Name: Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Keşfedin saç kökünden elde edilen keratinositleri kullanarak entegrasyonsuz insan uyarılmış pluripotent kök hücre üretimini. Epizomal vektörlerle genomik entegrasyon riski olmadan hücre yeniden programlama yöntemini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik destek için Harene Ranjithakumaran ve Stacey Jackson'a teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (R.C.B. Wong, A. Pébay), Melbourne Üniversitesi (R.C.B. Wong), Retina Avustralya (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) ve Avustralya Oftalmik Araştırma Enstitüsü (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Vakfı Bursu (RCB Wong); Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) okul içi finansman ve Victoria Hükümeti'nden operasyonel altyapı desteği.

bireylerin insan saçı örnek toplama konak kurumlarında insan araştırma etik komitesi tarafından etik onayı gerektirir ve kurumsal kurallarına uygun yapılmalıdır. Mızraplı Saç gelen Keratinositler 1. İzolasyonu <ol><li> Buz O / N (yani, Matrigel) çözülme Ekstrasellüler Matriks (ECM) çözümü. </li><li> Önceden soğutulmuş pipet uçları kullanılarak, soğutulmuş DMEM / F12 ortamında 12 ml 200 ul ECM çözeltisi ilave edilir. Kat her bir seyreltilmiş ECM çözeltisi, 1 ml ile 12 oyuklu plaka. 37 ° C &#39;de, kaplanmış plak O / N inkübe edin. Kullanmadan önce, önceden ısıtılmış DMEM / F12 ortamı ile kaplanmış plaka yıkanır. </li><li> Saç köküne yakın parmakları yerleştirerek ve bir hızlı ve pürüzsüz hareket saç yolma ile bireyin kafasından birincil insan saçı toplamak. Her toplanan saç bozulmamış bir saç folikülü içerdiğini teyit ve saç un büyüme fazını belirlemek için kontrol edinbir mikroskop (Şekil 1) der. <ol><li> Keratinositler ayıklamak için her bireyin 5-10 anagen tüyleri toplayın. Süreç keratinositlerinin başarılı türetme sağlamak için en kısa sürede tüyleri koparıp. Not: Şekil 1 büyüme döngüsünün farklı aşamalarında kılların morfolojisi göstermektedir. Anajen saç ORS olarak bilinen saç uzunluğunu çevreleyen epitel görünür bir dış tabaka ile, bir büyüme aşamasında. Öte yandan, telojen saç dinlenme aşamasında saç temsil eder ve görünür bir ORS sahip değildir, ancak telojen çıkıntı olarak bilinen saç kökü kapsayan hücrelerin net bir top yer alır. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yıkama antibiyotik karışımı 10 ml ihtiva eden bir petri çanağı içine numuneler saç. </li><li> Saç şaftının 1 cm - sterilize makas ve forseps kullanarak, sağlam bir saç folikülü ve yaklaşık 0.5 olan bir saç parçası bırakarak, aşırı saç şaft kesti. </li><li> Dikkatle traforseps kullanılarak ECM kaplı plakanın her oyuğuna nsfer 1 saç parçası. </li><li> Saç örnekleri göre - (200 ul ~ 100) bir 1 ml&#39;lik bir pipet kullanarak, nakavt Serum Replacement (KSR) ortam, yaklaşık 3 damla ekleyin. Not: eki ve sonraki keratinosit akıbet için izin vermek için plaka yüzeyine yakın temas içinde saç parçaları tutun. Bu aşamada aşırı medya ekleyerek olabilir saç parçaları float neden olur ve başarılı bir saç eki olasılığını azaltır. </li><li> % 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör saç örnekleri inkübe ve saç köklerinin / N O takmak için izin verir. Nemli saç örneği tutmak için - (200 ul ~ 100) Ertesi gün, yavaşça KSR ortamının başka bir 3 damla ekleyin. </li><li> Saç folikülleri başarıyla eklenmiş onaylamak için günlük saç örnekleri dikkate alın. Genellikle saç köklerinin eki 1-3 gün içinde görülür. Ince tüyleri yüksek olması gibi kalın kıllar, ince kıllar ile karşılaştırıldığında takmak için genellikle daha kolayeğilim eki sürecini engelleyen hangi float. <ol><li> Saç kaplı plaka takılı sonra, kuyuya KSR orta 500 ul ekleyin. Saç örnekleri sıkıca bağlı olmayabilir olarak orta eklerken ekstra özen gösterin. Bu noktadan itibaren, her 2 gün medya değiştirin. Not: Keratinosit çıkıntılar 3-7 gün (Şekil 2A-B) sonra saç fragmanı ORS bölgesinden görünür olmalıdır. Keratinositler sonraki bölümde açıklandığı gibi hücrelerin Pasajlanması 14 gün öncesine kadar büyümeye izin verin. </li></ol></li></ol> 2. Bakım ve Keratinositler arasında Pasajlanması <ol><li> Ön kaplama kaplama maddesi Kit kullanılarak, 6-çukurlu plaka. Kaplama matris solüsyon içerisinde 6.8 ul ve ardından her oyuğa kit, seyreltme ortamı 680 ul ekle. Plaka üzerinde kaplama maddesi solüsyonu homojen dağılımını sağlamak için plakayı sallayın. </li><li> Kaplanmış levha oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyona izin verin. KaldırKeratinositlerin kaplama öncesinde kaplama maddesi solüsyonu. </li><li> 37 ° C&#39;de 2-5 dakika boyunca oyuk başına% 0.25 tripsin 500 ul olan tek bir hücre süspansiyonu içine keratinositler ayrıştırmaları. Serum ihtiva eden kültür (örneğin, fetal sığır serumu (FBS) ortamı) 500 ul tripsin inaktive ve steril bir 15 ml tüp içine toplar. Sterilize forseps kullanarak saç fragmanı çıkarın. