Name: Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin, endosomolitik reaktif dfTAT kullanarak canlı memeli hücrelerine protein ve hücre geçirmez küçük moleküllerin teslimatını. Bu yöntem, sitotoksisite olmadan yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu makale, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü, Norman Ackerman İleri Araştırma Programı ve Robert A. Welch vakfından (Grant A-1769) R01GM087227 Numaralı Ödül ile desteklenmiştir.

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) sentezi Not: dfTAT iki aşamada üretilir: dfTAT oluşturmak için disülfid bağı dimerizasyonu, katı faz peptid sentezi ile, monomer fTAT sentezini. <ol><li> 1 saat süre ile standart bir 50 ml SPPS kabı içinde dimetilformamid (DMF) içinde Rink Amide MBHA reçinesinin 500 mg kabarma. </li><li> .% 20&#39;lik bir piperidin çözeltisi (DMF içinde% 20 piperidin, 10 ml (0.30 mmol) Fmoc korumalı reçine inkübe edilerek Fmoc korumasının kaldırılması gerçekleştir (1 x 5 dakika ve yıkama aşaması ile birlikte 1 x 15 dak) ile iki kez koruma kaldırma adımları tekrarlayın DMF (yıkama aşaması DMF, yaklaşık 150 ml&#39;lik bir toplam hacim reçineye birden çok kez durulama ve vakumla süzme ile çözücünün çıkarılması dahil olmak üzere) reaksiyonları arasında. </li><li> Alani amid MBHA reçinesi üzerinde CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) sentez. Kullanım Fmoc korumalı amino asitleri aşağıdaki gibidir: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (sadece N terminaline), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys ve (Trt) -OH. Reaksiyonu kışkırtmak N 2 (20 PSI) ile reaksiyonu yürütmek. Oda sıcaklığında bütün reaksiyonlar gerçekleştirin. <ol><li> 4 saat süre ile, her bir amino asit birleştirme reaksiyonunu yürütmek. Her bir bağlantı için, Fmoc korumalı amino asit (1.2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; tetrametilsiklopentadienil O- (1H-benzotriazol-1-il) üronyum hekzaflorofosfat (HBTU) (0.44 g, 1.1 mmol korumalı kullanımı DMF içinde çözülmüş), ve diizopropiletilamin (DIEA) (0.51 mi, 3.0 mmol) eklenmiştir. 4 saat Kenetleme yapıldıktan sonra DMF ile reçinenin yıkanması ve aşama 1.2&#39;de tarif edildiği gibi Fmoc korumasının kaldırılması adımı gerçekleştirmek. </li><li> (: CKRKKRRQRRRG no TMR Lineer peptid zinciri) sentezlendi fTAT doğrusal peptit zinciri kadar tekrarlayın. </li><li> Daha sonra iyice birinci DMF kullanılarak ve diklorometan (DCM) ile takip eden reçine yıkayın. DMF veya DCM, yaklaşık 150 ml&#39;lik bir toplam hacim reçineye birden çok kez yıkayın ve vakum süzme ile ayrılması için kullanılabilir. </li><li> Use MALDI-TOF Elde edilen peptid, doğru moleküler ağırlığa sahip olduğu teyit etmek için. <ol><li> Su çözeltisi içinde% 0.01 TFA, 50 ul asetonitril, 50 ul oluşan bir çözeltiye matris 1 mg ekleyerek bir matris karışımı yapın. </li><li> Lineer peptit zinciri kütlesi teyit etmek için, α-siyano-4-hidroksisinamik asit kullanın. Ham peptid analitik HPLC çalıştırın ve saf tepe üstünden 50 ul toplamak. </li><li> MALDI plaka plaka numunesinin hazırlanması için: Kuru veya 37 ° C ısıya plaka üzerinde yayınlamak için MALDI plaka üzerinde matris solüsyon ve yer 2 ul peptidin 8 ul ekleyin. Not: Arginin SPPS&#39;si çiftin zor olan bir amino asit olduğu bilinmektedir. Başarılı birleştirme Kaiser testi 14 (örneğin, ninhidrin testi) yapılarak oluşturulur. Bu test reçine Kuplajsız kalabilir serbest aminlerin tespiti için izin