Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelere zarar vermeden çok verimli bir şekilde nüfuz edebilen bir reaktif olan dimer, floresan tat veya df tat kullanarak makromolekülleri canlı hücrelere iletmektir. Bu, önce teslimat aracısının üretilmesi ve saflaştırılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak Dfta.

Dfta, ilgilenilen makromolekül kargosunun varlığında 37 santigrat derecede bir saat boyunca hücrelerle inkübe edilir, df tat, Endositik veziküller içindeki kargonun alımını indükler. Veziküller erken endozomlara olgunlaşır ve sonunda DF tat'ın kargoyu hücrelerin sitozolik boşluğuna bırakabildiği geç endozom aşamasına ulaşır. Daha sonra, hücreler, detta ve ilgilenilen kargonun teslimat verimliliğini değerlendirmek için floresan mikroskobu ile görüntülenir.

Sonuçlar, DF TT'nin hücrelere yüksek verimlilikle girebildiğini ve gözlemlenebilir sitotoksisite olmadığını, DF tat'ın floresan mikroskobu ile gözlemlenebileceği gibi, hücrelerin sitozolik boşluğuna farklı boyutlarda makromoleküller iletebildiğini göstermektedir. Bu tekniğin mevcut katı dağıtım yaklaşımlarına göre ana avantajı, dağıtım ajanımızın hücresel fizyoloji üzerinde gözlemlenebilir bir olumsuz etki olmaksızın yüksek bir dağıtım verimliliğine sahip olmasıdır. Ek olarak, sadece basit bir birlikte inkübasyon adımı gerektirdiğinden kullanımı kolaydır.

Başlamak için, FTA sentezi, standart 50 mililitrelik bir SPPS kabında 500 miligram R amid, MBHA reçinesi ve dimetilformamid veya DMF'yi bir saat boyunca şişirir, reaksiyonu köpürtmek için yeterli nitrojen gazı kullanarak reaksiyonu oda sıcaklığında gerçekleştirir. Her bir amino asit birleştirme reaksiyonu için metin protokolünde listelenen her bir FM korumalı amino asitten 1.2 milimol kullanarak pist amid MBHA reçinesi üzerinde FTA sentezleyin. Ayrıca, DMF içinde çözünmüş 44 gram HBTU ve 51 mililitre DIEA noktası ekleyin, her bir amino asit birleştirme reaksiyonunu dört saatlik eşleşmeyi takiben dört saat boyunca gerçekleştirin.

Reçineyi DMF ile yıkayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi FD koruma adımını gerçekleştirin. FTA'nın doğrusal peptit zinciri sentezlenene kadar tekrarlayın. Daha sonra, reçineyi DCM'de beş dakika boyunca %1 tri Flor asetik asit veya TFA ve %2 tri izopropil cy veya TIS'den oluşan 20 mililitrelik bir çözelti ile inkübe ederek MTT koruma grubunu temizleyin.

MTT koruma grubunun çıkarılması sarı bir rengin ortaya çıkmasına neden olacaktır. Reçineyi arada DCM ve DMF ile yıkayarak sarı renk görülmeyene kadar bunu tekrarlayın. MTT'nin çıkarılmamasını ve çözeltinin berrak kalmasını sağlamak için reçineye DCM'de %1 TFA içeren ek bir çözelti ekleyin.

Daha sonra T-M-R-H-B-T-U ve DIEA'yı DMF'de çözündürün ve bu karışımı reçineye ekleyin. Fm d koruması ve amino asit konjugasyonunu takiben ajitasyon sağlamak için kuru nitrojen kullanarak reaksiyonu gece boyunca gerçekleştirin. Reçineyi DCM ile yıkayın ve peptidin reçineden tamamen ayrılması için kurumasını bekleyin.

Reçineden küresel derin koruma ve bölünme elde etmek için peptidil reçinesine oda sıcaklığında üç saat boyunca %92,5 TFA, %2,5 su, %2,5 TIS ve %2,5 etan diyol içeren bir çözelti ekleyin. Hazırlanan çözeltiyi 40 mililitre eyl eter içine boşaltarak soğuk susuz etil eter kullanarak ham peptit ürünlerini çökeltin. Bunu 20 ila 25 dakika boyunca dört santigrat derece ve 4.000 G'de döndürün.

Çökeltinin soğuk susuz etil eter reus ile yıkanmasına izin vermek için bu adımı tekrarlayın. Çökeltileri suda süspanse edin ve liyofilize edin, ardından %0.1 sulu TFA ACEDONITE denemesinde elde edilen ürünleri yeniden süspanse edin. Analitik C 18 sütunu ile yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC analizi gerçekleştirin.

