Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelere zarar vermeden onları çok verimli bir şekilde geçebilen bir reaktif olan dimer, floresan tat veya df tat kullanarak canlı hücrelere makromoleküller iletmektir. Bu, ilk olarak iletim ajanının üretilmesi ve saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak Dfta kullanılır.

Dfta, ilgilenilen makromolekül yükü varlığında 37 °C'de bir saat boyunca hücrelerle inkübe edilir; df tat, yükün endositik veziküller içerisine alınmasını sağlar. Veziküller olgunlaşarak erken endozomlara dönüşür ve nihayetinde DF tat'ın yükü hücrelerinle sitozolik boşluğa bırakabildiği geç endozom aşamasına ulaşır. Ardından, detta ve ilgilenilen yükün iletim verimliliğini değerlendirmek amacıyla hücreler floresan mikroskobu ile görüntülenir.

Sonuçlar, DF TT'nin hücrelere yüksek verimlilikle girebildiğini ve gözlemlenebilir birle sitotoksisite oluşturmadığını göstermektedir; floresan mikroskobisi ile gözlemlenebileceği üzere, DF tat farklı boyutlardaki makromolekülleri hücrelerin sitozolik boşluğuna iletebilmektedir. Bu tekniğin mevcut katı iletim yaklaşımlarına göre temel avantajı, iletim ajanımızın hücresel fizyoloji üzerinde gözlemlenebilir herhangi bir olumsuz etkisi olmadan yüksek bir iletim verimliliğine sahip olmasıdır. Ayrıca, yalnızca basit bir birlikte inkübasyon adımı gerektirdiği için kullanımı kolaydır.

Başlamak için, FTA sentezi için 500 miligram R amid, MBHA reçinesi ve dimetilformamid veya DMF'yi standart 50 mililitrelik bir SPPS kabında bir saat boyunca şişirin; reaksiyonu, reaksiyonu kabarcıklanacak kadar azot gazı kullanarak oda sıcaklığında gerçekleştirin. Her bir amino asit kenetlenme reaksiyonu için metin protokolünde listelenen FM korumalı amino asitlerin her birinden 1,2 milimol kullanarak Rink amid MBHA reçinesi üzerinde FTA sentezleyin. Ayrıca 0,44 gram HBTU ve DMF içinde çözülmüş 0,51 mililitre DIEA ekleyin; her bir amino asit kenetlenme reaksiyonunu dört saat boyunca gerçekleştirin, dört saatlik kenetlenmeyi takiben.

Reçineyi DMF ile yıkayın ve metin protokolünde açıklandığı şekilde FD koruma adımını gerçekleştirin. FTA'nın lineer peptit zinciri sentezlenene kadar işlemi tekrarlayın. Ardından, reçineyi 20 mililitre %1 trifloroasetik asit (TFA) ve %2 triizopropilsilan (TIS) içeren DCM çözeltisi ile beş dakika inkübe ederek MTT koruyucu grubunu uzaklaştırın.

MTT koruyucu grubunun uzaklaştırılması sarı bir renk oluşumuyla sonuçlanacağından, rezin ara aşamalarda DCM ve DMF ile yıkanarak sarı renk gözlemlenmeyene kadar bu işlem tekrarlanır. Rezin üzerine, artık MTT uzaklaşmadığından ve çözeltinin berrak kaldığından emin olmak için DCM içinde %1 TFA içeren ek bir çözelti ekleyin.

Ardından, T-M-R-H-B-T-U ve DIEA'yı DMF içerisinde çözün ve bu karışımı reçineye ekleyin. Fmoc koruması ve amino asit konjugasyonu sonrası karıştırmayı sağlamak için kuru nitrojen kullanarak reaksiyonu gece boyunca sürdürün. Reçineyi DCM ile yıkayın ve peptidin reçineden tamamen ayrılması için kurumaya bırakın.

Küresel derin koruma ve reçineden koparma işlemini gerçekleştirmek için, peptidil reçinesine %92,5 TFA, %2,5 su, %2,5 TIS ve %2,5 etan ditiyol içeren bir çözelti ekleyip oda sıcaklığında üç saat bekletin. Hazırlanan çözeltiyi 40 mililitre etil eter içine boşaltarak, soğuk anhidroz etil eter yardımıyla ham peptid ürünlerini çöktürün. Bu karışımı dört santigrat derecede ve 4.000 G'de 20 ila 25 dakika boyunca santrifüjleyin.