verir. Durumda, sabit bir mavi renk (serbest aminler varlığının göstergesidir) tespit edilir, birleştirme sTeps&#39;in tekrar edilir. </li></ol></li></ol></li><li> CK için (= NH-TMR) TATG (fTAT),% 1 trifluoroasetik asit (TFA) ve% 2 triizopropilsilan oluşan bir çözelti ile CK Lys-amino grubunda (-NH-Mtt) TATG Mtt koruma grubunun yanlması DCM (TBS). <ol><li> MTT koruma grubunun çıkarılması, sarı bir rengin ortaya çıkması ile sonuçlanabilir ki gibi, 5 dakika boyunca, yukarıda çözeltisi 20 ml reçine inkübe sarı renk elde edilinceye kadar, bu tekrarlayın. Arasında, DCM ve DMF reçine yıkanır. TIS MTT temizlemek olan bir çöpçü Ayrıca, çünkü bir kez sarı renkli MTT mevcudiyetinde çözelti içinde görüntülenir. </li><li> Daha MTT sağlamak için reçineye, DCM içinde% 1 TFA (herhangi bir TBS) ile ilave bir solüsyonu ilave çıkarılır ve çözelti, açık kalır. </li></ol></li><li> DMF (() mg reçine miktarına göre 4, 3.9 ve 10 denklik) Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU ve DIEA ve bu karışımı ekleyin: üç bileşeni çözülürreçine ve reaksiyon O yürütmek / N karıştırma sağlamak için kuru N 2 kullanarak. </li><li> Fmoc-korumasının giderilmesinden ve amino asit Konjügasyondan sonra DCM ile reçinenin yıkanması ve kurutun. Peptidin reçineden komple klevajından için, 92.5% TFA,% 2.5 ihtiva eden bir çözelti ilave H2O,% 2.5, TIS, ve 3 peptidil-reçineye% 2.5 etanditiol (EDT) (toplam hacim = 4 mi) oda sıcaklığında saat reçineden genel koruma açma ve klevajını elde etmek mümkündü. <ol><li> Et 2 O 40 ml adım 1.6 çözeltinin boşaltılması soğuk susuz etil eter (Et 2 O) kullanılarak ham peptid ürünü Çökelti, 4 ° C&#39;de, bu aşağı doğru döner ve 20 için 4000 xg - 25 dak. Soğuk susuz Et 2 O. ile çökelti yıkama izin vermek için bu adımı tekrarlayın </li><li> Su (5 ml ya da çökelti tamamen eriyene kadar) ve liyofilize çökeltilerin yeniden süspanse edin. Daha sonra% 0.1 sulu TFA / asetonitril içinde elde edilen ürünler yeniden süspanse edin. </li></ol></li> &lt;li&gt; analitik C18 kolonu (5 um, 4 x 150 mm) her peptid analiz HPLC analizi yapın. 214 nm ve 550 nm &#39;de bir akış 1 ml / dakika hızını ve algılama kullanın. </li><li> Peptit saflaştırılması için bir C18, 10 x 250 mm sütun üzerinde, yarı-preparatif HPLC gerçekleştirin. 214 nm ve 550 nm &#39;de bir akış 4 ml / dk&#39;lık bir oranı ve algılama kullanın. Tüm işlemler için,% 0.1 sulu TFA (solvent A) ve% 90 asetonitril,% 9.9 su ve% 0.1 TFA (solvent B) doğrusal gradyanlar kullanımı. </li><li> FTAT, beklenen kütle: 2,041.17, gözlemlenen kütle: 2040.66, üreticinin protokolüne uygun olarak MALDI-TOF ile peptidlerin, doğru kimliğini teyit edin. Kütle beklenen DEAC-K9: 1,415.59: 1,412.97, kütle görülmüştür. MALDI-TOF için α- siyano-4-hidroksisinamik asit matris kullanın. </li></ol> 2. Oksidasyon reaksiyonu: dfTAT Üretimi <ol><li> 1 saat (aşağıdaki reaksiyon için, en az 5 mi), fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 havalandırın. </li><li> AER bölgesindeki fTAT (0.3 mg, 1.5 x 10 -4 mmol) çözülürated PBS pH 7.4 (5 mi). Peptidin ilavesinden sonra 7.5 - pH 7.0 arasında olduğundan emin olun. Sodyum hidroksit ilave değilse (küçük artışlarla 1 M, 1-5 ul) geri 7.4 kadar pH değeri getirmek için. </li><li> Not: PBS içinde çözülmüş oksijen fTAT tiol grupları oksitleyerek, bir disülfid bağ oluşturmak üzere hareket eder. </li><li> Reaksiyon O Nutate / N tamamlanmadan (HPLC analizine göre% 100 verim) kadar reaksiyona girmesine izin vermek. Ters faz