Name: Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama 2+ Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Öğrenin, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde transmembran potansiyel ve sarkoplazmik retikulum kalsiyumunu aynı anda optik haritalama yöntemini. Bu teknik, kardiyak elektrofizyoloji araştırmalarında SR Ca²⁺ dinamiklerini doğrudan incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 HL 111600) ve Amerikan Kalp Derneği (12SDG9010015) tarafından desteklenmiştir.

Hayvanları da içeren tüm prosedürler California, Davis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu yapıştırılır bulundu. 1. Hazırlık <ol><li> 4 ° C&#39;de önceden ve mağaza modifiye Tyrode çözeltisi iki konsantre edildi (25X) stokları hazırlayın: (1) Stok I (mM olarak: NaCl 3205, CaCl2 32.5, KCI 117.5, NaH 2 PO 4 29,75, MgCI2 26,25) ve (2) (mM olarak: 500 NaHCO 3) Stok II. <ol><li> (DI) NaCl 128.2, CaCl2 1.3, KCI 4.7, MgCl2 1.05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO 3 20 ve deiyonize 1840 ml birleştirerek glikoz 11.1: Taze (mM olarak) aşağıdaki bileşime sahip 2 L&#39;lik Tyrode solüsyonu hazırlamak Su, 80 mi Hazır I Stok II 80 mi, ve glukoz, 4 g. Doğrudan Stok I ve II Stok karışmaz; eklemek1840 ml DI m çökmesini önlemek için. </li></ol></li><li> Önceden 10 mg susuz di-metilsülfoksit (DMSO) / ml uyanlma-kasılma uncoupler blebbistatin stok çözeltisi hazırlamak ve 4 ° C &#39;de stok solüsyonu saklayın. </li><li> Floresan boyalar stok çözelti hazırlayın: (1) voltaj duyarlı boya RH237 (DMSO içinde 1 mg / ml) ve (2) Düşük afiniteli kalsiyum göstergesi Fluo-5N AM, üreticinin tavsiyelerine göre (DMSO içinde 2 mg / ml). Yükleme kapasitesi kaybı sonucu ile, bozulmayı önlemek için, hemen hazırlıkları kullanın. </li><li> Prime oksijenli sahip çevrimli Langendorff perfüzyonu sistemi (% 95 O2,% 5 CO2), Tyrode çözeltisi. 7.4 ± 0.05 Tyrode çözümü pH tutmak için O 2 / CO 2 akışını ayarlayın. Sürekli perfüzyon filtre: bir in-line naylon dokuma ağ filtre (11 um gözenek boyutu) kullanın. <ol><li> Sonraki loadi olarak oda sıcaklığında Başbakan perfüzyon sistemi,Fluo-5N AM ng oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Fluo-5N AM yükleme için, çevrimli perfüzat küçük bir hacim (~ 150 ml) kullanın. Boya yüklemesinin ardından, perfüzat daha büyük bir hacim kullanımı (1-2 L, Şekil 1C bakınız). </li></ol></li><li> Veri toplama sistemi açın ve EKG ve perfüzyon basıncının sürekli izlenmesi için hazırlar. Basınç izleme sistemi hazırlayın: perfüzyon hattına bir basınç transdüktörü bağlayın ve bir transbridge amplifikatörü ile perfüzyon basıncını izlemek. Kalp perfüzyon sistemine bağlı değilken 0 mmHg bazal perfüzyon basıncını ayarlayın. </li><li> V m ve SR Ca 2 + sinyalleri arasındaki uzaysal uyum sağlamak için optik haritalama kameraları aynı hizaya getirin. <ol><li> İlk olarak, bir cetvel ya da perfüzyon çanak içine metin ile bir nesne yerleştirerek kameralar odaklanır. Canlı görünüm moduna haritalama kameraları açın ve metin canlı ve net olana kadar odağı ayarlamak. Her bir kamera tek bir kare görüntü elde edin. </li><li> YerleşimiHer iki resim görünür, böylece bu görüntülerin ve üst resmin saydamlığını ayarlamak. Görüntülerdeki metin tam üst üste gelmelidir. Mükemmel hizalanmış değilse iki görüntü aynı hizada kadar, dikroik ayna veya her kameranın konumunun açısını ayarlayın. </li></ol></li></ol> Tavşan Kalbin 2. Hasat, Perfüzyon ve Boya yükleme <ol><li> Onaylanmış bir tavşan süzgeç tavşan sabitleyin. Derin sodyum pentobarbital (50 mg / kg) ve heparin (1000 IU) bir intravenöz enjeksiyon (marjinal kulak daman) ile anestetize. <ol><li> Tavşan görüntüler nosiseptif reflekslerin eksikliği olduğunda, bir orta hat cilt kesi sternum ve kaburga maruz olun. Manubrium için xiphoid gelen künt uçlu cerrahi makas ile sternum ile kesin. Sternumu açarken kalbi zarar vermemeye özen gösterin. Kalp maruz kaburga yayıldı. </li><li> Hızla hızla tüm damarları ve bağ dokusu kesim tarafından tüm kalp-akciğer bloğu tüketim. Immediately buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi içine kalp-akciğer bloğu yerleştirin. </li></ol></li><li> Retrograd perfüzyon için aorta bulun. Aortik arkın üç şubelerine sadece proksimal asendan aort kesin. Perfüzyon sistemine bağlı bir 8 G kanül aort kanüle. Kanül üzerine aorta güvenli USP 0 ipek sütür bir parça kullanın. </li><li> Dikkatle kalp trakea, akciğerler ve epikardiyal yağ teşrih. Keskin forseps ve diseksiyon makas ile, mitral kapak bulun ve dikkatle zarar veya sol ventrikül çözüm sıkışıklığını önlemek için tek broşür kaldırın. </li><li> Görüntüleme için yukarı bakacak şekilde kalbin ön yüzeyi ile yatay cam ceketli perfüzyon odasında kalbi Batmak. Haritalama (Şekil 1D) sırasında kalbin hareket etmesini önlemek için çanağın silikon alt üzerine U-şekilli pimlerle Sylgard parçasına kanül elde edin. İsterseniz, sta için kalbin tepesinde küçük bir böcek pin eklemekbilization. </li><li> Pozisyon elektrokardiyogram (EKG) kalbin sağ ve sol tarafında banyosunda elektrotlar. Tamamen banyosunda elektrotlar daldırın ve onlar Kurşun Ben yapılandırmasına bir hacim yapılan EKG benzer sağlamak için kalp yüzeyi ile temas halinde olmadığından emin olun. Normal Kurşun I EKG morfoloji doğrulayın. 