Name: Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Keşfedin enzim katalizinde çözücü dinamiklerinin etkisini moleküler dinamik simülasyonları ve CAVER 3.0 kullanarak. Bu yöntem su taşıma kanallarının mühendisliği ve biyokataliz mekanizmalarının anlaşılması için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İsveç Araştırma Konseyi (VR), genç bir araştırmacı hibe #621-2013-5138 tarafından bu çalışmaya mali destek için büyük ölçüde kabul görmektedir. KTH Kraliyet Teknoloji Enstitüsü'ndeki PDC Yüksek Performanslı Bilgi İşlem Merkezi, hesaplama desteği sağladığı için kabul edilmektedir.

1. Giriş Silico Bilgisayar Modellemesi <ol><li> Protein veri bankası (PDB) ilginin bir protein PDB yapısı indirin. Aşırı alt birimleri kaldırılması ve ardından &quot;Hücre Nötralizasyon ve p K tahmin&quot; YASARA 16 deney kullanarak eksik hidrojen atomlarını ve açık solvent ekleyerek yapıyı hazırlayın. Membrana bağlı triterpen siklazlar için, su kutusu uygun boyutları 91x67x77 Å bulunmaktadır. El katalitik olarak aktif amino asitler protonlanma durumunu ayarlayın. Not: PDB dosyasında bir alt-tabaka analog &quot;Edit | takas | atom&quot; kullanarak gerçek bir alt-tabaka için değiştirilebilir Gerekirse komutu. </li><li> AMBER kuvvet alan suite 17 ile &quot;Enerji minimizasyonu&quot; komutu ile yapısını en aza indirin. Uzun menzilli elektrostatik etkileşimler için hesap parçacık örgü Ewald yaklaşımı (PME) 18 kullanın. Göre van der Waals etkileşimleri için cut-off Setstandart ayarlara. Not: yakınsama ulaşılana kadar &quot;Enerji minimizasyonu&quot; komutu sonra kısa dik iniş minimizasyonu, bir tavlama benzetimi ile yapısal stres ortadan kaldırır (timestep 2 FSEC, 0.9 her 10 inci adım tarafından küçülttüm atom hızları) gerçekleştirilir (yani, enerji gelişme ) 200 adımları sırasında atom başına en az 0.012 kcal / mol olarak. </li></ol> Aktif Sitesi çözme ve Su Erişim 2. Model <ol><li> Tavlama benzetimi sonra, 20 NSEC moleküler dinamik (MD) yörüngesini çalıştırın ve &quot;Dosya | Kaydet | Simülasyon Snapshot&quot; en az 10 enstantane oluşturmak &quot;Simülasyon On&quot; izledi komuta. Kanonik toplulukta altında periyodik sınır koşulları ile standart bir bilgisayarda simülasyonlar çalıştırın. Bir Berendsen termostat kullanılarak 298 K sıcaklık koruyun. </li><li> Tüm su molekülleri ve nihai ligandlar / maddeleri kullanarak silerek 2.1 elde edilen anlık hazırlayın4; Düzenle | Sil | Üst üste Kalıntı &quot;orijinal PDB-yapısına ayrı komut Üst üste her anlık.&quot; | Object &quot;komutu tüm yapıların aynı uzaysal konumunu paylaşan sağlamak, yeni bir PDB Bu şekilde hazırlanan her anlık kaydet. -dosya (kullanarak &quot;Dosya | Farklı kaydet | PDB&quot; komutu). Deneyimli modelleyicileri için: Not Ek Kod Dosya 1&#39;de verilen şablona göre bu işlemi otomatik hale getirmek için bir komut dosyası yazın. </li><li> Yazılım caver 3.0 19 girdi olarak 3D uzayda hizalanmış olan 2.2 den hazırlanan fotoğraf (PDB) kullanın. Anlık sınırlı sayıda analizi için, standart bir bilgisayar üzerinde Caver çalıştırın. Su moleküllerinin taşınması için özel olan tünellerin saptanmasını sağlamak için 0,7 Å 19 bir sonda yarıçapı kullanın. </li><li> Bir moleküler grafik yazılımı Caver 3.0 tarafından oluşturulan tüneller gözünüzde canlandırın. Tünellerin kolay görsellik için, Ek Kod Fil gösterilen makro kullanmake 2. </li></ol> Silico Enzim Mühendisliği 3. Su Desenleri ve Su Dynamics Değiştir <ol><li> Caver 3.0 yazılımından üretilen çıktı dosyası &quot;Summary.txt&quot; bölümünde listelenen başlığı &quot;ID&quot; göre yüksek sıralamadaki tünelleri tanımlayın. </li><li> En üst sırada yer tüneller (3.1) ve bu ekran (2.4 elde edilen modeli kullanarak) görsel inceleme yoluyla kanal içine doğru bakan bir küçük yan zincir astar amino asitler tanımlayın. &quot;Takas Kalıntı&quot; komutunu kullanarak artan sterik engelleme ile tünel engeller tek amino asit yer değiştirmelerini tanımlayın. Tünel adımları protokolün 1.2-3.1 tekrarlayarak sonra görsel inceleme ile tıkalı ve emin olun. </li></ol> Mutasyona uğramış genlerin 4. İfade <ol><li> Örtüşmeyen primerler 20 ile mutagenezi, PCR ile, vahşi tip gen mutasyonu tanıtmak. </li><li> Tüpe ilgili geni içeren plazmid DNA eklemeuygun bir klonlama soyunun güçlü hücrelerle s ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 42 ° C olarak ayarlandı sıcaklıkta bir su banyosu içinde 45 sn için bir ısı şoku dönüşümü gerçekleştirir. Taze zengin ortamdan 500 ul ekle (2YT, 16 g / L tripton, 10 g / L maya ekstresi, 5 g / L NaCl), 37 ° C&#39;de inkübe, 45 dakika boyunca 200 rpm. Uygun antibiyotik ile takviye agar plaklarına dönüştürülmüş hücreleri kaplama ile bir seçim yapın. </li><li> Mutasyona uğramış genin DNA dizisini doğruladıktan sonra, yukarıda tarif edildiği gibi, ısı şoku kullanılarak bir ekspresyon suşu plazmid DNA dönüşümü. Membrana bağlı triterpen siklaz ekspresyonu için, BL21 (DE3) kullanın. </li><li> Uygun antibiyotikler ile takviye edilmiş ortam içinde 2YT-sentezleme suşu 37 ° C&#39;de 5 ml O / N kültür başlatın. </li><li> 0.05-0.09 nihai OD, uygun antibiyotik ile takviye edilmiş 300 ml 2YT ortam-ihtiva eden bir 2 L&#39;lik bölmeli bir çalkalama şişesi inoküle (600 nm &#39;de ölçülür). 0.6-0 bir OD indüksiyon sonrası.8 ve protein ifadesi, 80 ° C&#39;de hücre pelletini ve mağaza dondurma. <ol><li> Bir pD861 vektörü içinde zara bağlı triterpen siklazlar için, protein 21, yüksek verim elde etmek için 37 ° C&#39;de 0.5 saat ifade mM ramnoz 2 ve 4 ile neden olur. </li></ol></li></ol> Normal Santrifüj ve Protein Saflaştırılması Kullanılması 5. Membran Ekstraksiyon <ol><li> Aşağıdaki tamponlar hazırlayın: Tekrar süspansiyona, tampon (100 mM potasyum fosfat, proteas engelleyici tabletleri ile takviye edilmiş, pH 7.5), deterjan tamponu (% 1 (v / v) Triton X-100, 50 mM potasyum fosfat, pH 7.5) eklendi ve reaksiyon tampon maddesi (0.2 % Triton X-100, 50 mM potasyum fosfat, pH 7.5). <ol><li> Skualen siklaz hopene veya daha düşük bir pH optimumuna sahip, diğer zara-bağlı enzimler için, sitrat ile yeniden süspansiyon haline getirme tamponu içinde potasyum fosfat değiştirin. Deterjan tamponu (% 1 Triton X-100: Bu tür enzim için, aşağıdaki tamponlar, 60 mM sitrat, pH 6.0) eklendi ve reaksiyon tampon maddesi (% 0.2 Triton-X 100, 60 mM sitrat, pH 6.0). Not: His-tag saflaştırılması için kullanılırsa, 20 mM imidazol (nihai konsantrasyon) ile yeniden süspansiyon haline tampon tamamlar. </li></ol></li><li> Bir cam beher içinde, bir donmuş hücre topağı tartılır. / Ml 0,3 g hücrelerin nihai bir konsantrasyona kadar bir homojenleştirici kullanılarak yeniden süspansiyon tamponunda tekrar süspansiyon hücreleri. % 80 genlik ve 1 saniye ve 1 saniye kapalı bir darbe ile ultrasonication tarafından Lyse yeniden süspanse hücreleri. 