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak hasat hücrelerinin sayısını belirler. </li><li> X g 200&#39;de 3 dakika boyunca hücreleri Santrifüj. PBS ve tekrar santrifüj hücreleri yıkayın. PBS aspire ve taze keratinosit ortamında hücre pelletini. </li><li> Keratinosit ortamın mevcudiyetinde ECM kaplı plakanın bir kuyuya plaka aşağı 4 x 10 4 keratinositler. % 5 CO2 (Şekil 2C) ile 37 ° C inkübatör keratinositler tutun. Kültür olduğunda ~ Ortam% 80 konfluent her gün ve geçiş hücreleri değiştirmek, WHIch keratinositlerinin geçiş numarası ve çoğalma hızına bağlı olarak yaklaşık 2-7 gün sürebilir. türetilmiş keratinositler standart yavaş dondurma dondurma yöntemleri kullanılarak 16 yeterli dondurulmuş stokları oluşturmak için yaygınlaştırılmalıdır. Not: Tarif edilen kültür koşulları tipik arnavut kaldırımı morfolojisi (Şekil 2C) ile keratinosit homojen popülasyonunun büyümesini desteklemektedir. Bazen, birkaç farklı, büyük ve düz morfolojisi keratinositler ve replikatif potansiyeli kaybetmiş, kültür görülebilir. Keratinositlerin karakterizasyonu sitokeratin 14 karşı antikorlar kullanılarak imüno-boyama ile gerçekleştirilebilir, daha önce tarif edilen 17. Kurulan keratinosit hücre çizgileri aynı zamanda, ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak 1-3 geçişten sonra mikoplazma için test edilmelidir. </li></ol> Epizomal vektörlerin kullanılması keratinositlerinden hiPSCs 3. Nesil <ol><li> 6-çukurlu plaka ile ön-kaplama% 0.1 jelatin (2 ml / oyuk). Oda sıcaklığında en az 20 dakika süreyle kaplamak için jelatin izin verir. </li><li> Yeniden programlama deneme için, kullanımı keratinositler geç geçiş 6&#39;dan ayrışır, 37 ° C&#39;de 2-5 dakika boyunca oyuk başına% 0.25 tripsin, 1 ml ile tek bir hücre süspansiyonu içine keratinositler. Ortam serum içeren (ör: FBS ortamı) 1 ml tripsin inaktive ve 15 ml bir tüp içinde toplayın. </li><li> Keratinosit ortamı içinde 200 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri 3 dakika boyunca santrifüj hücreleri. Bir jelatinleştirilmiş plaka O / N kuyu başına Levha 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 keratinositler. </li><li> Ertesi gün (Gün 0) günü, hücreler% 50-60 konfluent olduğundan emin olmak için plakayı kontrol edin. Not: keratinositler ~% 50 konfluent onlar iyi transfeksiyondan sonra büyümek olmayabilir daha az ise. </li><li> Gün 0 günü, 2 ug plasmid DNA, toplam 8 ul transfeksiyon reaktifi bir oran kullanılarak, keratinositler üzerinde epizomal yeniden programlama vektörlerinin transfeksiyonu gerçekleştirin.<ol><li> 4, plazmidler (pCXLE EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-hul) her biri için 0.5 ug al ve düşük serum ortamında (örneğin, OPTI-MEM) 100 ul seyreltin. Not: Plazmid pCXLE EGFP keratinositlerde transfeksiyon verimliliği izlenmesi için kullanılan ve başarılı bir yeniden programlama için gerekli değildir. </li><li> Seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktifi 8 ul ekleyin. Tüp hafifçe vurarak karıştırın. DNA, Reaksiyon karışımı 15 dakika boyunca oda sıcaklığında rahatsız dinlenmeye bırakın. </li><li> Taze ortam ile keratinosit orta değiştirin. </li><li> Yavaşça 4 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör keratinosit kültürü DNA Reaksiyon karışımı ekleyin ve inkübe edilir. Not: bunlar düşük hayatta kalma sonrası transfeksiyon sergileyen olarak keratinositler uzun süreli transfeksiyon O / N gerçekleştirmek için tavsiye edilmez. </li><li> 4 saat sonra, transfeksiyondan sonra, taze ortam ile keratinosit orta yerine. </li></ol></li><li> Gün 1 (1 gün sonrası transFection), keratinosit orta değiştirmek ve bir floresan mikroskop altında EGFP pozitif hücrelerin yüzdesi tahmin edilerek transfeksiyon etkinliğini kontrol edin. Tipik haliyle&gt;% 60-70 transfeksiyon verimi, bu