70 mmHg - aort basıncı 60 muhafaza edilmesinin sağlanması için - (35 ml / dakika 25) akışını ayarlayın. </li><li> Oda ışıkları kapatın ve 0.3 eklemek - Perfüzat (- 20 uM son konsantrasyon 10) ile blebbistatin stok solüsyonu (adım 1.2) 0.6 ml. <ol><li> Blebbistatin bir photoinactivation önlemek için oda ışıkları kapatın. Gerekirse küçük bir spot ışığı veya far görevi aydınlatma sağlamak için kullanılabilir. Not: Blebbistatin bir miyozin ATPaz inhibitörü ve bir eksitasyon-kasılma uncoupler olduğunu. , Kardiyak enerji üretimi bozulabilir - Flu-5N yükleme genişletilmiş (60 dk) RT (hipotermi) koşulları gerektirdiğinden (2.10 adımları 2.8 bakınız). Therefore, Perfüzat önce içine blebbistatin eklenmesi enerji talebini azaltmak 16 ve sonraki optik kayıtları 17 sırasında hareket eserler ortadan kaldırabilir yükleme boya. </li></ol></li><li> Kalbin kasılması bittikten sonra (10 - aort basınç kayıt doğrulandı 15 dk), küçük hacimli çevrimli perfüzyon sistemi (adım 1.4.1 bakınız) geçmek. </li><li> Hazırlayın ve Fluo-5N AM yükleme çözüm yük: 0.25 ml ılık% 20 Pluronic F127 için Fluo-5N AM stok solüsyonu (adım 1.3) 0.25 ml ekleyin. , 0,5 ml karışımına sıcak Tyrode çözeltisi ekleyin, iyice karıştırılmakta ve küçük hacimli çevrimli perfüzyon sistemine ekleyin. </li><li> Sürekli perfüzyon basıncı ve EKG izlenmesi ve gerekirse akışını ayarlamak. Boya yükleme RT&#39;de yaklaşık 1 saat sürer. Yüklemeden sonra 45 dk 37 ° C perfüzyon sistemi ve perfüzyon ısınma başlamak için dolaşan su banyosu açın başladı. </li><li> Fluo-5N AM yükleme, swi 60 dakika sonraDaha büyük hacimli sirkülasyon perfüzyon sistemine perfüzyon Tch (adım 1.4). </li><li> Sıcak Tyrode çözeltisi 1 ml voltajı duyarlı boya RH237 stok çözeltisinin (adım 1.3) 50 ul seyreltilir ve kanül, bir enjeksiyon noktası proksimal içerisine (5 ~ dakika boyunca) yavaş yavaş ekleyin. </li></ol> 3. Optik Haritalama <ol><li> Boya yükleme son anlarında kalbi konumlandırmak ve deney için görüş uygun alanı sağlamak için optik haritalama kameraları odaklanır. </li><li> Eğer arzu edilirse, kalp atışı düzenleme epikardiyal yüzeyi üzerine yerleştirilen iki kutuplu bir elektrot ilerleme hızı yerleştirin. </li><li> Bağlı perfüzat devridaim mevcut olabilir, sıvı yüzeyi üzerinde hareket paraziti azaltmak perfüzyon odasına yüzeyi üzerinde bir plastik ya da cam kapak kayma yerleştirin. Not: Bir kapak kayma bir alternatif, temiz bir plastik 50 mm Petri kabı kapağı kullanmak gibi. </li><li> Üniform e kalbin yüzeyine aydınlatmak için ışık kılavuzları Odakxcitation ışığı. 495 nm bant geçiren filtre (Şekil 1A) - Mavi ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın ve daha bir 475 ile ışık filtresi. </li><li> Bir macroscope ve iki tamamlayıcı metal oksit-yarıiletken (CMOS) optik haritalama kameralar ile yayılan floresan toplayın. 545 nm&#39;de dikroik ayna ile yayılan ışığı bölün. <ol><li> Uzun pas 700 nm&#39;de, V m sinyalini içeren, uzun dalga boyu parçasını filtre. 534 nm (Şekil 1A) - Bant geçiren 502 den, SR Ca 2 + sinyalini içeren, kısa dalga boylu parçasını filtre. 1 kHz - 0.5 optik veri toplama sıklığını ayarlayın. </li></ol></li><li> Her optik kayıt için, ilk olarak, istenen düzenlemeyi başlatmak ikaz ışığı açmak ve 1 toplamak - veri 4 sn. İstenirse, ilerleme hızı protokolleri ve veri toplama senkronize. Not: mümkün değildir Fluo-5N AM, bu nedenle sinyal-gürültü oranını (SNR) re-load düflüfl olacakse SR sızıntıyı boya nedeniyle deney boyunca. Yüksek SNR değerleri sağlamak için 2 saat - 1 deneysel protokol sınırlayın. </li><li> Deney sonra, Dİ su ile tekrar DI su,% 70 reaktif alkol sırayla perfüzyon sistemi yıkama ve. </li><li> Üreticinin protokolüne göre ticari yazılım paketleri kullanılarak mekansal Gauss filtre (yarıçap 3 piksel) her veri kümesi Filtre. </li><li> Gerekirse, mekansal V m ve SR Ca 2 + veri setleri aynı hizaya getirin. Adım 1.6 olduğu gibi, her kamera görüntüleri kaplaması ve doğrulayın görünümü (yani, kanül, kalp pili elektrodu) alanında kalbin anatomik yapıları (yani., Koroner damar, kulakçıklar kenarlarına veya ventriküller) ya da diğer öğeleri tam olarak örtüşmektedir. Değilse, veri setlerinin mekânsal uyum gereklidir. </li><li> Piksel sayısı not ederek, tam örtüşme kadar x ve y-yönünde elde edilir üst saydam bir görüntü ShiftResim, her yönünde kaydırılabilir olmalıdır. Üst görüntüde (V m veya SR Ca 2+ ya) karşılık gelen tüm veri kümesi sonra V m ve SR Ca 2 + veri setleri arasındaki hassas hizalama sağlamak için her yönde piksel belirlenen sayısına göre kaydırılır gerekmektedir. </li></ol>