50 sn her üç tekrarlanan döngülerini kullanın. </li><li> % 0.2 (h / h) deterjan nihai bir konsantrasyona kadar tampon, deterjan ekleyin. 1 saat süre ile 4 ° C &#39;de, karıştırma ucu-üzerinde-sonuna dengelenmesi. 4 ° C&#39;de 50 dakika boyunca 39.000 x g&#39;de tek bir santrifüj aşamasında sonra süpernatant kaydederek membran proteini fraksiyonu yeniden elde. Not: His-tag saflaştırma kullanılırsa, agaroz / g hücre, yaklaşık 1.5 ml Ni-NTA ekleyin ve 1 saat kuluçkada bırakın. </li><li> Bir birinci arıtma işlemleriniiyon değişimi veya His-tag arıtma 21 ya adım. % 0.2 Triton X-100 ile dengeleme ve elüsyon tamponlarının Ek. Saflaştırılmış proteini 10 kDa&#39;lık bir kesim ile Santrifüj Filtre Birimleri kullanılarak beş kez konsantre edilir. Not: deterjan konsantrasyonunda Triton X-100 miseller sonuçlar büyüklüğü yaklaşık olarak% 1 bir son konsantrasyona seyreltildi. </li><li> . 10 6 × 2 × 10 4 -8 arasında küresel proteinler için bir fraksiyon aralığı ile uyumlu konsantre protein ve bir matris kullanılarak jel süzme parlatma adım arınma tamamlayın tampon olarak çalışan reaksiyon tamponu kullanın. Üreticinin protokolüne uygun olarak Bradford Ultra kiti kullanılarak saflaştırılmış protein miktarını ölçün. </li></ol> 6. Kinetik <ol><li> Reaksiyon tampon maddesi içinde alt-tabaka taze 5 mM stok solüsyonu olun. 2-5 dakika boyunca% 30 genliğinde ultrasonikasyon ile homojen bir emülsiyon elde edilir. </li><li> Bir termomikser dengelenmesiistenen reaksiyon sıcaklığında gerçekleştirilir. Harici termometre ile cam şişe su içeren içindeki sıcaklığı kontrol edin. </li><li> Tek substrat kinetikleri, aynı nihai alt yapı konsantrasyonu en az beş cam şişelere emülsiyon haline alt-tabakanın seyreltin. <ol><li> Birden fazla alt-tabakalar ile tek-kap göre kinetiği için, her bir küçük şişe içinde, tüm tabakaları karıştırarak en az beş eşit cam gibi tüp hazırlanır. Hidrofobik triterpenler için, 10-200 uM aralığı içinde son substrat konsantrasyonları kullanırlar. </li></ol></li><li> 10 dakika termomikser cam şişeleri Preincubate. Enzim ilave ederek reaksiyonu başlatın. 1 ml&#39;lik bir toplam reaksiyon hacmi uygundur. En az 1200 rpm çalkalama hızı kullanın. </li><li> 500 ul etilasetat ekleyerek farklı zaman noktalarında reaksiyonlar durdurun entegrasyon standart olarak 100 uM dekanol ile çivili. </li></ol> 7. Ekstraksiyon ve Termodinamik Analizi <ol><li> Ile reaksiyon karışımları ekstraktevorteks elle 1 dakika boyunca güçlü bir şekilde cam gibi tüp çalkalanarak. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde 9600 xg&#39;de cam şişeleri santrifüjleyin. Boş bir tüp üst tabaka (organik faz) aktarın. Reaksiyon tüplerine özütleme çözücüsü ilave bir 500 ul ilave edin ve ekstraksiyon prosedürü tekrarlayın. </li><li> Na 2 SO 4 ile ekstre Reaksiyon karışımları kurutun. 5 saniye Vortex ve tüpler 10 dakika dinlenmeye bırakın. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9600 x g&#39;de santrifüj adımı nihai gerçekleştirin. Gaz kromatografisi (GC) flakon ayıklanır örnekleri aktarın. </li><li> (Tek alt-tabaka kinetiklerinin) alt-tabakanın, en az dört farklı başlangıç ​​konsantrasyonuna ve (tek alt-tabaka ve rekabetçi kinetiği her ikisi için), dört farklı sıcaklıklarda, ilgi konusu her bir enzim varyantı için 6.1-7.2 altındaki adımları tekrarlayın. </li><li> Daha önce 3 açıklandığı gibi GC-analiz gerçekleştirin. Hidrofob analizi için polar olmayan bir sütun kullanarakic pentasiklik ürünleri. Ürünleri ve sütun bağlı olarak, 120 ° C, başlangıç ​​fırın sıcaklığı ayarlamak ve 5 ° C / dakikalık bir sıcaklık gradyanı kullanılır. </li><li> Ürün (ler) in entegre pik alanları ve (100 uM karşılık gelen) entegrasyonu standart alana sahip karşılık gelen bir ürün konsantrasyonlara ürün zirve alanları dönüşümü. Reaksiyon süresi (t) karşı her bir ürün ([P]) konsantrasyonunu çizilir. % 10&#39;dan daha az dönüşüm tekabül eden veri noktalarının doğrusal regresyonu gerçekleştirin. Başlangıç ​​reaksiyon hızı (V 0) &#39;e göre, uydurulmuş çizginin eğimini ile elde edilir: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation1.jpg" /> Not: birden çok malzeme ile tek-kap göre kinetiği için, V 0, diğer alt-tabakaların etkisi altında, belirli bir alt-tabaka ilk oranıdır. </li><li> Tek substrat kinetiği, arsa V 0 İçin </suİlgili substrat konsantrasyonları karşı b&gt; / [E]. Belirgin k cat / K M değerine göre grafik doğrusal parçası eğimi ile verilir: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation2.jpg" /> [S] substrat ve konsantrasyonudur [E] dönüşüm. K cat kullanılan son enzim konsantrasyonu / K M, Michaelis sabiti üzerinde katalitik katsayısına denk gelmektedir. Her sıcaklık ve her enzim çeşidi için analiz tekrarlayın. </li><li> Tek substrat kinetiği için, geçiş durumu teorisi 22 uygun bir termodinamik analizi gerçekleştirmek <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation3.jpg" /> k b Boltzmann sabiti, h Planck sabiti, T Kelvin sıcaklık ve gaz sabiti R. K ((ln arsa bir lineer regresyon analizi yapın <sub&gt; Kedi / K M) / ((k b * T) / h))) 1 / T karşı. Aktivasyon entalpisi (Δ H ‡) (-slope) * R ve aktivasyon entropi (Δ S ‡) (kesişme) * R tarafından verilen tarafından verilir. Not: Benzer şekilde, alt-tabaka saturasyon konsantrasyonu altındaki bir analiz denklem 3 sabit oran olarak k cat kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> Birden substratları ile tek pota göreli kinetik için, bağıl belirgin elde k cat / 23 K M değerleri: (K cat / K M) A / (k cat / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4) ki burada V 0, bir alt tabaka, B ile rekabet alt tabaka A için, ilk oran değinmektedir </li><li> Tek pota göreli ki&#39;nin içinBirden substratları ile davi s, doğrusal olmayan regresyon ile, A olarak referans ile karşılaştırıldığında, B aktivasyon göreceli termodinamik parametreleri edinin: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation5.jpg" /></li><li> Aktivasyon entalpisi ve referans bileşik A entropi substrat B mutlak aktivasyon parametreleri hesaplamak: <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation6.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Ball, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+as+an+active+constituent+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Water as an active constituent in cell biology.</a> Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).</li>
