Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama 2+ Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli
10 Eylül 2015
Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, sağlam izole LOR perfüze tavşan kalbinde serbest intra sarkoplazmik retikulum, kalsiyum ve transmembran potansiyelini aynı anda optik olarak haritalamaktır. Bu, önce tavşan kalbinin eksize edilmesi ve aortun retrograd lanor perfüzyonu için kanüle edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, perfu sekize bir uyarma kasılma ayrıştırıcısı ekleyerek kasılmayı ortadan kaldırmaktır.
Daha sonra, perfüzyon küçük hacimli bir devridaim döngüsüne geçirilir ve oda sıcaklığında düşük afiniteli bir kalsiyum indikatörü eklenir. Son adımlar, büyük hacimli bolluk döngüsünü kullanarak kalbi 37 santigrat dereceye kadar ısıtmak ve voltaja duyarlı boyayı eklemektir. Bu nedenle, deney sırasında, kalbin mavi ışıkla uyarılması ve yayılan ışığın yüksek hızlı CM OS kameralarla ölçülmesiyle kalsiyum ve transmembran potansiyelindeki değişiklikler ölçülmektedir.
Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, araştırmacıların transmembran kalsiyum sinyallerinden etkilenmeden kısa kalsiyum dinamikleri için doğrudan sarkoplazmik retikulum veya SR'yi araştırmasına izin vermesidir. Bu yöntem aynı zamanda SR kalsiyum işlemesinin aritmilere katkıda bulunmadaki rolü ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına da yardımcı olabilir, çünkü transmembran potansiyeli SR kalsiyum ile aynı anda kaydedilir, Genellikle bu yönteme yeni olan kişiler, optik SR kalsiyum sinyalleri çok düşük genlikli olduğu için mücadele edecektir. Bu nedenle, kalsiyum indikatörünün uygun şekilde yüklenmesi çok önemlidir Bu protokol için elinizde taze yapılmış tyro solüsyonunun bulunması gerekir.
Dört litre yeterli olacaktır. Konsantre et suyu çözeltilerini seyreltmeden karıştırmayın. Ayrıca, metin protokolünde belirtildiği gibi diğer çözeltileri önceden hazırlayın, %95 oksijen ve %5 karbondioksit içeren tiroz beslemesini kabartın ve çözeltinin pH'ını 7.4'e çok yakın ayarlamak için gaz akışını ayarlayın.
Çözelti oda sıcaklığında olmalıdır. Parfüm satını filtrelemek için 11 mikron gözenekli bir hat içi naylon filtre yerleştirerek devridaim L andorf perfüzyon sistemini hazırlayın. Şimdi ana bolluk sistemini yaklaşık iki litre oksijenli tyros ile doldurun.
İki litrelik toplam hacim, rezervuardaki çözeltiyi içerir. Daha sonra, grip oh beş N için küçük hacimli bir devridaim profüzyon döngüsü oluşturmak için çözelti rezervuarını atlayan kısa bir füzyon hattı hazırlayın ve astarlayın. Daha küçük devridaim sistemindeki toplam hacmin indirilmesi yaklaşık 150 mililitre olmalıdır.
Basınç izleme sistemini hazırlamak için, füzyon hattına bir basınç dönüştürücü bağlayın ve dönüştürücünün çıkışını bir trans köprü amplifikatörüne bağlayın. Şimdi veri toplama sistemini açın. EKG'yi ve füzyon basıncını sürekli olarak izleyecek şekilde ayarlayın.
Ardından, temel perfüzyon basıncını sıfır milimetre cıva olarak ayarlayın. Son olarak, optik eşleme kamerasını metin protokolünde açıklandığı gibi hizalayın. Başlamak için tavşanı sabitleyin ve 1000 ünite heparin bolusu ile birlikte pentobarbital ile uyuşturun.
Tavşanı sakinleştirmek için gözlerini kapat. Künt uçlu makas kullanarak sternumu ve kaburgaları ortaya çıkarmak için orta hat kesisi ile başlayın. Ksifoid ve meibum arasındaki sternumu kesin.
Daha sonra, kalbe zarar vermeden sternumu dikkatlice açın ve kalbi ortaya çıkarmak için kaburgaları açın. Ardından, çevredeki tüm damarları ve dokuları keserek tüm kalp akciğer bloğunu hızla çıkarın. Kalp akciğer bloğunu yaklaşık 100 mililitre buz gibi soğuk tyro çözeltisine aktarın.
Eksize edilen doku bloğunda, aortu bulun ve çıkan aortu aort arkının üç dalının hemen proksimalinde kesin. Daha sonra aortu profüzyon sistemine bağlı sekiz gauge kanül ile kanül edin. Aortu bir parça USP sıfır ipek sütür ile kanüle sabitleyin.