<ol><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22tissues.+Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li>
<li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai%282%2B%29+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBers%2C+DM+%22Excitation-Contraction+Coupling+and+Cardiac+Contractile+Force%22">Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force</a>. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).</li>
<li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li>
<li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li>
<li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+scraps%3A+local+depletions+of+free+%5BCa2%2B%5D+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2%2B+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li>
<li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+Ca%282%2B%29+content+regulates+intracellular+Ca%282%2B%29+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts%3A+effect+of+exogenous+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li>
<li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li>
<li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+determines+Ca2%2B+alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+in+the+intact+heart%3A+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li>
<li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+Changes+During+Hypoxia%2C+Ischemia%2C+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+rhythm+%3A+the+official+journal+of+the+Heart+Rhythm+Society%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li>
<li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li>
<li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure%3A+mechanisms+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li>
<li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Başarılı Fluo-5N boya yükleme anahtarları boyanın büyük miktarda yükleme süresi (1 saat) uzunluğu gerek kalmadan yüksek Fluo-5N konsantrasyonu sağlar küçük hacimli çevrimli perfüzyon kurulum vardır ve yükleme gerçekleştirme oda sıcaklığında karıştırıldı. Yükleme hızla fizyolojik sıcaklıklarda, hücresel enzimatik aktivite böler boya sitozolde boya moleküllerini yakalama ve onları SR zarı geçmeye izin vermiyor, hücre zarı haçlar -AM etiketi gerçekleştirilir edin. Oda sıcaklığında, bununla birlikte, enzim aktivitesi yavaşl...