HPLC ile ürünün saflaştırmak ve adım 1.9 olarak kütle spektrometrisi (MALDI-TOF) ile analiz edilmiştir. Beklenen kütle: 4,084.21: 4,080.34, kütle görülmüştür. </li><li> 200 ul su içinde Lyophilize saf dfTAT (0.71 x 10 -4 mmol) ve tekrar süspansiyon (konsantrasyon saf dfTAT = 356,3 uM). </li></ol> 3. dfTAT Konsantrasyon ölçüm <ol><li> 50 mM TCEP solüsyon 149 ul saflaştırılmış dfTAT (saflaştırılmış peptid miktarına bağlı olarak, tipik olarak 1 ul), bir kısım yeniden süspanse edin. </li><li> Not: Bu adımda dfTAT kendi mo indirgenirnomer muadili fTAT nedeniyle dfTAT bölgesindeki TMR fluorofor yakın bir yerde (in dfTAT TMR ekstinksiyon katsayısı ε indirgenmiş fTAT bölgesindeki TMR nin s kıyasla azaltılır) oluşur absorbans su verme ortadan kaldırmak için. </li><li> Örnek yaklaşık 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verir (analitik HPLC fTAT oluşumu teyit etmek için kullanılabilir). </li><li> Kuvars küvetine tüm çözüm ekleyin ve 556 nm&#39;de absorbansı ölçün. </li><li> Beer Kanunu Kullanma (A = εcl: ε = 91500 M -1 cm -1), fTAT konsantrasyonunu hesaplamak dfTAT konsantrasyonunu belirlemek ve iki tarafından [fTAT] bölmek için. </li></ol> 4. Hücresel Gönderme Deneyler <ol><li> % 90 (örn 8-kuyu veya 24 kuyu çanak) - 80 konfluansa bir tabak hücreler (. HeLa, HDF, vs.) Tohum. Bir 37 ° C% 90 konfluent - uygun bir ortam içinde hücreler büyümek 80 kadar (örneğin, DMEM,% 10 FBS ve Pen / Strep ile takviye edilmiş)% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş atmosfer. </li><li> (Üç kez çıkarılması daha sonra PBS içinde 200 ul ilave edilerek) hücreler üç kere PBS ile (3X) yıkayın. </li><li> (8 de toplam hacim 200 ul olmalıdır çanak için) NRL-15 ortamı (su içinde) dfTAT bir stok seyreltilmesiyle dfTAT bir 5 uM çalışma konsantrasyonu yapın. 5 uM dfTAT bir konsantrasyon olarak etkili taşınmasında, tarih (Şekil 3) test edilen pek çok hücre tipinde (bir tabak içinde bulunan hücrelerin% 90&#39;ından fazlası sitozolik teslimat yüksek düzeyde) neden olur. Bununla birlikte, daha düşük ya da daha yüksek konsantrasyonlarda nüfuz etmesi için yüksek ya da düşük eğilimi olan hücre türleri için daha uygun olabilir. MEDYA Not: dfTAT disülfid bağı azaltabilecek sistein içermediği NRL-15 dfTAT verilmesi için kullanılır. Ancak, veri hem normal L-15 (sistein ile) ve DMEM dağıtım ortamı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. L-15 indirgeme amino asit sistein, ancak sistein presumab içerirly (DMEM sistin ile formüle edilmiştir) sistin oluşturulması için medya okside. dfTAT dolayısıyla bu ortam içinde bozulmadan kalır ve dağıtım nrL15 ile elde edilen ile aynı etkinlikte çalışır. </li><li> Ya da yük olmadan dfTAT (5 uM) (örn.,, EGFP (10 uM)) kuluçkaya bırakılır ve (kuluçkalama süresi azaltılabilir, ancak dfTAT tipik olarak endozomal sızıntı uyarılması için yaklaşık 30 ila 45 dakika gerektiren 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de devam ). </li><li> (3 yıkama tavsiye edilir), hücrelerin plazma zarına bağlanmış dfTAT kaldırmak için L-15 heparin (1 mg / ml) ile hücrelerin yıkayın. </li><li> Uygun cep geçirmeyen Nükleer soya, kuluçkaya bırakılır, örneğin., Sytox Mavi, Sytox Yeşil (NRL, 15-2 uM), hücrelerin plazma zarı tehlikeye olup olmadığını belirlemek için (canlı hücreler olmaz ise ölü hücreler boyanmış olacaktır) Üreticinin protokolü. </li><li> Bir floresan mikroskop (100X immersiyon yağı veya 20X objektif) kullanarak görüntü hücreleri. Bir RFP filtre