Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu prosedürün genel amacı, saç kaynaklı keratinositler kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler üretmektir. Bu, önce bir donörden alınan kılların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, keratinosit büyümesini kolaylaştırmak için kılları kapatmaktır.

Daha sonra, keratinositler in vitro olarak korunur ve genişletilir. Son adım, keratinositleri epizomal bir yeniden programlama yöntemi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere yeniden programlamaktır. Sonuç olarak, insan IPS hücreleri, pluripotent belirteçlerin ekspresyonunu göstermek için immünohistokimya kullanılarak izole edilebilir ve karakterize edilebilir.

Bu yöntemin retroviral veya lentiviral yöntem gibi mevcut yöntemlere göre genel avantajı, epizomal faktör kullanarak istenmeyen transgenlerden kaçınmamızdır. Üretilen kök hücrelerdeki genoma entegrasyon, bir şişe hücre dışı matris çözeltisinin gece boyunca buz üzerinde çözülmesiyle başlar. Ertesi sabah, 12 mililitre soğutulmuş DM F 12 ortamına 200 mikrolitre solüsyon eklemek için önceden soğutulmuş pipet uçları kullanın.

12'lik bir kuyucuğun her birine bir mililitre seyreltilmiş hücre dışı matris çözeltisi ekleyin. Kuyucukları matrisle kaplamak için plakayı kuyu tabağı ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, parmaklarınızı saç köküne yakın bir yere yerleştirerek ve saçı hızlı ve pürüzsüz bir hareketle kopararak donörün kafasından birincil insan saçını toplayın.

Toplanan her saçın sağlam bir saç folikülü içerdiğini doğrulamak için kontrol edin. Folikülü diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve her saçın büyüme aşamasını belirleyin. Keratinli buzu çıkarmak için her bireyden beş ila 10 antijen kılı toplayın.

Antijen fazı, T fazından farklı olarak, çok sayıda epitel tabakası içerir. Saç örneklerini beş dakika boyunca 10 mililitre antibiyotik karışımı içeren bir Petri kabına yerleştirin ve ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS'de yıkayın. Daha sonra, saçı steril forseps ile kavrayın ve fazla saç telini kesmek için bir çift steril makas kullanın, sağlam bir saç folikülü ve yaklaşık 0,5 ila bir santimetre saç şaftı olan bir saç parçası bırakın.

Hücre dışı matris kaplı plakanın her bir oyuğuna bir saç parçasını dikkatlice aktarın. Steril forseps kullanarak yaklaşık 100 ila 200 mikrolitre serum replasmanı yapıyorum. Saç örnekleri içeren her oyuğa orta damla damla.

Daha sonra plakayı inkübatöre yerleştirin ve foliküllerin gece boyunca 37 santigrat derecede ve ertesi gün% 5 karbondioksitte bağlanmasına izin verin. Saç örneklerini nemli tutmak için yavaşça 100 ila 200 mikrolitre serum replasmanı ekleyin. Saç foliküllerinin plakaya başarılı bir şekilde yapıştığını doğrulamak için saç örneklerini günlük olarak kontrol edin.

Takıldıktan sonra, kuyuya nazikçe 500 mikrolitre daha orta ekleyin. Medyayı iki günde bir değiştirin. Kollajenli altı duvar plakasını preco.

Kitten her bir oyuğa 680 mikrolitre seyreltme ortamında bir kaplama matrisi kiti gibi bir ön işlem kullanarak birini yazın ve ardından 6.8 mikrolitre kaplama matrisi çözeltisi ekleyin. Düzgün bir kaplama sağlamak için plakayı hafifçe sallayın. Keratinositleri kaplamadan önce kaplanmış plakanın oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmesine izin verin.

Kaplama çözeltisini çıkarın, kültürdeki keratinositleri oyuk başına 500 mikrolitre% 0.25 tripsin ekleyerek tek hücreli bir süspansiyona ayırın ve plakaları 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin. Hücreler plakadan ayrıldıktan sonra, tripsini 500 mikrolitre serum içeren ortamla etkisiz hale getirin ve hücreleri steril 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Sterilize edilmiş forseps kullanarak saç parçasını çıkarın, hücreleri peletleyin ve ardından yeniden canlandırın.