<li>Snyder, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+hydrophobic+effect+in+the+biomolecular+recognition+of+arylsulfonamides+by+carbonic+anhydrase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).</li>
<li>Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+is+Key+to+the+Formation+of+Pentacyclic+Terpenoids+by+Enzyme-Catalyzed+Polycyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).</li>
<li>Persson, F., Halle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Access+to+the+Protein+Interior%3A+Simulation+versus+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).</li>
<li>Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Active-Site+Solvent+in+the+Thermodynamics+of+Factor+Xa+Ligand+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).</li>
<li>Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+Displacing+Water+Molecules+from+Protein+Binding+Sites%3A+Consequences+for+Ligand+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).</li>
<li>Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+water+transfer+energy+to+protein-ligand+association+and+dissociation+barriers%3A+Watermap+analysis+of+a+series+of+p38%C3%8E%C2%B1+MAP+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3A+Struct.%2C+Funct.%2C+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38Î± MAP kinase inhibitors.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).</li>
<li>Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+for+molecular+recognition+exploiting+hydrophobic+enclosure+in+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).</li>
<li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-Mediated+Recognition+of+Simple+Alkyl+Chains+by+Heart-Type+Fatty-Acid-Binding+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).</li>
<li>Pavlova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+dehalogenase+access+tunnels+as+a+strategy+for+degrading+an+anthropogenic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).</li>
<li>Breiten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Networks+Contribute+to+Enthalpy%2FEntropy+Compensation+in+Protein-Ligand+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).</li>
<li>Oldfield, E., Lin, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terpene+biosynthesis%3A+Modularity+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Terpene biosynthesis: Modularity rules.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 51 (5), 1124-1137 (2012).</li>
<li>Henzler-Wildman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+timescales+in+protein+dynamics+is+linked+to+enzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis.</a> Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).</li>
<li>Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+activity+regulation+by+conformational+entropy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein activity regulation by conformational entropy.</a> Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).</li>
<li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+origin+of+the+catalytic+power+of+enzymes+and+the+role+of+preorganized+active+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites.</a> J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).</li>
<li>Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+optimal+use+of+empirical+energy+functions%3A+Force-field+parameterization+in+crystal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3A+Struct.%2C+Funct.%2C+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point-charge+force+field+for+molecular+mechanics+simulations+of+proteins+based+on+condensed-phase+quantum+mechanical+calculations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations.</a> J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).</li>
<li>Essmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smooth+particle+mesh+Ewald+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">A smooth particle mesh Ewald method.</a> J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).</li>
<li>Chovancova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAVER+3.0%3A+a+tool+for+the+analysis+of+transport+pathways+in+dynamic+protein+structures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708(2012).</li>
<li>Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+and+site-saturation+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.</a> Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).</li>
<li>Kürten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+functional+human+oxidosqualene+cyclase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Express.+Purif%22%5BJournal%5D)">Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli.</a> Protein Express. Purif. , (2015).</li>
<li>Eyring, H., Stearn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+the+theory+of+absolute+reaction+rates+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">The application of the theory of absolute reaction rates to proteins.</a> Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).</li>
<li>Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein. , W.H. Freeman. (1999).</li>