protokol kullanılarak primer keratinositler gözlenmektedir. </li><li> Aşama 3,5 anlatıldığı gibi 2. Gün, transfeksiyon tekrarlayın. İki ardışık transfeksiyonlar genellikle&gt;% 90 transfeksiyon verim elde ederim. Keratinosit kültürü genellikle ikinci transfeksiyon sonunda izdiham ulaşır. <ol><li> Her yeniden programlama reaksiyon için fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici bir 10 cm çanak hazırlayın. Daha önce tarif edildiği gibi 18 mitotik inaktive MEF besleyiciler hazırlayın. </li><li> Ön kaplama, en az 20 dakika süreyle,% 0.1 jelatin, 5 ml ile 10 cm tabak. FBS ortamında 10 cm çanak başına Plaka 4 × 10 6 mitotik inaktif MEF. Hücreler yerleşmek ve% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör O / N takmak için izin verin. </li></ol></li><li> Gün 3 günü, haradım 3.2 ve 3.3 açıklandığı gibi% 0.25 tripsin ile keratinositler yelek. KSR ortamı içinde yeniden süspanse edin ve keratinositleri KSR ortamı ile, 10 cm MEF besleyici çanak içine bir 6-yuvalı plaka 1 kuyusundan keratinosit% 90 plaka. </li><li> Itibaren Day 4, her gün KSR orta değiştirin. <ol><li> Alternatif Gün 18 sonra, her ikinci gün kültür ortamı değiştirin. Not: İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) benzeyen tanımlanan sınır ile hiPSC koloniler Gün 14 çıkacak iken Sigara yeniden programlanan keratinositler, çoğalmaya sona erecek - 21. </li></ol></li><li> Itibaren Gün 21 manuel diseksiyon ile hiPSC koloniler izole edin. Yakından birlikte kümelenmiş ve yalnızca açıkça diğerlerinden ayrılır hiPSC koloniler almak vardır hiPSC koloniler kaçının. Not: hiPSC koloniler önce alınabilir, ancak belirlenen sınırları koloni küçük koloni büyüklüğü göz önüne alındığında erken zaman noktalarında belirgin olmayabilir. Yeniden programlama verimliliği fark arasında değişebilirFarklı hasta en keratinositler, ve aynı zamanda geçiş sayısı veya keratinosit proliferasyon hızı gibi diğer faktörler tarafından etkilenir. <ol><li> HiPSC kolonilerinin manuel diseksiyon için, bir mikroskop altında hiPSC kolonileri kesmek için bir 26G iğne kullanın. Uzunluğunda 600 um - 300 civarında küçük parçalar halinde bir hiPSC koloni kesin. HiPSCs klonal çizgi oluşturmak için yeni bir MEF besleyici plakası (2.5 × 10 4 MEF / cm 2) içine bir hiPSC kolonisinden parçaları aktarın. Başlangıçta, kültür 12 kuyu plakası veya organ kültürü yemekleri tek kuyuda her hiPSC klonal çizgi, daha sonra 6 kuyu plaka formatına genişletin. </li><li> MEF besleyiciler üzerinde KSR ortamda hiPSCs kurulan klonal hatları korumak. Kültür kez 70 ulaşır - hiPSC kolonileri ile% 80 confluency ~ çapı 1,5 mm, üreticinin talimatlarına göre standart enzimatik Pasajlanması yöntemleri (Accutase, Dispase veya kollajenaz IV) kullanarak geçiş hiPSCs. </li></ol></li><li> Kurulan hiPSC hattını karakterizes pluripotensini ve in vitro ve / veya in vivo 13,19 üç germ hücreleri temsil ayırt etme yeteneğini doğrulamak için. Ayrıca, piyasada mevcut kitler kullanılarak mikoplazma için rutin kurulan test hiPSC çizgiler patojen içermez sağlamak. Rutin karyotipleme ya da dizi tabanlı kopya sayısı varyasyonu (KNV) analizi ile hiPSC hatlarının genomik istikrarı izlemek. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, U141-U141 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from urine.</a> J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Lineage-Specific+Differentiation+Protocols.Springer+Protocols+Handbooks%22">Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks</a>. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li>
<li>Limat, A., Noser, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+single+keratinocytes+from+the+outer+root+sheath+of+human+scalp+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).</li>
<li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).</li>
<li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+hair+follicle+dermal+papilla+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells.</a> J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).</li>
<li>Muchkaeva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Hair+Follice+Dermal+Papilla+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+naturae%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells.</a> Acta naturae. 6, 45-53 (2014).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen. , (2013).</li>