Her bir peptidi analiz etmek için dakikada bir mililitrelik bir akış hızı ve 214 nanometre ve 550 nanometrede algılama kullanın. Daha sonra, peptit saflaştırması için bir C 18 sütunu üzerinde yarı hazırlayıcı HPLC gerçekleştirin. Dakikada dört mililitrelik bir akış hızı ve tüm çalıştırmalar için 214 nanometre ve 550 nanometrede algılama kullanın.

Oksidasyon reaksiyonunu gerçekleştirmeden önce doğrusal gradyanlar kullanın. Üreticinin protokolüne göre peptitlerin doğru kimliğini MALDI ile onaylayın. FTA'yı havalandırılmış fosfat tamponlu tuzlu su içinde çözün.

PH'ın 7.0 ile 7.5 arasında olduğundan emin olun. Peptit eklendikten sonra, tamamlanana kadar reaksiyona girmesine izin vermek için reaksiyonu gece boyunca mutasyona uğratın. Ürünü ters fazlı HPLC kullanarak saflaştırın ve daha önce olduğu gibi kütle spektrometresi ile analiz edin, saf DF tat'ı liyofilize edin ve konsantrasyonu ölçmek için 200 mikrolitre su içinde tekrar askıya alın.

İlk olarak, Resus, saflaştırılmış DF tat'ın bir alikotunu 149 mikrolitre 50 milimolar TCEP çözeltisi içinde askıya alır, numunenin yaklaşık 20 dakika reaksiyona girmesine izin verir. Bu adımda, TMR kat dört ve DF tat'ın yakınlığı nedeniyle meydana gelen absorbans söndürmeyi ortadan kaldırmak için DF tat, monomer muadili F tat'a indirgenir. Tüm çözeltileri bir kuvars CVE'ye ekleyin ve absorbansı 556 nanometrede ölçün.

Bira yasasını kullanarak. Çözeltinin konsantrasyonunu belirleyin. Bu, fta konsantrasyonuna karşılık gelir.

Dfta konsantrasyonunu elde etmek için FTA konsantrasyonunu ikiye bölün. Hücreleri %80 ila %90'a kadar uygun bir ortamda büyütün% 5 CO2 içeren 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir atmosferde akıcılığı koruyun, hücreleri üç kez 200 mikrolitre PBS ile ve bir kez NRL 15 ile yıkayın. Hücreleri, geliştirilmiş yeşil floresan proteini gibi kargolu veya kargosuz beş mikromolar df tat ile inkübe edin ve inkübasyonu takiben endozomal sızıntıyı indüklemek için bir saat boyunca 37 santigrat derecede tutun.

Hücrelerin plazma zarına bağlı DF tat'ı çıkarmak için hücreleri L 15 ortamında heparin ile üç kez yıkayın. Son adım görüntüsü olarak, bir floresan mikroskobu kullanan hücreler, F TAT ve D ftt arasındaki farkı değerlendirmek için kırmızı bir floresan proteini veya RFP filtresi kullanarak DF tat'ı görüntüler. Heela hücreleri, hücresel lokalizasyonlarındaki farkı belirlemek için her bir peptit ile inkübe edilir.

Burada gösterildiği gibi, FTA noktasal bir dağılımda yerelleşir. Bu dağılım, endozomların içinde sıkışıp kalan peptit ile tutarlıdır. Buna karşılık, dfta'nın floresan sinyali, sitozol ve çekirdek boyunca homojen bir dağılım gösterir.

DF tat'ın sitozolik dağılımı bir dizi farklı hücre hattında gözlenir. 20 x görüntü, bir tabaktaki çok yüksek bir yüzdenin, dfta aracılı endozomal sızıntının hücrelerin sitozolüne büyük proteinler sağlayıp sağlamadığını belirlemek için hiçbir cyt blue nükleer boyamada görüldüğü gibi, hücresel toksisite olmadan DF tat'ın sitozolik bir dağılımını gösterdiğini göstermektedir. EGFP, doğru katlanmış proteinin verilmesini tespit etmek için kullanıldı.

EGFP, gözlemlenebilir toksisite olmayan hücrelerin %90'ından fazlasında DF tat için gözlemlenene benzer bir sitozolik ve nükleer yeşil floresan dağılımı sergiledi Bu prosedürü denerken, hücrelerin aşırı birleşik olmaması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ek olarak, df musluğu eklemeden önce FPS'yi çıkarmak için hücreler iyice yıkanmalıdır.