Bunları, keratinosit ortamının varlığında kollajen kaplı plakanın bir oyuğuna 40.000 keratinosit taze keratinosit büyüme ortamı plakasında askıya alın. Ortamı her gün değiştirin ve kültür yaklaşık% 80 birleştiğinde hücrelerden geçirin, her birine iki mililitre% 0.1 jelatin çözeltisi ekleyerek jelatinli altı duvar plakasını kodlayın, jelatinin oda sıcaklığında en az 20 dakika kaplanmasına izin verin. Bu arada, altı veya daha düşük pasajlı keratinositleri, oyuk başına bir mililitre% 0.25 tryin ekleyerek ve hücreleri iki ila beş dakika inkübe ederek tek bir hücre süspansiyonuna ayırın.

37 santigrat derecede, tripsini serum içeren bir mililitre ortamla etkisiz hale getirin ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Hücreleri pelet haline getirin ve keratinosit ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra jelatinleştirilmiş altı oyuklu bir plakada oyuk başına 100.000 ila 150.000 keratinosit plakalayın ve ertesi gün, sıfırıncı gün gece boyunca inkübe edin, hücrelerin% 50 ila 60 oranında birleştiğinden emin olmak için plakayı kontrol edin.

Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi sekiz mikrolitre transfeksiyon reaktifinin iki mikrogram toplam plazma DNA'sına oranını kullanarak keratinositler üzerinde epizomal yeniden programlama vektörlerinin bir transfeksiyonunu gerçekleştirin. Ertesi gün, birinci gün, keratinosit ortamını değiştirin ve floresan mikroskobu altında yeşil floresan protein pozitif hücrelerin yüzdesini tahmin ederek transfeksiyon verimliliğini kontrol edin. İkinci günde% 60 ila 70'lik bir transfeksiyon verimliliği bekleniyor.

Transfeksiyon verimliliğini %90'ın üzerine çıkarmak için transfeksiyonu tekrarlayınArdından, en az 20 dakika boyunca beş mililitre %0,1 jelatin içeren 10 santimetrelik bir tabağı önceden kodlayın. Conrad Al'da tarif edildiği gibi FBS ortamında 10 santimetre çanak başına 4 milyon mitotik olarak inaktive edilmiş besleyici hücreyi yerleştirin ve hücrelerin üçüncü günde% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde gece boyunca yerleşmesine ve bağlanmasına izin verin. Transfekte edilmiş keratinositleri daha önce gösterildiği gibi hasat edin ve bunları KSR orta plakasında yeniden süspanse edin.

Keratinositlerin %90'ını bir kuyucuktan alıp 10 santimetrelik bir çanağa besleyici hücreler ile kaplar ve üzerlerini KSR ile kaplar. Orta: İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kolonilerini 21. günden itibaren manuel diseksiyonla izole edin. Birbirine yakın kümelenmiş kolonilerden kaçının ve yalnızca diğerlerinden açıkça ayrılmış kolonileri seçin.

Manuel diseksiyon için, kolonileri diseksiyon mikroskobu altında yaklaşık 300 ila 600 mikrometre uzunluğunda küçük parçalar halinde kesmek için 26 gauge bir iğne kullanın. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin klonal bir hattını oluşturmak için parçaları bir koloniden yeni bir MEF besleme plakasına aktarın. Kültür, çapı yaklaşık 1,5 milimetre olan insan kaynaklı pluripotent kök hücre kolonileri ile %70 ila 80 oranında homojenliğe ulaştığında, hücreler Accutane, sase veya kollajenaz gibi standart enzimatik paketleme yöntemlerini kullanır.

Dört, üreticinin talimatına göre. Bu protokolü takip ederken, saç dökülmesinden üç gün sonra geri çekilme büyümeleri gözlemlenebilir ve çoğalmaya devam edecektir. Burada gösterilen keratinositler yeni bir plakaya geçirildi ve bu hücreler birden fazla geçiş için korunabilir.

Bu görüntü, tipik bir keratinosit kaynaklı insan kaynaklı pluripotent kök hücre kolonisini göstermektedir. 32 günlük yeniden programlamadan sonra, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kolonisinin merkezinde bir miktar farklılaşma meydana gelebilir. Manuel olarak seçildikten sonra, türetilmiş hücreler tipik olarak yüksek çekirdek-sitoplazmik oran ve tanımlanmış bir koloni sınırı gösterir.

Ayrıca OCT dört nag ve TRA bir 60 gibi bir dizi pluripotent belirteç ifade ederler. Bu videoyu izledikten sonra, saçtan keratinositin nasıl çıkarılacağını ve insan kaynaklı sözde kök hücrelere nasıl yeniden programlanacağını iyi anlamış olmalısınız.