<li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+membrane+cholesterol+reveals+new+insights+into+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).</li>
<li>Conner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22(2001).</li>
<li>Pebay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+sphingosine-1-phosphate+and+platelet-derived+growth+factor+in+the+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).</li>
<li>Myung, P., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bulge+in+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bulge in hair regeneration.</a> J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hair+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives%3A+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).</li>
<li>McKernan, R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+point+of+large-scale+collections+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).</li>
<li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, U1145-U1112 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+rate+of+somatic+cells+affects+reprogramming+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency.</a> J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+passage+human+fibroblasts+induced+to+pluripotency+are+capable+of+directed+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation.</a> Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).</li>
<li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li>
<li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Hastaya özgü hiPSCs üretilmesi, in vitro olarak hastalıklı hücre tiplerinde patojenezinin araştırılması için eşsiz bir yaklaşım sunmaktadır ve ayrıca hastalığın fenotipleri kurtarabilir yeni moleküllerin belirlenmesi için ilaç tarama için bir platform sağlar. HiPSCs kullanılarak bu hastalığa modelleme yaklaşımı uzun QT sendromu, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı ve amiyotrofik lateral skleroz 22 de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların, umut vaat eden sonuçlar vermiştir. Çeşitli girişimler ...

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) keşif hastaya özgü kök hücrelerin 1-3 üretimi için uygun bir yöntem sağlayan, rejeneratif tıp alanında devrim yarattı. hiPSCs başarılı fibroblastlar 4,5, hematopoietik hücrelerin 6,7, idrar 8 böbrek epitel hücreleri ve 9,10 keratinositler dahil olmak üzere çeşitli somatik hücre tiplerinin, elde edilmiştir. Bugüne kadar, deri fibroblastları ve hematopoietik hücreler hastaya özgü iPSCs üretilmesi için en yaygın olarak kullanılan hücre kaynağıdır. Muhtemelen, bu deri biyopsileri ve kan toplama rutin tıbbi prosedürler ve birçok ülkede kurulmuştur hastanın kan veya cilt örneklerinin büyük biyobankalar olmasından kaynaklanmaktadır. Kan hücreleri ve invazif çıkarma yöntemleri gerektiren deri fibroblast aksine, keratinositler hiPSC üretimi için kolay erişilebilir bir hücre tipini temsil etmektedir. Keratinocytes cildin dış epidermal bariyer oluşturur ve ayrıca çivi ve saç 11&#39;de bulunan keratin bakımından zengin epitel hücreleri vardır. Özellikle, keratinositler saç köklerinin, iç kök kılıfı (IRS) hücreleri (12, Şekil 1) ile birlikte saç gövdesine kaplı bir dış hücresel tabakanın dış kök kılıfı (ORS) bulunabilir. Saç toplama sağlık personelinin yardım gerektirmeyen, basit bir prosedür olduğu gibi hastaların toplamak ve büyük ölçüde hiPSC nesil için hasta örneklerinin koleksiyonu kolaylaştıracak laboratuvarlar, kendi saç örneklerini göndermek için, bir fırsat sağlar. Epidermal keratinositler, aynı zamanda hiPSC üretimi 9,13 başlangıç ​​hücreleri gibi keratinositleri kullanmanın avantajları ekleyerek, fibroblastlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir yeniden programlama verimliliği ve daha hızlı bir yeniden programlama kinetiği sahiptir. Ayrıca, hiPSCs da saç folikülü içinde diğer hücre popülasyonları kullanılarak üretilebilir,saç folikülü 14,15 tabanında bulunan dermal papilla hücrelerini dahildir. Saç türetilmiş hücreleri kullanarak iPSC nesil Önceki raporlar genellikle retroviral veya lentiviral tabanlı yeniden programlama yöntemlerini 9,14,15 kullanmaktadır. Ancak, bu viral yöntemler yeniden programlama sırasında yabancı transgenlerin istenmeyen genomik entegrasyon tanıtmak. Karşılaştırma olarak, epizomal vektörlerin kullanımı entegrasyonu