Sağlam Langendorff perfüze kalpte hücre içi Ca2+ ve transmembran potansiyelinin (Vm) ikili optik haritalanması, aritmi mekanizmaları ve uyarma-kasılma eşleşmesi1-4 dahil olmak üzere kardiyak elektrofizyolojideki araştırmaların temel dayanağı haline gelmiştir. Bu yaklaşım, normal ve anormal elektrofizyolojiye ve daha da önemlisi, Vm ile hücre içi Ca2+ arasındaki çift yönlü ilişkiye eşi görülmemiş bir bilgi sağlamıştır. Bununla birlikte, yüksek afiniteli floresan indikatörlerle (Rhod-2 ve Fluo-4 gibi) hücre içi Ca2 + 'nın optik haritalanması, yalnızca hücre içi Ca2 + 'daki toplu değişiklikleri rapor eder ve bu değişikliklerin transmembran Ca2 + akısı, hücre içi depolara salınması ve yeniden alınması veya çoğu durumda, her ikisinin bir kombinasyonundan mı kaynaklandığını ayırt edemez. Ayrıca, yüksek afiniteli Ca2+ göstergeleri yavaş açma-kapama kinetiğine sahiptir ve Ca2+ konsantrasyonu5'teki hızlı değişiklikleri doğru bir şekilde rapor etmeyebilir.
Her aksiyon potansiyeli, hücre içi Ca2+ geçici (CaT) olarak bilinen hücre içi Ca2+ 'da bir artışı tetikler. Memeli kalbinde, toplam CaT'nin yaklaşık% 70 - 90'ı, ryanodin reseptörlerinin (RyR'ler) açılması yoluyla sarkoplazmik retikulumdan (SR) Ca2 + salınmasına bağlıdır6. SR içinde, toplam Ca2 + 'nın yaklaşık yarısı, SR Ca2 + homeostazında önemli bir rol oynayan kalsekestrin (CSQ) ve diğer SR içi tamponlara7 bağlıdır8,9. Serbest SR Ca2+ miktarı, SR Ca2+ salınımının yanı sıra RyR'nin kapılanması için itici gücü belirler ve bu nedenle hücre içi CaT üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Ayrıca, SR Ca2+ salınımı veya geri alımındaki değişiklikler, sırayla, elektrojenik Na+-Ca2+ değişimi yoluyla Vm'yi etkileyebilir ve bu da aritmojenik sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, CaT'ye ek olarak, serbest SR Ca2 + 'nın izlenmesi, kasılma ve elektrofizyolojik disfonksiyon hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
Son birkaç yılda, araştırmacılar izole kardiyak miyositlerde ve sağlam kalpte tek bir yerden SR Ca2+'nın izlenmesinde önemli ilerlemeler kaydettiler. Böyle bir yöntem, RyR'leri açmak için hızlı kafein darbeleri gerektirir ve SR Ca2 + içeriği daha sonra hücre içi Ca2 + 10'daki ani artıştan çıkarılır veya hesaplanır. Bir başka ilgi çekici yaklaşım, serbest SRCa 2+'ya bağlanan Fluo-5N11 veya Mag-Fluo412 gibi düşük afiniteli Ca2+ göstergelerini kullanır. Bu göstergeler 10 – 400 μM aralığında ayrışma sabitlerine (Kd) sahiptir ve bu nedenle Ca2+ konsantrasyonunun ([Ca2 +] SR) milimolar aralıkta olduğu SR lümenine kıyasla sitozolde minimum floresan sergiler. Düşük afiniteli Ca2+ göstergeleri kullanılarak, fraksiyonel SR Ca2+ salınımı ve Ca2+ alternans13,14 mekanizmaları dahil olmak üzere izole miyosit düzeyinde SR Ca2+ döngüsünün çeşitli yönleri araştırılmıştır. Bununla birlikte, sağlam kalpte SR Ca2+ döngüsünün heterojen doğasını ve SR Ca2+'nın mekansal olarak farklı aritmik olaylardaki rolünü tam olarak anlamak için, sağlam kalbin epikardiyal yüzeyi boyunca SR Ca2+ görüntüleme yöntemleri gereklidir15.
Bu makale, düşük afiniteli Ca2+ indikatörü Fluo-5N ile bozulmamış Langendorff perfüze tavşan kalbinde serbest SR Ca2+ ve Vm'nin ikili optik haritalaması için metodolojiyi açıklamaktadır. Kalbin epikardiyal yüzeyi boyunca mekansal olarak SR Ca2+ özelliklerini ortaya çıkarmanın yanı sıra, bu yaklaşım, V m ve SR Ca2+ arasındaki çift yönlü ilişkinin araştırılmasına izin vererek, Vm'nin eşzamanlı olarak izlenmesi avantajına sahiptir.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Tyrode çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Tyrode çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>Tyrode çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Tyrode çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Tyrode çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Tyrode çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Tyrode çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>%95 O2 %5 CO2</td><td>AirGas</td><td>karbojen</td><td>Tyrode çözeltisinin oksijenasyonu ve pH'ı için</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Uyarma-kasılma birleştirici</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Gerilime duyarlı boya</td></tr><tr><td>Fluo-5N</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>Düşük afiniteli Ca2+ göstergesi; Alternatif: Invitrogen F-14204; Yükleme oda sıcaklığında yapılmalıdır</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>Ca2+ göstergesi yüklemesi için; Kullanmadan önce çözelti berraklaşana kadar ısıtın</td></tr>: <tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Blebbistatin ve boyaları çözmek için</td></tr><tr><td>Filtre</td>: <td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 & # 956; m hat içi filtre</td></tr><tr><td>Basınç Dönüştürücü</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>Perfüzyon basıncını ölçmek için</td></tr><tr><td>Transbridge Dönüştürücü Amplifikatör</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>Basınç sinyalini dönüştürmek/yükseltmek için; PowerLab ayrıca uygun BioAmp ile de kullanılabilir</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>Cihazları:</td><td></td><td>Basınç ve EKG sinyallerinin sürekli kaydı için</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Makroskopik optik kurulum. Ayrıntılar: 0,63X objektif (NA = 0,31), 2X yoğuşmalı objektif, bileşke görüş alanı = 3,1 cm x 3,1 cm, odak derinliği = ~ 1,5 mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Optik haritalama kameraları</td></tr><tr><td>Hassas LED Spot Işık</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>LED ışık kaynağı</td></tr></tbody></table>