<li>Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+squalene+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a squalene cyclase.</a> Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%2C+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+enzymes+work%3A+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Yabani tip membran enzimi ve tünel varyantlar için yüksek kaliteli, deneysel termodinamik verileri ulaşmada en kritik adımlar şunlardır: Bilgisayarınızın modeline 1) nesil; 2) homojen saflaştırılmıştır proteinler; 3) emülsifiye substrat stokları; 4) kinetik sırasında sıcaklığın kontrolü; Iç standart kullanılarak tepkime karışımlarından 5) elde edilmesi. Bilgisayar modeli nesil ölçüde platformlarda çeşitli destekler kullanıcı dostu arayüzü ile bir yazılımın kullanımı kolaylaştırılmıştır. Dolayısıyla, bu protokol bile olmayan uzmanlar modelleme bizim strateji erişilebilir hale getirmek için YASARA modelleme paketi 16 yapılanır. Su tüneli tanımlanması için bir bilgisayar modelinin, ilgi 24 enzimin bir kristal yapısı dayanmalıdır. Bu amaç için, protein veri bankası uygun kristal yapılarının zenginliği çok faydalıdır. Bizim deneyim, tem başarılı hazırlanmasında önemli bir yönüyleTünel tanımlanması için plakalar kristalografik suları tutmaktır. Bu normal bir bilgisayarda çalıştırılabilir moleküler dinamik simülasyonları, yaparken bir çözülmüş enzim kutusunu kullanın eşit öneme sahiptir. Alicyc acidocaldarius gelen triterpen siklaz MD simülasyonları 3 esnasında su stabildir. Bununla birlikte, kristalografik deterjanlar tutmak ve / veya hücre membranı taklit eder kullanılarak belki de uzun bir MD simülasyonlar için izin vermek için potansiyel olarak kararsız enzimler için gerekli olacaktır. Bu tünel örgütün dinamik yönlerini ele olmaz, ancak son derece zorlu hedeflerin minimize kristal yapısı, protokolü kullanılarak önemli mekanik fikir verebilir öngörülmektedir. Tek veya girdi olarak anlık sınırlı sayıda temel modda Caver 19, standart bir dizüstü bilgisayarda olmayan uzmanlar tarafından da kullanılabilir. Bizim deneyim 3, bir darboğaz yarıçaplı tüneller (yani, yarıçap dayanaraken dar noktasında) 1&#39;den küçük Å kristalografik su molekülleri sol orta), tahmin edilen tünelin (Şekil 1 içinde ikamet, özellikle su son derece alakalı olabilir. Diğer yandan, daha büyük bir dar boğaz çapı ve aktif sitenin 10 üzerinden alt-tabakanın taşınması için bir tünel anlamına gelebilir. Tamamlayıcı Kodu komut 2. öngörülen tünellerin görünüm için olmayan uzmanlar tarafından kullanılabilir Dosya. Gelecek deneyler homoloji modelleri, su şebekeleri ve dinamikleri atomistik çalışma için izin yeterince yüksek çözünürlük olup olmayacağını ortaya koyacaktır. Ve aktif bölgede bulunan bir bağ olmadan, moleküler dinamik simülasyonları performans nasıl ışık tutan, tünel tanımlama süreci de önemli olacağını etkiler. Membran proteinlerinin Kinetik zorlu bir 25 teşkil edebilir. Protokol, burada basit bir zar çıkarma protokolüne dayalıörneğin, bir ultra santrifüj gibi pahalı ekipman kullanılmaksızın membran enzim elde edildi. Son cilalama aşaması olarak jel filtrasyonu kullanımı potansiyeli artık zar partikülleri temizler ve uygun bir deterjan ortamı 25 tanımlamak için izin verir. Protokolden tekrarlanabilir kinetik sonuçlar elde önemli bir yönü ultrasonication substrat stok çözelti emülsifiye etmektir. Reaksiyon tampon maddesi içinde seyreltilmiş, hidrofobik yüzeylere basit vorteksleme homojen olmayan alt tabaka, deterjan karışımları vermektedir. Olmayan emülsifiye edilmiş alt-tabaka çözeltilerinin pipetleme başlangıç ​​hızları doğru belirlenmesini önler (kantitatif GC ile teyit) &#39;tekrarı konsantrasyonlarına yol açar. Buna karşılık, doğru emülsiyon haline Stok çözeltilerin pipetleme 0.98-0.99 aralığında R 2 ile başlangıç ​​hızları lineer regresyon analizi ile sonuçlanmalıdır. Hidrofobik alt-tabakaların bir diğer önemli yönü görünür substrat çözünürlüğüdürve alt tabaka-deterjan karışımlarında kullanılabilirlik. Aslında, bu referans substrat skualen ile Triterpen siklaz doyurmak mümkün değildi. Bu nedenle belirgin k kedi / K M değerleri hem bağlayıcı ve kimya katkıları içerebilir hangi burada sunulmuştur. Ancak, kimya k kedi için sınırlayıcı hızı olduğu görülmüştür / triterpen siklazlar 3 tarafından yürütülen polycyclization kaskad K M. Harici bir termometre ile bir reaksiyon cam bir şişe içindeki gerçek sıcaklık kontrol etmek için büyük önem taşımaktadır. Yine de, doğrusal uyan farklı sıcaklıklarda temel sabit görünen k cat / K M değerlerine sahip varyantlar için kötü olabilir. Bu sıfır (Şekil 2B ve 2C) yakın bir aktivasyon entalpisi ile S168F varyantı burada (Şekil 2A) için olduğunu vurguladı. Çok smalbelirgin k kedi l sıcaklığa bağlı değişimleri / K M, gözlenen aktivasyon entropi belirsizlik neden olabilir Δ S ‡ (yani, Şekil 2B&#39;de doğrusal araziler kesişimi). Prensip olarak, gözlemlenen aktivasyon entropi aynı zamanda protein konsantrasyonu ölçülerek tespit olmaz farklı türevleri aktif enzim, farklı bir bolluk etkilenebilir. Bu tek bir kapta birden fazla alt-tabakaların karıştırırken deneysel hatalar azaltılır beklenmektedir. Farklı alt-tabakalar, bu, tüm koşullar altında enzim aynı miktarda (denklem 4) ile etkileşim olmasıdır. Bir ekstraksiyon çözücünün kullanımı, bir iç standart ekstre etme ve / veya GC-enjeksiyon sırasında farklılıkları hesaba önemlidir ile çivili. Geçiş devlet teorisi başarıyla enzimoloji 26 kullanılmıştır. Bu önemli teorik çerçeve başlangıçta de oldugaz fazında tek moleküllü reaksiyonlar için veloped. Bununla birlikte, enzimlerin çoğu klasik aktivasyon enerji bariyerini 26 düşürerek çalışması gösterilmiştir. Tek, burada olduğu varsayılır iletim katsayısı ölçülen aktivasyon entalpisi ve / veya entropi etkileyebilir. Tünel katkısı ve bu geçiş halinin recrossing gibi diğer klasik olmayan etkiler, kabaca enerjide yaklaşık 4 kcal / mol tekabül kataliz 26 1000 kat katkıda bulunabilirsiniz. Bu (328 K, Şekil 2C, 16 kcal / mol), vahşi tip enzimin tarafından görüntülenen aktivasyon entropi muntazam olmayan bir aktarım katsayısı nedeniyle örneğin klasik olmayan etkileri çok daha büyük olduğu görülebilir. Protokolünü kullanarak vahşi tip ve tünel türevleri için aktivasyon termodinamik parametreleri karşılaştırırken iletim katsayısının etkisi azaltmak gerekir. Aktivasyon Gibbs serbest enerjisi (Δ G ‡) bileşim olupBir enthalpic (Δ H ‡) ve Entropic hem sed (- T * Δ S ‡) terim. Kataliz sırasında enzimlerin Solvent yeniden yapılanma hem parametreleri etkileyebilir. Mevcut protokol gerekli biyofiziksel deneysel çerçeve ile ilgili ve silico kullanıcı dostu hesaplama araçları araç kutusu monte ederek bu olayların incelenmesini kolaylaştırmak bekleniyor. Yöntem, membrana bağlı enzimler ile kataliz içeren enzimatik yöntemlerle, bir bolluk çalışmak için faydalı olduğu düşünülmektedir.