içermeyen iPSCs 4 oluşturmak için uygun bir non-viral yeniden programlama yöntemi temsil eder. Biz daha önce verimli epizomal vektörler 13 kullanan hiPSCs içine keratinosit yeniden programlamak için basit, düşük maliyetli ve viral olmayan bir yöntem geliştirdik. Burada koparıp saç büyüme ve keratinositler bakım ve hiPSCs oluşturmak için daha sonra yeniden programlama ile ilgili keratinosit türetilmesi dahil olmak üzere, keratinosit türetilmiş hiPSCs, üretimi için ayrıntılı bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Antibiyotik Karışımı:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ng/ml Antimikotik amfoterisin B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ml</td><td>Antibiyotik karışımı PBS'de oluşturulur.</td></tr><tr><td>1X Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td> <td>İnvitrojen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Replasmanı (KSR) orta:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>KSR ortamı, kullanılmadan önce Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) kullanılarak filtrelenir. bFGF, kullanılmadan önce ortama taze olarak eklenir.</td></tr><tr><td>% 20 nakavt serum replasmanı (KSR)</td> <td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12, glutamax ile</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1 & kez; MEM esansiyel olmayan amino asit</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0.5 kez; Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0.1 mM &beta;-merkaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; bFGF (10 ng/ml, taze eklenmiş)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit ortamı:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 60&nbsp ile EpiLife; &mikro; M Kalsiyum</td><td>İnvitrojen</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1 & kez; İnsan keratinosit büyüme takviyesi (HKGS)</td><td>İnvitrojen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS) orta:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>FBS besiyeri, kullanılmadan önce Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) kullanılarak filtrelenir.</td></tr><tr><td>% 10 fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>İnvitrojen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0.5x Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamin</td><td>İnvitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 tripsin-EDTA</td><td>İnvitrojen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Dışı Matriks (ECM):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354234</td><td>Aliquot Matrigel stoğu ve mağazası -80 derece; Üreticinin ardından C s talimatları. Matrigel'in stok konsantrasyonu partiden partiye biraz değişir (~ 9mg / ml). 200 & micro kullanmanızı öneririz; l 12 oyuklu bir plakayı kaplamak için matrigel (~ 150 & mikro; g/kuyu).&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaplama Matris Kiti&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>Plazmitleri:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>pCXLE-eGFP'nin yalnızca transfeksiyon verimliliğini izlemek için kullanıldığını ve yeniden programlama için gerekli olmadığını unutmayın.</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon reaktifi Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin (domuz derisinden)</td> <td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Damıtılmış suda %0.1 jelatin oluşturun. Kullanmadan önce otoklavlayın.&nbsp;</td></tr><tr><td>Azaltılmış Serum ortamı: OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici</td><td></td><td></td><td>MEF, daha önce tarif edildiği gibi mitomisin C tedavisi veya ışınlama ile inaktive edilebilir 16.</td></tr><tr><td>26G iğne</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka (doku kültürü ile tedavi edilir)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td> 12 oyuklu plaka (doku kültürü ile tedavi edilir)BD Biosciences 353043 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm'lik tabak (doku kültürü ile tedavi edilir)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>10 mg / ml'de</td></tr> <tr><td>kullanınKollajenaz IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>1 mg / ml</td></tr><tr><td>TRA-160 antikorunda</td> kullanın <td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>5 & mikro'da kullanın; g/ml</td></tr><tr><td>OCT4 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>5 & mikroda kullanın; g/ml</td></tr><tr><td>NANOG antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF1997</td><td>10 & mikroda kullanın; g/ml</td></tr><tr><td>MycoAlert Algılama kiti</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