intra-sarkoplazmik retikulum ca optik haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; ve langendorff-perfüze tavşan heart transmembran potansiyeli

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarkoplazmik retikulum (SR) Ca2+ elleçlemesi normal uyarma-kasılma eşleşmesinde anahtar bir rol oynar ve anormal SR Ca2+ elleçlemesinin belirli aritmi tiplerinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Aritmiler mekansal olarak farklı, ortaya çıkan fenomenler olduğundan, doku düzeyinde araştırılmalıdır. Bununla birlikte, sağlam kalpte SR Ca2 + 'yı doğrudan problama yöntemleri sınırlı kalmaktadır. Bu makale, Langendorff perfüze tavşan kalbindeki transmembran potansiyelinin (Vm) ve serbest intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) ikili optik haritalaması için protokolü açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre içi [Ca 2 +] ([Ca2 +] i) nispeten düşük olduğu sitozolde minimum floresan bulunan ancak SR lümeninde önemli floresan sergileyen düşük afiniteli Ca 2 + indikatörü Fluo-5N'den yararlanır. Kalbin epikardiyal yüzeyi boyunca mekansal olarak SR Ca2 + özelliklerini ortaya çıkarmanın yanı sıra, bu yaklaşım, Vm ve SR Ca2 + arasındaki çift yönlü ilişkinin araştırılmasına izin veren Vm'nin eşzamanlı izlenmesi gibi belirgin bir avantaja sahiptir ve SR Ca2 + 'nın aritmojenik olaylardaki rolü.