Kanülü sabitledikten sonra, trakeayı, akciğerleri ve epikardiyal yağı dikkatlice inceleyin. Ardından, mitral kapağı tanımlayın ve bir broşüre zarar vermek veya çıkarmak için dikkatlice keskin forseps ve makas kullanın. Böylece sol ventrikülde çözelti tıkanıklığı oluşamaz.
Kalbi ön tarafı yukarı bakacak şekilde yatay olarak perfüzyon odasına daldırarak devam edin. Kanülü bir parça sardın üzerine yerleştirin. Kanülü, sard parçasından ve perfüzyon kabının silikon tabanına yerleştirilen U şeklindeki pimlerle sabitleyin.
Bu, kalbin hareket etmesini önleyecektir. Görüntüleme sırasında, gerekirse apeksi stabilize etmek, kanülasyon sırasında kullanılan tyro solüsyonunun miktarını ölçmek ve toplam dolaşımdaki solüsyonu iki litrede tutmak için taze solüsyonla değiştirmek için küçük bir böcek pimi kullanılabilir. Şimdi EKG elektrotlarını kalbin her iki tarafındaki banyoya tamamen daldırın, ancak kalple temas halinde değil.
Ardından bunun normal bir kurşun bir EKG morfolojisi yaptığını doğrulayın. Bu arada, perfüs akışını dakikada 25 ila 35 mililitre arasında ayarlayarak aort basıncını 60 ila 70 milimetre cıvada tutun. Şimdi, oda ışıklarını kapatın ve 10 ila 20 mikromolar nihai konsantrasyon için PERFU sekize 0,3 ila 0,6 mililitre BLE statin stok çözeltisi ekleyin.
10 ila 15 dakika sonra kalp kasılmaları durmalıdır. Ardından küçük hacimli füzyon sistemine geçin. Başarılı SR kalsiyum görüntülemenin anahtarlarından biri, beş N boyanın uygun şekilde yüklenmesidir.
Bu, yüksek boya konsantrasyonu ve oda sıcaklığı koşulları elde etmek için küçük hacimli bir perfüzyon gerektirir. Sitozoldeki D'nin D esterleşmesini önlemek için, Şimdi 500 mikrolitre grip O beş N yükleme çözeltisi hazırlayın ve 500 mikrolitre yol çözeltisi ile karıştırın. Ardından PERFU sekizlisine ekleyin.
İndirme işleminin 45 dakika devam etmesine izin verin ve ardından sistemi 37 santigrat dereceye kadar ısıtmak için sirkülasyon su banyosunu açın. Bir saatlik indirmeden sonra, Perfu sekiz'in daha büyük hacmine geri dönün. Daha sonra, 50 mikrolitre voltaja duyarlı boya RH 2 37'yi bir mililitre ılık lastiğe karıştırın.
Bunu yaklaşık beş dakika boyunca yavaşça sisteme enjekte edin ve kalbin optik haritalamasına devam edin. Başlamak için, PERFU eight yüzeyindeki hareketi azaltmak için optik haritalama kameralarını uygun alana odaklayın. Çözelti üzerinde bir kapak fişi yüzdürün.
Şimdi kalbe eşit aydınlatma sağlamak için LED ışık huzmesini ayarlayın. Her optik kayıt için istenen ilerleme hızı protokolünü ayarlayın. Uyarma ışığını açın ve bir ila iki saat içinde bir ila dört saniyelik veri toplayın.
Sızan boyadan gelen gürültü deneye son verecektir. Ardından sistemi deiyonize su ile yıkayın. Daha sonra% 70 etanol ve başka bir deiyonize su durulama ile bitirin.
Açıklanan protokol kullanılarak, transmembran potansiyel sinyalinin ve sarkoplazmik retikulum veya SR kalsiyum sinyalinin spektral ayrımı ayrılabilir. Sürekli pacing sırasında optik izler de kaydedildi. Aktivasyon haritaları daha sonra her pikselin aktivasyon süresi çizilerek verilerden oluşturuldu.
İzkronal bir grafikte, iki sinyal arasında sekiz ila 10 milisaniyelik tipik bir gecikme vardır. Diyastolik SR'deki rölatif değişimi ölçmek mümkün oldu. Kalsiyum yükü ve sistolik SR kalsiyum, çeşitli pacing döngülerinde genlikleri serbest bırakır. Beta adrenerjik reseptör agonisti izoproterenolün uygulanmasını takiben patolojik SR kalsiyum kullanımı gözlendi.