Su yaşam 1 kimyasının bir taşını oluşturmaktadır. Su desenleri ve enzim aktif sitelerin çözme entalpisi ve hidrofobik etkisi 2,3 ötesine uzanan oldukça karmaşık bir şekilde 1,2 ve kataliz 3 ligand entropi hem de etkiler. NMR 4, kalorimetre 2 ve çözünmüş proteinlerin moleküler modelleme ligand dernek 5-8, özgüllük ve aktivite 2,9,10 için itici bir kuvvet sağlayan açık su moleküllerinin rolüne ışık tutacak için kullanılır olmuştur. Bu yazıda Enzim kataliz üzerindeki çözücü deplasman termodinamik etkisi (Şekil 1) deneysel değerlendirilmesi için eşsiz bir metodoloji sunuyoruz. Bizim kombine strateji enzim mühendisliği ve termodinamik analizi (Şekil 1) ile uyum içinde bilgisayar simülasyonları kullanarak dayanmaktadır. Bu cata üzerine çözücü dinamiklerin etkisi ek aydınlatan sağlarŞu anda tam olarak anlaşılamamıştır parçalama. Çözünmüş enzim aktif sitelerde su aracılı hidrojen bağları tarafından sağlanan enthalpic etkileşimleri, stabilize, entropik cezalar 1 mahsup edilebilir. Toplu 5 su ile karşılaştırıldığında bu entropik maliyetler protein boşlukları içinde kalan su molekülleri tarafından görüntülenen serbestlik derecesi azalma ile ilişkilidir. Sipariş su moleküllerinin serbest bırakma ve böylece ligand dernek 1 ve kataliz 3 için entropik itici gücünü sağlayabilir. Solvent dinamiklerinin önemli bir yönü proteinlerin iç ve dış solvent 4 arası su moleküllerinin değiştirmesidir. Aktivasyon enerjisi, entalpi, entropi ve 11 İlişikteki değişiklikler tamamen moleküler düzeyde anlaşılmış değildir. Aktivasyonuna enzimlerin suyun taşınması, çözücü dinamikleri önemi ve katkılarından dolayı sorumlu bireysel tüneller engelleyerekEnerji (Şekil 1) değerlendirilebilir. Ayrıca, farklı sıcaklıklarda tek kap kinetik deneyler yaparak çeşitli alt tabakaların göreli termodinamik aktivasyon parametreler, deneylerin sayısı azaltılmış (Şekil 1, sağ) elde edilebilir. Bizim disiplinlerarası yöntem ömrü 12 yüksek öneme sahip polisiklik terpenler oluşturmak karmaşık zara bağlı triterpen siklaz enzimleri onaylanmıştır. Protokol, standart bir santrifüj kullanılarak membran proteini yüksek miktarda (10-20 mg / L) geri kazanımını sağlar. Enzimler, su gelişti rağmen, kataliz teşvik çözücü rolü genellikle ihmal edilir. Şekil geçiş durumuna 15 elektrostatik tamamlayıcılık aktif siteler önceden organize protein dinamikleri 13,14 ek olarak, su dinamiği, verimli enzim kataliz için yüksek öneme sahip olabilir. Birkaç disiplinlerarası teknikleri dövme, bizimAmaç su dinamikleri ve termodinamiğin son derece karmaşık bir çalışma kolaylaştırmaktır. Bilimsel topluluk bu araçları daha erişilebilir hale değişmiş faaliyetleri ve özellikleri için enzim mühendisliği ve protein tasarımında yeni stratejilerin geliştirilmesine yol açacaktır.