saç türetilmiş keratinositlerden kullanarak entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Yeniden programlamadaki son gelişmeler, somatik hücreleri insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC'ler) dönüştürmemize izin veriyor. Hastaya özgü hiPSC'leri kullanan hastalık modellemesi, patogenez için altta yatan mekanizmanın incelenmesine olanak tanır ve ayrıca tedavi seçeneklerini iyileştirmek için in vitro ilaç taraması ve gen terapisinin geliştirilmesi için bir platform sağlar. hiPSC'lerin rejeneratif tıp için umut verici potansiyeli, son yıllarda iPSC'lerle ilgili artan yayın sayısından (>7000) da açıkça görülmektedir. Deri fibroblastları, hematopoietik hücreler ve epidermal keratinositler dahil olmak üzere hiPSC üretimi için farklı soylardan çeşitli hücre tipleri başarıyla kullanılmıştır. Deri biyopsileri ve kan alımı, hiPSC'lerin üretilmesi için somatik hücrelerin kaynağı olarak birçok laboratuvarda rutin olarak gerçekleştirilirken, saç keratinositlerinin toplanması ve ardından türetilmesi daha az yaygın olarak kullanılmaktadır. Saçtan elde edilen keratinositler, hastalardan hücre örnekleri elde etmek için invaziv olmayan bir yaklaşımı temsil eder. Burada, koparılmış saçlardan keratinositlerin türetilmesi için basit bir non-invaziv yöntemi özetliyoruz. Ayrıca, keratinositlerin bakımı ve ardından epizomal vektörler kullanarak entegrasyonsuz hiPSC oluşturmak için yeniden programlama için talimatlar sağlıyoruz.

anagen (büyüme fazı), katagen (regresyon fazı) ve telojen (dinlenme fazı) 20-21: saç 3 farklı büyüme döngüsünün evreleri geçer. anagen kıl folikülü epitel Birden çok katman içeren; Bu tabakalar ORS, IRS ve saç gövdesine (Şekil 1) içerir. Anagen kıl sonunda ORS ve saç şaft farklılaşma fesih apoptoz ile işaretlenir katajen faza, geçiş uğrar. Son olarak, apoptoz durur ve telojen folikül karakteristik telojen ile sakin olur telojen faza için katajen saç geçiş 20,21 şişer. <p class=...

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Bu prosedürün genel amacı, saç türevli keratinositler kullanarak insan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri üretmektir. Bu işlem, öncelikle bir donörden saçların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, keratinosit büyümesini kolaylaştırmak için saçların ekilmesi işlemidir.Ardından, keratinositler in vitro ortamda sürdürülür ve genişletilir. Son adım, keratinositlerin episomal bir yeniden programlama yöntemi kullanılarak insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücrelere yeniden programlanmasıdır. Sonuç olarak, insan IPS hücreleri izole edilebilir ve pluripotent belirteçlerin ekspresyonunu göstermek için immünohistokimya kullanılarak karakterize edilebilir.Bu yöntemin retroviral veya lentiviral yöntem gibi mevcut yöntemlere göre genel avantajı, episomal faktör kullanımı sayesinde, üretilen kök hücrelerin genomuna istenmeyen transgen entegrasyonundan kaçınmamızdır. Bir tüp hücre dışı matris çözeltisini buz üzerinde gece boyunca çözerek başlayın. Ertesi sabah, önceden soğutulmuş pipet uçlarını kullanarak çözeltiden 200 microliter'ı 12 mililitre soğutulmuş DMF 12 ortamına ekleyin.Seyeiltilmiş hücre dışı matris solüsyonundan bir mililitre, 12 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna ekleyin ve kuyucukları matrisle kaplamak için plakayı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, parmaklarınızı saç köküne yakın bir yere yerleştirip saçı tek, hızlı ve pürüzsüz bir hareketle çekerek donörün başından primer insan saçı toplayın.Toplanan her bir saçın sağlam bir saç folikülü içerdiğini onaylamak için kontrol edin. Folikülü bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve her bir saçın büyüme fazını belirleyin. Keratinöz buz ekstre etmek için her bireyden beş ila 10 adet antijen saçı toplayın.Antijen fazı, T fazının aksine, birden fazla epitel tabakası içerir. Kıl örneklerini 10 mililitre antibiyotik karışımı içeren bir Petri kabına beş dakika boyunca yerleştirin ve ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. Ardından, kılı