformaldehit ile fikse edilmiş beyin dokusunda in situ hibridizasyon kullanarak, nörobilim alanındaki araştırmacıların haberci RNA gen ekspresyonunu ölçmesini kolaylaştırmaktadır.

rapid-situ-hybridization-using-oligonucleotide-probes-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Bu video, serotonin sendromundan etkilenen sıçan beyin dokusunda oligonükleotid probları kullanılarak serotonin reseptörü RNA sentezinin tespitini göstermektedir. Protokol, mikroskop altında serotonin reseptörü RNA ekspresyonunu görselleştirmek ve ölçmek için doku ön işlemi, prob hibridizasyonu, enzimatik tespiti içerir.

Sıçan Beyin Bölümlerinde RNA Ekspresyonunu İncelemek için Oligonükleotid Probları Kullanılarak Yerinde Hibridizasyon

Kaynak: Jolly, S., et.al. Fare Beyin Bölümlerinde Üç Genin Ekspresyonunun Tespiti için Çift Floresan In Situ Hibridizasyonunun İmmünoetiketleme ile Birleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016). Bu video, fare beyni bölümlerindeki iki RNA hedefinin ekspresyonunu görselleştirmek için çift floresan in situ hibridizasyonun kullanımını göstermektedir. Protokol, floresein, izotiyosiyanat ve digoksijenenin ile etiketlenmiş problar kullanılarak RNA'nın sıralı tespitini ve ardından duyarlılığı artırmak için...

 Fare Beyin Bölümlerinde Gen Ekspresyonunu Tespit Etmek için Çift Floresan In Situ Hibridizasyon Yapılması

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Sıçan beyninin tek taraflı hemisferine, biauriküler çizginin tepe noktasına 1 cm yanal 25 mm'lik şekil-8 bobini yerleştirerek ve bobini 45° açıyla açılandırarak tekrarlayan transkraniyal manyetik stimülasyon (rTMS) uyguladık. rTMS için 20 dakikadan fazla bir süre boyunca şirket içi bir su soğutma sistemi kullanıldı.

Sıçan Beyin Tek Taraflı Yarımküre için Transkraniyal Manyetik Uyarım

Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

DetectSyn, tedaviler veya hastalık durumları arasında göreceli sinaps (sinaptik öncesi ve sonrası) sayısındaki değişiklikleri ölçen tarafsız, hızlı bir floresan testidir. Bu teknik, hem kültürlü nöronlarda hem de sabit dokuda kullanılabilen bir yakınlık ligasyonu tekniği kullanır.

DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

Murin koroid pleksusunda insülin reseptör izoformları IR-A ve IR-B'yi haritalamak için bir Dubleks in situ hibridizasyon testi oluşturduk ve geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geldik. Bu yüksek çözünürlüklü yaklaşım, beyin insülin sinyalizasyonu ve nörolojik bozukluklar için potansiyel izoform hedefli tedaviler hakkında yeni bilgiler sunan izoforma özgü ifadeyi ortaya çıkarır.

Murin Beyninde İnsülin Reseptörleri A ve B'nin RNA In Situ Hibridizasyon Testi ile Hassas Görselleştirilmesi

Öğrenin, fare beyin dokusunda htr2a geni tespiti için hızlı in situ hibridizasyon yöntemini. Bu basitleştirilmiş protokol, geleneksel yöntemlere göre işlem süresini önemli ölçüde kısaltarak güvenilir mRNA sinyalleri sağlar.

Çabuk

Daha fazla video keşfet