<table><tbody><tr><td>YASARA</td><td>YASARA Biosciences</td><td>http://www.yasara.org/</td> <td>Moleküler modelleme ve simülasyon programı&nbsp;</td></tr><tr><td>MAĞARACI&nbsp;</td><td>CaverSoft</td><td>http://caver.cz/</td> <td>Proteinlerdeki tünellerin analizi için araç, akademik kullanım için ücretsiz lisans</td></tr><tr><td>Bradford Ultra</td><td>Expedeon</td><td>BFU1L, BFU05L</td><td>%1'e kadar deterjan içeren çözeltilerde protein kantitasyonu</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem homojenizatör</td><td>VWR</td><td>432-0205, 432-0217</td><td>Donmuş hücre peleti</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletlerinin</td> homojenizasyonu <td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Santrifüj Filtre Üniteleri</td><td>Milipore</td><td>UFC901008</td><td>Protein konsantrasyonu için santrifüj filtre üniteleri, MWCO 10 kDa</td></tr><tr><td>Termomikser ve nbsp;</td><td>Numune inkübasyonu için</td> <td>Eppendorf</td><td>5382000015</td> Thermomixer</tr></tbody></table>

membran enzim solvent dynamics bağlı çözülüyor entropic oranı İvme

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Enzim katalizi sulu bir ortamda evrimleşmiştir. Bununla birlikte, çözücü dinamiklerinin kataliz üzerindeki etkisi şu anda tam olarak anlaşılamamıştır ve genellikle ihmal edilmektedir. Enzimlerdeki su dinamiği ve buna bağlı termodinamik sonuçların incelenmesi oldukça karmaşıktır ve bilgisayar simülasyonları, nükleer manyetik rezonans (NMR) deneyleri ve kalorimetri içerir. Aktif bölgeyi çevredeki solvente bağlayan su tünelleri, solvent yer değiştirmesi ve dinamiğinin anahtarıdır. Buradaki protokol, özgüllüğü, aktiviteyi ve termodinamiği etkileyen su taşımacılığı için bu motiflerin mühendisliğine izin verir. Teori ve deneylere dayanan biyofiziksel bir çerçeve sağlayarak, burada sunulan yöntem, bilgisayar modelleme veya biyofiziksel kimya konusunda daha önce uzmanlığı olmayan araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Yöntem, tıkalı su tünellerine sahip enzim varyantları tarafından kataliz ile ilişkili entalpik ve entropik değişiklikleri ölçerek moleküler düzeyde enzim katalizi anlayışımızı ilerletecektir. Protokol, zara bağlı enzimlerin ve diğer karmaşık sistemlerin incelenmesi için kullanılabilir. Bu, katalizde çözücünün yeniden düzenlenmesinin önemine ilişkin anlayışımızı geliştirecek ve aynı zamanda protein tasarımı ve mühendisliğinde yeni katalitik stratejiler sağlayacaktır.

Enzimatik polycyclization kataliz su dinamiklerinin önemi siliko analizi ve tespit edilen tünellerin sonraki görselleştirme (2 File Ek Kanununda komut dosyası kullanarak) tarafından alakalıdır. Protokol bölümünde 3 ardından, S168 Alicyc acidocaldarius gelen triterpen siklaz enziminin içinde tünellerin biri astar bir &quot;sıcak nokta&quot; amino asit kalıntısının (Şekil 1, sol orta) olarak bulunmuştur. Görsel denetim (Şekil 1, sol altta) tarafından görüldüğü gibi silico mutasyon S168F tanıştırarak, tünel tıkanmış. Triterpen siklaz enzimi ile gösterildi: polisiklik ürünlerinin oluşumu için reaksiyon hızı sıcaklığı (Şekil 2A) için yüksek ölçüde duyarlıdır. Protokolü (bölüm 4-7) ardından, bulunan belirgin k cat / K o <susıcaklık 25 ° C (Şekil 2A) ile yükseltildiğinde b&gt; pentasiklik ürünlerinin oluşumu için, vahşi tip enzimin tarafından görüntülenen M elli misli arttırmaktadır. Tek bir nokta mutasyonu tek tek tüneller engelleme deneysel olarak belirlenen mutlak belirgin k cat / K M değerleri üzerinde önemli bir etkisi vardır, yanı sıra sıcaklık bağımlılığı (Şekil 2A) ile. Deneysel olarak belirlenen kinetik parametreleri, doğrusal termodinamik araziler denklemi 3 ile ve tek substrat kinetiği (Şekil 2B) için protokol bölüm 6-7 aşağıdaki tarafından üretilir. Engellenen tüneller barındıran varyantlar için gözlenen aktivasyon entropi ve entalpi çok büyük değişiklikler (Şekil 2B dayalı Şekil 2C, hesaplamalar) önemli bir polycyclization kaskad teşvik su dinamikleri için rol ima eder. DahasıDeğişmiş su tünelleri aktivasyon bir değiştirilmiş Gibbs serbest enerjisi görüntüler ile varyantları (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡ Şekil 2B-C). Örneğin, 303 K S168F tünel varyantı, yabani tip enzim için 16 kcal / mol ile karşılaştırıldığında 14 kcal / mol aktivasyon Gibbs serbest enerjisi gösterir. Bölüm 7 protokolü sonrasında, denklem 4 tek pota kinetik deneyler ek yüzeylerde (Şekil 3A) için belirgin k cat / K M değerlerinin hesaplanması için izin verir. Ayrıca, doğrusal bir termodinamik arsa (Şekil 3B), farklı sıcaklıklarda (denklem 5) yarışma kompozisyon çalıştırarak yapılabilir. Tek substrat kinetikleri benzer bir şekilde, bir referans bileşiği ile karşılaştırıldığında daha fazla yüzeyler için göreceli aktivasyonu entalpi ve entropi readil olandoğrusal kesişim ve yamaç erişilebilir y deneysel verilere uyuyor. Aktivasyon termodinamik parametrelerin mutlak değerleri, referans bileşiği (denklem 6) ile ilişkili termodinamik veriler kullanılarak aritmetik ilave edilmesinden değerlendirilebilir. Burada protokolü kullanarak, sonuçlar açıkça engellenen su tünelleri farklı boyutlarda (Şekil 3C) ve alt tabakalar için aktivasyon temelde farklı termodinamik parametreleri görüntülemek membran enzimi varyantları olduğunu göstermektedir üretti. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> Şekil 1. Protokol özeti:. Deneysel protein tasarımı ve termodinamik analiz ile uyum içinde silico bilgisayar modelleme enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisiyle gelişmiş bir anlayış sağlar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">tıklayınız</a>Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> Tek substrat kinetik yabani tip ve tünel varyantları aktivasyon Şekil 2. Termodinamik parametreler. (A) Görünür k cat / deneysel verilerden ve geçiş hali teorisi kullanılarak denklemler 1 ve 2 (B) Termodinamik analiz kullanılarak elde K M değerleri ve deneysel verilerinin doğrusal uygun (B) &#39;de işaretlerinden hesaplandı aktivasyon 3. (C) Termodinamik parametreleri denklem. Önceden katlanmış skualen substrat tahvilleri ile gösterilir oluşturulan / noktalı çizgiler olarak kırık. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Farklı alt tabakalar için, vahşi tip ve tünel varyantlarının aktivasyon Şekil 3. termodinamik parametreler (A). Nispi k cat / denklemi 4. (B) kullanarak, tek-kaplı bir kinetik elde edilen K M değerleri farklı kinetik verilerin Termodinamik araziler denklem 5. (C) denklemi 6 ile ve referans olarak Şekil 2&#39;de substrat skualen kullanılarak hesaplanan aktivasyon Mutlak termodinamik parametreleri kullanılarak sıcaklıkları. Oluşturulan / yüzeylerde kırık Tahviller noktalı çizgiler olarak gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Enzimler su moleküllerinin taşınması için kanallar aktif bölge solvasyonu ve kataliz etkilemektedir. Bu yazıda siliko bilgisayar modellemesi ve deneylerde dayanarak bu ek katalitik motiflerin mühendislik için bir protokol mevcut. Bu enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisi anlayışımızı artıracaktır.

Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Bu disiplinler arası protokolün genel amacı, çözücü dinamiklerinin enzim katalizi üzerindeki etkisine dair temel anlayışımızı geliştirmektir. Bu yöntem, biyokataliz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, çözücü yeniden düzenlenmesinin enzim dinamiklerini ve katalizi nasıl yönlendirdiği gibi.Bu tekniğin temel avantajı, özgünlüğü, aktiviteyi ve termodinamiği etkileyen tünellerin veya su taşıma motiflerinin mühendisliğine olanak tanımasıdır. Disiplinler arası adımlar, bilimin çeşitli alt dalları arasında köprü kurduğu için öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Başlamak için, Protein Databank üzerinden ilgilenilen proteinin PDB yapısını indirin.Fazla alt birimleri çıkararak ve ardından eksik hidrojen atomlarını ekleyerek yapıyı hazırlayın; ardından YASARA'daki hücre nötralizasyonu ve pKa tahmin deneyi kullanılarak açık bir çözücü ekleyin. Membrana bağlı triterpen siklazlar için uygun su kutusu boyutları 91 x 67 x 77 Angstroms'dur. Katalitik olarak aktif amino asitlerin protonasyon durumunu manuel olarak ayarlayın.AMBER kuvvet alanı seti kullanılarak, enerji minimizasyonu komutuyla yapıyı minimize edin. Uzun menzilli elektrostatik etkileşimleri hesaba katmak için particle mesh ewald yaklaşımını kullanın. Van der Waals etkileşimleri için kesme değerini standart ayarlara göre belirleyin.Simüle tavlama ve moleküler dinamik işlemlerinin ardından, edit, delete, residue komutunu kullanarak tüm su moleküllerini ve varsa ligand substratlarını silerek simülasyon anlık görüntülerini (snapshot) düzenleyin. Tüm yapıların aynı uzamsal konuma sahip olduğundan emin olmak için, her bir anlık görüntüyü superpose object komutuyla orijinal PDB yapısı üzerine ayrı ayrı çakıştırın. Bu şekilde hazırlanan her bir anlık görüntüyü, file, save as, PDB komutunu kullanarak yeni bir PDB dosyası olarak kaydedin.Hazırlanan anlık görüntüleri CAVER 3.0 yazılımı için girdi olarak kullanın. CAVER 3.0 tarafından oluşturulan tünelleri, metin protokolünde gösterilen makroyu kullanarak bir moleküler grafik yazılım programında görselleştirin. CAVER 3.0 yazılımı tarafından oluşturulan çıktı özet metin dosyasında yer alan başlık ID'sine göre en yüksek sıralamaya sahip tünelleri belirleyin.Elde edilen modeli kullanarak, görsel inceleme yoluyla, kanal iç kısmına doğru yönelmiş küçük bir yan zincire sahip olan ve en üst sırada yer alan tünelleri çevreleyen amino asitleri belirleyin. Swap residue komutunu kullanarak, artan sterik engelleme nedeniyle tüneli tıkayacak tekli amino asit substitüyonlarını belirleyin. Tünelin tıkalı olduğunu önce görsel inceleme ile, ardından şimdiye kadar uygulanan protokolü tekrarlayarak doğrulayın.Burada, eklenen triptofan macenta renginde, yer değiştirilen serin ise karşılaştırma amacıyla gösterilmiştir. Metin protokolünde listelendiği şekilde potasyum-fosfat, resüspansiyon tamponu, deterjan tamponu ve reaksiyon tamponu hazırlayın. Squalene-hopene siklazlar veya daha düşük pH optimumuna sahip diğer membrana bağlı enzimler için sitrat içeren bir resüspansiyon tamponu kullanın.Cam bir beher içerisinde dondurulmuş bir hücre peletini tartın. Hücreleri, bir homogenizatör kullanarak resüspansiyon tamponu içinde 0,3 gram-hücre/mililitre nihai konsantrasyona kadar yeniden süspande edin. Ardından, yeniden süspande edilen hücreleri %80 genlikle, bir saniye açık ve bir saniye kapalı olacak şekilde ultrasonikasyon ile lize edin.Her biri 50 saniyeden oluşan üç tekrarlı döngü kullanın. Deterjan tamponunu 0.2% deterjan nihai konsantrasyonuna ulaşacak şekilde ekleyin. Dört derece santigrat sıcaklıkta, uç uca karıştırma yöntemiyle bir saat boyunca dengeye getirin.39.000 gs'de, dört santigrat derecede, 50 dakika boyunca tek bir santrifüjasyon adımının ardından süpernatantı kaydederek membran protein fraksiyonunu geri kazanın. Reaksiyon tamponu içerisinde substratın taze, beş milimolar stok çözeltisini hazırlayın. %30 genlikte iki ila beş dakika ultrasonikasyon yaparak homojen bir emülsiyon elde edin.Ardından, bir ThermoMixer'ı istenen reaksiyon sıcaklığında dengeleyin. Su içeren bir cam şişe içerisindeki sıcaklığı harici bir termometre ile doğrulayın. Tekil substrat kinetiği için, emülsifiye edilmiş substratı, aynı nihai substrat konsantrasyonuna ulaşacak şekilde en az beş cam şişeye dağıtarak seyreltin.Cam şişeleri ThermoMixer'da 10 dakika boyunca ön inkübasyona tabi tutun. Enzimi ekleyerek reaksiyonu başlatın. Toplam bir mililitrelik reaksiyon hacmi uygundur.En az 1200 RPM çalkalama hızı kullanın. Reaksiyonları, entegrasyon standardı olarak 100 µM decanol eklenmiş 500 µL etil asetat ilave ederek farklı zaman noktalarında durdurun. Reaksiyon karışımlarını, vorteksleyerek ve cam şişeleri bir dakika boyunca manuel olarak şiddetle çalkalayarak ekstrakte edin.Ardından, cam şişeleri bir masaüstü santrifüjde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 9.600 gs'de santrifüjleyin. Üst katmanı boş bir tüpe aktarın. Reaksiyon tüplerine ek olarak 500 microliter ekstraksiyon çözücüsü ekleyin ve ekstraksiyon prosedürünü tekrarlayın.Ekstrakt edilen reaksiyon karışımlarını sodyum sülfat ile kurutun. Beş saniye boyunca vorteksleyin ve tüpleri 10 dakika boyunca bekletin. Masaüstü santrifüj kullanarak, oda sıcaklığında bir dakika boyunca 9.600 gs'de son bir santrifügasyon adımı gerçekleştirin.Ardından, ekstrakte edilen örnekleri gaz kromatografisi (GC) viallerine aktarın. Prosedürü, ilgilenilen her bir enzim varyantı için tekrarlayın; tekli substrat kinetiği için substratın en az dört farklı başlangıç konsantrasyonunu ve hem tekli substrat hem de kompetitif kinetik için dört farklı sıcaklığı kullanın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde GC analizini gerçekleştirdikten sonra, ürünlerin pik alanlarını entegre edin ve entegrasyon standardının alanını kullanarak ürün pik alanlarını karşılık gelen ürün konsantrasyonlarına dönüştürün.Her bir ürünün konsantrasyonunu reaksiyon süresine karşı grafiğe geçirin. %10'dan daha düşük dönüşüme karşılık gelen veri noktalarının doğrusal regresyonunu gerçekleştirin. Başlangıç reaksiyon hızı, uydurulan doğrunun eğimi ile belirlenir.Çoklu substratlar içeren tek kaplı (one-pot) relatif kinetik çalışmaları için, siklizasyon reaksiyonunu zaman içinde takip ederek, metin protokolünde listelenen denklemi kullanarak relatif görünür K-cat/Km değerlerini elde edin. Çözücü yeniden düzenlenmesinin görünür K-cat/Km değerlerinin sıcaklık bağımlılığı üzerindeki etkisi gösterilmiştir. Burada, tek substratlı kinetik için geçiş hali teorisi kullanılarak yapılan termodinamik analizlerin temsili sonuçları ve deneysel verilerin geçiş hali teorisi denklemine doğrusal uyumu yer almaktadır.Çözücü dinamiğinin, deneysel termodinamik analizden elde edilen aktivasyonun termodinamik parametreleri üzerindeki etkisi oldukça önemlidir. Burada gösterildiği üzere, su kanalları bozulmuş enzim varyantları, bağıl aktivasyon entropileri ve entalpilerindeki karmaşık değişikliklerden kaynaklanan temel olarak farklı substrat spesifiteleri sergiler. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyokataliz alanındaki araştırmacıların, halihazırda yeterince anlaşılamamış olan suyun enzim dinamiği ve katalizindeki rolünü keşfetmelerine yol açmıştır.