Kırmızı oklar, sr'den net bir kalsiyum sızıntısına işaret ediyor. Bu koşullar altında, aksiyon potansiyellerinin kalsiyum aracılı tetiklenmesi meydana gelebilir. Bu videoyu izledikten sonra, sağlam Lang Endorf Perfüze tavşan kalbinde transmembran potansiyelinin ve SR kalsiyum sinyallerinin aynı anda optik haritalamasının nasıl yapılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Langendorff perfüzyona sahip tavşan kalbinde transmembran potansiyelin ve sarkoplazmik retikulum içindeki serbest kalsiyumun çift optik haritalama protokolünü açıklamaktadır. Bu yöntem, sağlam kalpte bu dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesini ve nicel değerlendirmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Kardiyovasküler Fizyoloji
- Optik Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Kardiyak dinamikleri anlamak, kalp fonksiyonlarının çalışılması için kritik öneme sahiptir.
- Transmembran potansiyel ve kalsiyum seviyeleri, kalp sağlığının önemli göstergeleridir.
- Optik haritalama, bu parametreleri incelemek için invaziv olmayan bir yöntem sağlar.
- Langendorff perfüzyon tekniği, yalıtılmış kalp çalışmalarına olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- V m ve SR Ca 2+'nın eşzamanlı optik haritalama metodunu geliştirmek.
- Kardiyak elektrofizyoloji hakkındaki anlayışı artırmak.
- Alandaki araştırmacılar için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tavşan kalbinin çıkarılması ve retrograd perfüzyona izin vermek için aortun kanüle edilmesi.
- Kontraksiyonları ortadan kaldırmak için bir eksitasyon-konstraksiyon ayırıcı kullanılması.
- Düşük afiniteli kalsiyum göstergesi içeren bir yeniden dolaşımlı perfüzyonda geçiş yapmak.
- Kalbin ısıtılması ve optik haritalama için voltaj duyarlı bir boya eklenmesi.
Ana Sonuçlar
- V m ve SR Ca 2+ dinamiklerinin başarılı eşzamanlı ölçümü.
- Optik haritalama tekniğinin etkinliğini gösterdi.
- Kalsiyum ve transmembran potansiyel arasındaki ilişki hakkında içgörüler sağladı.
- Gelecek çalışmalar için güvenilir bir protokol oluşturdu.
Sonuçlar
- Çift optik haritalama tekniği, kardiyak dinamikleri incelemek için etkilidir.
- Bu yöntem, kardiyak fizyoloji araştırmalarını ilerletebilir.
- Gelecekteki uygulamalar, kalp hastalıkları üzerindeki çalışmaları içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables direct, simultaneous measurement of intra-sarcoplasmic reticulum calcium and transmembrane potential in intact cardiac tissue, providing mechanistic insight into excitation-contraction coupling and arrhythmogenic substrates. By resolving spatial and temporal dynamics of SR Ca2+ handling in a physiologically relevant model, it supports target validation and de-risking in cardiovascular drug discovery. The approach bridges molecular mechanisms with tissue-level phenotypes, enhancing predictive confidence in preclinical safety and efficacy assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying SR Ca2+ load and release dynamics under pathophysiological stress, such as beta-adrenergic stimulation.
- Operational Value: Enables functional validation of targets involved in calcium handling, reducing mechanistic ambiguity in early target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with dual-readout capability for assessing compound effects on both electrophysiology and calcium homeostasis.
- Operational Value: Supports assay standardization through simultaneous Vm and SR Ca2+ monitoring, improving reproducibility in ion channel and calcium modulator screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links molecular perturbations to tissue-level arrhythmogenic phenotypes, enabling disease-relevant system modeling for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying pro-arrhythmic signals early in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical safety profiling, particularly for compounds affecting cardiac ion channels or calcium regulatory proteins.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing bidirectional relationships between Vm and SR Ca2+ under pacing and pharmacological challenge.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs that allow comparison of test compounds against control conditions in a standardized format.
- Analytics: Provides high-resolution spatiotemporal measurements of calcium transients and action potential dynamics, enabling comparative analysis across experimental groups.
- Translational Research: Connects findings to preclinical continuity by modeling arrhythmogenic substrates observed in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac safety pharmacology and mechanism-of-action studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of SR Ca2+ handling and its electrophysiological consequences.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via dual-parameter optical mapping in a controlled Langendorff-perfused system.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by detecting calcium-mediated arrhythmogenic triggers before costly late-stage failures.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on SR calcium stability and transmembrane stability.
Implementation Considerations
- Expertise in optical mapping, perfusion techniques, and fluorescent dye handling is required for successful signal acquisition.
- Instrumentation includes high-speed CMOS cameras, LED excitation systems, and perfusion setups capable of recirculating and large-volume modes.
- Cross-team standardization depends on consistent dye loading, temperature control, and pacing protocols across laboratories.
- Adaptation to other model systems (e.g., rat, human tissue) may require optimization of indicator concentration and perfusion parameters.
- Practical limitations include low signal amplitude of SR calcium indicators, necessitating careful dye loading and minimization of cytosolic interference.