Çökeltinin soğuk anhidrat etil eter ile yıkanmasını sağlamak için bu adımı tekrarlayın. Çökeltileri su içinde süspande edin, liyofilize edin ve ardından elde edilen ürünleri %0,1 sulu TFA ACEDONITE denemesinde yeniden süspande edin. Analitik bir C 18 kolon ile yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC analizi gerçekleştirin.

Her bir peptidi analiz etmek için, dakikada bir mililitre akış hızı ile 214 nanometre ve 550 nanometre dalga boylarında deteksiyon kullanın. Ardından, peptid saflaştırması için C 18 kolonda yarı preparatif HPLC uygulayın. Tüm analizler için dakikada dört mililitre akış hızı ve 214 nanometre ile 550 nanometrede deteksiyon kullanın.

Oksidasyon reaksiyonunu gerçekleştirmeden önce doğrusal gradyanlar kullanın. Peptitlerin doğru kimliğini, üretici protokolüne uygun olarak MALDI ile doğrulayın. FTA'yı havalandırılmış fosfat tamponlu salinde çözün.

pH değerinin 7,0 ile 7,5 arasında olduğundan emin olun. Peptit ilavesinden sonra, reaksiyonun tamamlanması için karışımı gece boyunca inkübe edin. Ürünü ters faz HPLC kullanarak saflaştırın ve kütle spektrometrisi ile analiz edin; ardından saflaştırılmış DF tat'i liyofilize edin ve konsantrasyonu ölçmek için 200 µL su içinde yeniden süspanse edin.

İlk olarak, saflaştırılmış DF tat'in bir alikotunu 149 µL 50 mM TCEP çözeltisi içinde süspanse edin ve örneğin yaklaşık 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin. Bu adımda, TMR flor 4 ve DF tat'in birbirine yakınlığı nedeniyle meydana gelen absorbans sönümlenmesini gidermek için DF tat, monomer karşılığı olan F tat'e indirgenir. Tüm çözeltileri kuvars bir küvete ekleyin ve 556 nm'de absorbansı ölçün.

Beer yasasını kullanarak çözeltinin konsantrasyonunu belirleyin. Bu değer fta konsantrasyonuna karşılık gelmektedir.

dfta konsantrasyonunu elde etmek için FTA konsantrasyonunu ikiye bölün. Hücreleri, %5CO2 içeren 37 degrees Celsius sıcaklığındaki nemlendirilmiş bir atmosferde, %80 ila %90 konfluense ulaşana kadar uygun bir besiyerinde büyütün; ardından hücreleri 200 microliters PBS ile üç kez ve bir kez NRL 15 ile yıkayın. Endozomal sızıntıyı indüklemek için hücreleri, geliştirilmiş yeşil floresan protein gibi kargolarla veya kargosuz olarak beş micromolar df tat ile inkübe edin ve inkübasyon sonrası bir saat boyunca 37 degrees Celsius sıcaklıkta tutun.

Hücrelerin plazma membranına bağlanan DF tat'i uzaklaştırmak için hücreleri L 15 ortamındaki heparin ile üç kez yıkayın. Son adım olarak, F TAT ve D ftt arasındaki farkı değerlendirmek için kırmızı floresan protein veya RFP filtresi kullanarak bir floresan mikroskobu ile DF tat'in görüntülemesini yapın. Peptidlerin hücresel lokalizasyonlarındaki farkı belirlemek için HeLa hücreleri her bir peptid ile inkübe edilir.

Burada gösterildiği gibi, FTA noktasal bir dağılım sergiler. Bu dağılım, peptidin endozomlar içinde hapsolmuş olduğuyla tutarlıdır. Buna karşılık, dfta'nın floresan sinyali sitozol ve çekirdek boyunca homojen bir dağılım gösterir.

DF tat'ın sitozolik dağılımı, bir dizi farklı hücre hattında gözlemlenir. 20x görüntüler, bir kapta çok yüksek bir yüzdenin, hücresel toksisite olmaksızın DF tat'in sitozolik dağılımı sergilediğini göstermektedir; bu durum, dfta aracılı endozomal sızıntının büyük proteinleri hücrelerin sitozolüne iletip iletmediğini belirlemek için yapılan cyt blue nükleer boyamasında görülmüştür. Doğru katlanmış proteinin iletimini tespit etmek için EGFP kullanılmıştır.

EGFP, gözlemlenebilir bir toksisite olmaksızın hücrelerin %90'ından fazlasında DF tat için gözlemlenene benzer şekilde, sitozolik ve nükleer bir yeşil floresan dağılım göstermiştir. Bu prosedürü uygularken, hücrelerin aşırı konflu olmaması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ayrıca, df tap eklemeden önce FPS'yi uzaklaştırmak için hücreler iyice yıkanmalıdır.