Şekil 1A, çift V m ve SR Ca2 + eşleme için optik konfigürasyonunda şematik bir diyagramını göstermektedir. Bu ayar ile, V m ve SR Ca 2 + sinyalleri (Şekil 1B) tam spektral ayrılık yoktur. Fluo-5N boya yüklemesinin için kullanılan çift döngü perfüzyon sistemin bir şeması Şekil 1C &#39;de gösterilmiştir. Şekil 1 D perfüzyon çanak kalp yatay yönünü gösterir. Örnek V m ve kalp epikardiyal yüzeyi üzerind...

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Bu prosedürün genel amacı, izole edilmiş, LOR ile perfüze edilmiş sağlam tavşan kalbinde serbest intra sarkoplazmik retikulum kalsiyumu ve transmembran potansiyelini eş zamanlı olarak optik yöntemle haritalandırmaktır. Bu işlem, öncelikle tavşan kalbinin çıkarılması ve retrograd lanor perfüzyon için aortanın kanüle edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, perfüzatın içerisine bir eksitasyon-kontraksiyon ayrıştırıcı ekleyerek kasılmayı ortadan kaldırmaktır.Ardından, perfüzyon küçük hacimli bir yeniden dolaşım döngüsüne aktarılır ve oda sıcaklığında düşük afiniteli bir kalsiyum indikatörü eklenir. Son adımlar, büyük hacimli perfüzyon döngüsü kullanılarak kalbin 37 °C'ye ısıtılması ve voltaj duyarlı boyanın eklenmesidir. Böylece deney sırasında, kalbin mavi ışıkla uyarılması ve yayılan ışığın yüksek hızlı CMOS kameralarla ölçülmesi yoluyla kalsiyum ve transmembran potansiyeldeki değişimler ölçülür.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, araştırmacıların transmembran kalsiyum sinyallerinin girişimi olmaksızın, sarkoplazmik retikulumu veya SR'yi kısa süreli kalsiyum dinamikleri için doğrudan incelemesine olanak tanımasıdır. Transmembran potansiyeli ile SR kalsiyumu eş z

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, potansiyometrik boya kullanarak (di-8-ANEPPS) Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde optik görüntü aksiyon potansiyeli hareketi yüksek bir zamansal ve mekansal çözünürlükte tekniği açıklar.

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Bu rapor, streç bağlı atriyal fibrilasyon sırasında Langendorff perfüze koyun kalp bozulmamış sol atrium elektriksel uyarım eşzamanlı endokardiyal ve epikardiyal optik haritalama metodolojisi ve sonuçları ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.

Stretch Bağlı Atriyal Fibrilasyon Koyun Modelinde Yüksek Çözünürlüklü Endokardial ve Epikardiyal Optik Haritalama

Bu makale, panoramik görüntüleme sistemi kullanılarak Langendorff perfüze tavşan kalbinde, optik haritalama deneylerini için temel prosedürleri ve ikili (voltaj ve kalsiyum) görüntüleme yöntemidir.

Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Burada, bir yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte, farenin sağ atrium ve özellikle Çin-atriyal düğümden elektriksel aktivitenin optik haritalama için bir protokol mevcut.

Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Bu çalışmanın amacı, kardiyak dinamiği n çevirisel bir hayvan modeli kullanarak araştırmak için bir yöntem oluşturmaktır. Açıklanan deneysel yaklaşım, izole, bozulmamış bir domuz kalp modelindeki elektriksel aktiviteyi değerlendirmek için elektrofizyolojik bir çalışma ile birlikte çift emisyonlu optokardiografi içerir.

Ex Vivo Langendorff perfüzyonlu Kalplerin Optokardiyografi ve Elektrofizyoloji Çalışmaları

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

Öğrenin, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde transmembran potansiyel ve sarkoplazmik retikulum kalsiyumunu aynı anda optik haritalama yöntemini. Bu teknik, kardiyak elektrofizyoloji araştırmalarında SR Ca²⁺ dinamiklerini doğrudan incelemeyi sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama

Daha fazla video keşfet