unraveling-entropic-rate-acceleration-induced-solvent-dynamics

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu video makalede, triptofan floresan membran protein katlanması Gibbs serbest enerji elde etmek için deneysel prosedür.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Sedimantasyon dengesi (SE), fizyolojik bir ortamda protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Bu el yazması, insan sinsityal solunum virüsü (hRSV) tarafından kodlanan küçük hidrofobik (SH) protein tarafından oluşturulan bir homo-pentamerin stabilitesi üzerindeki pH'ın etkisini belirlemek için bu tekniğin kullanımını açıklamaktadır.

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Burada hedef lipid bilayers postfusion bilayer içine bu membran proteinlerinin deterjan ücretsiz teslim etmek için ile ultrafast protokollerinden membran proteinlerinin fusogenic proteoliposomes içine sulandırma ve böyle proteoliposomes füzyonu için mevcut. Bu yaklaşımlardan birleşimini karmaşık çok bileşenli Membran sistemleri hızlı ve kolayca kontrollü montaj sağlar.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Burada, proton translocation moleküler mekanizması tek lipozomlar, lipid membranlar üzerinde çalışmak için bir protokol sitokrom bo3  örnek olarak kullanarak mevcut. Birleştirerek elektrokimya ve floresan mikroskopisi, lumen tek veziküller, tek içeren veya birden fazla enzim, pH değişiklikler algıladı ve ayrı ayrı analiz.

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Bu protokol, insan sağlığında önemli bir role sahip olan iki model proteinin yapısını ve dinamiklerini araştırmak için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknik, protein etki alanları arası hareketlerle ilgili zaman ve uzunluk ölçeklerindeki dinamiklere erişmek için tezgah üstü biyofiziksel karakterizasyonu nötron spin eko spektroskopisi ile birleştirir.

Nötron Spin Yankı Spektroskopisi ile Protein Dinamiğinin İncelenmesi

Bu makalede lipid membranlarının nötron spin eko (NSE) çalışmalarında örnek hazırlama, veri azaltma ve veri analizi protokolleri açıklanmaktadır. Lipitlerin judicious döteryum etiketlemesi, üzerinde hayati biyolojik süreçlerin meydana geldiği mezoskopik uzunluk ve zaman ölçeklerinde farklı membran dinamiklerine erişim sağlar.

Lipid Membran Dinamiği ve Membran-Protein Etkileşimleri için Benzersiz Bir Prob Olarak Nötron Spin Eko Spektroskopisi

Nötron geri saçılma spektroskopisi, proteinlerin ps-ns dinamiklerine ve hidrasyon suyuna tahribatsız ve etiketsiz bir erişim sunar. İş akışı, amiloid proteinleri üzerine iki çalışma ile sunulmaktadır: agregasyon sırasında lizozimin zamanla çözülmüş dinamikleri ve tau'nun lif oluşumu üzerine hidrasyon suyu dinamikleri üzerine.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Yapı ve bileşimdeki membran lipid çeşitliliği, hücresel süreçlere önemli bir katkıda bulunur ve bir hastalık belirteci olabilir. Moleküler dinamik simülasyonları, membranları ve bunların biyomoleküllerle etkileşimlerini atomistik çözünürlükte incelememizi sağlar. Burada, karmaşık membran sistemlerini oluşturmak, çalıştırmak ve analiz etmek için bir protokol sağlıyoruz.

Simülasyon Çalışmalarında Kompleks Lipid Karışımları Kullanılarak Gerçekçi Membran Modellemesi

Keşfedin enzim katalizinde çözücü dinamiklerinin etkisini moleküler dinamik simülasyonları ve CAVER 3.0 kullanarak. Bu yöntem su taşıma kanallarının mühendisliği ve biyokataliz mekanizmalarının anlaşılması için kritik öneme sahiptir.

Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme

Daha fazla video keşfet