steril pensle tutun ve steril bir makas kullanarak, sağlam bir kıl folikülü ve yaklaşık 0,5 ila bir santimetre uzunluğunda kıl şaftı kalacak şekilde fazla kıl şaftını kesin.Her bir saç fragmanını, hücre dışı matris ile kaplanmış plağın kuyucuklarına dikkatlice aktarın. Steril pens kullanarak, saç örnekleri içeren her bir kuyucuğa yaklaşık 100 ila 200 µL serum replasman ortamını damla damla ekleyin.Ardından plakayı inkübatöre yerleştirin ve foliküllerin 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca yapışmasını sağlayın. Ertesi gün, saç örneklerini nemli tutmak için damla damla 100 ila 200 µL daha serum ikame ortamı ekleyin. Saç foliküllerinin plakaya başarıyla yapıştığını doğrulamak için saç örneklerini günlük olarak kontrol edin.Hücreler yapıştıktan sonra, kuyucuğa nazikçe 500 µL ek besiyeri ekleyin. Besiyerini her iki günde bir değiştirin. Altı kuyucuklu plakayı kollajen ile önceden kaplayın.Kitin seyreltme ortamından her bir kuyucuğa 680 microliter ve ardından 6.8 microliter kaplama matrisi çözeltisi eklemek gibi bir ön işlem kullanarak birinci tipini uygulayın. Düzenli bir kaplama sağlamak için plakayı nazikçe sallayın. Keratinosit ekimi öncesinde, kaplanmış plakanın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilmesini sağlayın.Kaplama solüsyonunu uzaklaştırın, her kuyucuğa 500 µL %0,25 tripsin ekleyerek kültürdeki keratinositleri tek hücre süspansiyonuna ayrıştırın ve plakaları 37 °C'de iki ila beş dakika inkübe edin. Hücreler plakadan ayrıldığında, tripsini 500 µL serum içeren besiyeri ile inaktive edin ve hücreleri steril bir 15 mL tüpe toplayın. Kıl fragmanını sterilize edilmiş pens yardımıyla çıkarın, hücreleri pelitleyin ve ardından resüspende edin.Bunları taze keratinosit büyüme ortamında süspande edin; kollajen kaplı plakanın bir kuyucuğuna keratinosit ortamı varlığında 40.000 keratinosit ekleyin. Ortamı her gün değiştirin ve kültür yaklaşık %80 konfluen olduğunda hücreleri pasajlayın. Altı kuyucuklu bir plakayı, her kuyucuğa 2 mL %0,1 jelatin çözeltisi ekleyerek jelatin ile kaplayın; jelatinin oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca kaplama yapmasına izin verin. Bu sırada, her kuyucuğa 1 mL %0,25 tripsin ekleyip hücreleri iki ila beş dakika inkübe ederek, pasaj altı veya daha düşük pasajdaki keratinositleri tek hücre süspansiyonu haline getirerek ayrıştırın.37 °C'de, serum içeren bir mililitre ortam ile tripsini inaktive edin ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Hücreleri pelletleyin ve keratinosit ortamında yeniden süspande edin. Ardından, jelatinleştirilmiş altılı kuyucuk plakasının her kuyucuğuna 100.000 ila 150.000 keratinosit ekleyin ve gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, yani sıfırıncı günde, hücrelerin %50 ila %60 konfluans düzeyine ulaştığından emin olmak için plakayı kontrol edin.Ekli metin protokolünde açıklandığı üzere, toplam plazma DNA'sının her iki mikrogramı için sekiz mikrolitre transfeksiyon reaktanı oranını kullanarak keratinositler üzerinde episomal reprogramlama vektörlerinin transfeksiyonunu gerçekleştirin. Ertesi gün, yani birinci günde, keratinosit besiyerini değiştirin ve floresan mikroskobu altında yeşil floresan protein pozitif hücrelerin yüzdesini tahmin ederek transfeksiyon verimliliğini kontrol edin. İkinci günde %60 ile %70 arasında bir transfeksiyon verimliliği beklenmektedir.Transfeksiyon verimliliğini %90'ın üzerine çıkarmak için transfeksiyonu tekrarlayın. Ardından, 10 cm'lik bir petri kabını beş mililitre %0,1 jelatin ile en az 20 dakika boyunca önceden kaplayın. Conrad Al ve arkadaşları tarafından tarif edildiği şekilde, her 10 cm'lik petri kabına FBS ortamında 4 milyon mitotik olarak inaktive edilmiş feeder hücre ekin ve üçüncü günde, %5 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde hücrelerin gece boyunca çökelmesini ve yapışmasını bekleyin. Transfekte edilmiş keratinositleri daha önce gösterildiği gibi hasat edin ve KSR ortamında yeniden süspande ederek petriye ekin.Keratinositlerin %90'ını kuyucuklardan birinden, besleyici hücrelerle hazırlanmış 10 santimetrelik bir kaba aktarın ve üzerlerini KSR ile kaplayın. Besiyeri. 21. günden itibaren insan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücre kolonilerini manuel diseksiyonla izole edin. Birbirine çok yakın kümelenmiş kolonilerden kaçının ve yalnızca diğerlerinden net bir şekilde ayrılmış kolonileri seçin.Manuel diseksiyon için, bir diseksiyon mikroskobu altında, kolonileri yaklaşık 300 ila 600 mikrometre uzunluğunda küçük parçalara ayırmak için 26 gauge bir iğne kullanın. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin klonal bir hattını oluşturmak için tek bir koloniden alınan parçaları yeni bir MEF feeder plağına aktarın. Kültür, çapı yaklaşık 1,5 milimetre olan insan indüklenmiş pluripotent kök hücre kolonileri ile %70 ila %80 konfluense ulaştığında, hücreleri Accutane, sase veya kolajenaz gibi standart enzimatik pasajlama yöntemlerini kullanarak pasajlayın.Üretici talimatlarına göre dört. Bu protokol takip edildiğinde, saç ekiminden sonra üç gün kadar erken bir dönemde yeniden büyüme gözlemlenebilir ve bu büyüme devam edecektir. Burada gösterilen keratinositler yeni bir plakaya aktarılmış olup, bu hücreler birden fazla pasaj boyunca sürdürülebilir.Bu görüntü, keratinosit türevli tipik bir insan uyarılmış pluripotent kök hücre kolonisini göstermektedir. 32 günlük yeniden programlamanın ardından, insan uyarılmış pluripotent kök hücre kolonisinin merkezinde bazı farklılaşmalar meydana gelebilir. Türetilen hücreler manuel olarak seçildiğinde, genellikle yüksek çekirdek-sitoplazma oranı ve belirgin bir koloni sınırı sergilerler.Ayrıca OCT four nag ve TRA one 60 gibi bir dizi pluripotent marker eksprese ederler. Bu videoyu izledikten sonra, saçtan keratinositlerin nasıl ekstrakte edileceği ve bunların insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücrelere nasıl yeniden programlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Aşağıdaki protokolü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta (KSR-FF) kullanarak besleyici ücretsiz kültür, insan kaynaklı Pluripotent Kök (IPS) Hücreler uyarlanması için talimat sağlar. Bir kez, adapte sürekli bakım için talimatlar ayrıca verilmiştir.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Bu protokol nakavt SR kriyoprezervasyon orta insan iPS hücreleri dondurularak ve bu hücrelerin tam nakavt SR Besleyici Ücretsiz (KSR-FF), orta ya da besleyici tabanlı nakavt SR orta kurtarmak için ayrıntılı prosedürü anlatılmaktadır.

İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta

Bu makale, insan saç köklerinin gelen nöral krest kök hücrelerin izolasyonu ve kültür için sağlam bir protokol sunar.

İnsan Saç köklerinin arasından Sinir Crest Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam türetilmesi, entegre edilmeyen Sendai virüsü (SeV) vektörü aracılığıyla dermal fibroblastların yeniden programlanması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HiPS hücre bakımı ve klonal genişleme, rekombinant insan lamınin 521 (LN-521) matrisi ve Esansiyel E8 (E8) Ortamı ile kseno içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Biz İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı lenfositi ve fibroblastlar ayırt etmek ve bir 3B cilt organoid oluşturmak gösterilmiştir bir protokol bu lenfositi ve fibroblastlar kullanarak öneriyoruz. Bu iletişim kuralı insanlaşmış fareler model oluşturma ek bir adım içerir. Burada sunulan teknik dermatolojik araştırma artıracaktır.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Gelecekteki hastalığı modelleme uygulamaları olan kimyasal olarak tanımlanan koşullarda, burada İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre farklılaşma içine her somite türev (myotome, sclerotome, dermatome ve syndetome) için bir iletişim kuralı mevcut ve Ortopedik cerrahi hücre tabanlı terapiler.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Bu protokol, cilt mimarisini ve işlevini çoğaltmak için düzlemsel, fizyolojik olarak ilgili bir hava-sıvı arayüz kültür sistemi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden saç folikülleri içeren cilt organoidleri üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir.

Hava-Sıvı Arayüz Kültür Sistemi Kullanılarak İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Düzlemsel Saç Taşıyan Cilt Organoidlerinin Üretimi

Keşfedin saç kökünden elde edilen keratinositleri kullanarak entegrasyonsuz insan uyarılmış pluripotent kök hücre üretimini. Epizomal vektörlerle genomik entegrasyon riski olmadan hücre yeniden programlama yöntemini öğrenin.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Daha fazla video keşfet