kullanarak Görüntü dfTAT (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Not: başarılı dağıtım hücre boyunca dfTAT yayılmış bir floresan (uygulamaya bağlı olacaktır proteinin veya ilgili peptidin teslim değerlendirilmesi) yol açar. FTAT (sitosolik girişi üzerine dfTAT azaltılmış ürünü) ile nukleoli boyanması tespit floresans hücre içi olduğuna dair bir gösterge olarak kullanılabilir. fTAT birkaç saat içinde düşer. Bu noktada, parçalanma fragmanları floresan punktat olarak görünür. Bu dfTAT başarısız (dfTAT bir konsantrasyon çok düşük de varsa bu olur) endozomlardan içinde sıkışıp kalırsa da görülür noktasal dağıtımı için karışık olmamalıdır. </li></ol> Teslim İçişleri Bakanlığı 5. denetimden geçmiş Konsantrasyon <ol><li> Kullanılan hücre tipinde dfTAT verimli sitozolik serbest ulaşmak için gerekli &quot;optimal dağıtım&quot; konsantrasyonunu belirleyin. Increasin ile kuluçkaya hücreler üzerinde floresan mikroskobu gerçekleştirindfTAT g konsantrasyonları. Optimal dfTAT konsantrasyonu sitosolik temizlemek için neden minimum konsantrasyon olarak tanımlanan bir kültür içindeki hücrelerin yaklaşık% 100 TMR floresan &quot;yaygın&quot;. </li><li> (DfTAT optimal dağıtım konsantrasyonu kullanılarak, örneğin) dfTAT sabiti konsantrasyonunu tutarken İçişleri Bakanlığı konsantrasyon eş kuluçka protokolünde kullanılan Vary. Az 1 saat inkübasyon süresi değiştirilmesi İçişleri Bakanlığı teslim miktarını değiştirmek için bir seçenek olabilir. </li></ol>

<ol><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li>
<li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li>
<li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%3A+Technol%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li>
<li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4%2C+SOX2%2C+KLF4+and+c-MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li>
<li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li>
<li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li>
<li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides%3A+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chem%22%5BJournal%5D)">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li>
<li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
<li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+biophys+acta%22%5BJournal%5D)">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li>
<li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Çünkü bu aşırı konfluent olmamalıdır dfTAT teslimat için kullanılan hücreler (&gt;% 90 konflüans) verme etkinliğini etkileyebilir. Hücreler de sağlıklı olması gerekir: kültürdeki ölü hücreler dfTAT (bozulmuş çekirdekten örneğin DNA) etkileşim hangi ile apoptotik parçaları serbest bırakabilirsiniz. Bu da bu uygulama randımanına ve görüntüleme kalitesini engelleyebilir. Hücreler dfTAT eklemeden önce FBS kaldırmak için iyice yıkanmalıdır. FBS içinde BSA bulunan dfTAT bağlanan ve bu dfTAT verme etkinliğini düşürür....

Canlı hücrelere proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük molekül iletilmesi pek çok biyolojik veya biyoteknolojik uygulamalar (hücresel görüntüleme işlevsel deneyler, hücre yeniden programlama, vb.) 1-4 genellikle arzu edilen bir durumdur. Birçok dağıtım yaklaşımlar önce mikroenjeksiyon, elektroporasyon veya taşıyıcı maddelerin kullanımı da dahil olmak üzere, rapor edilmiştir (örn., Örneğin TAT hücre nüfuz peptidler, lipidler) 5-7. Her teknik genellikle belirli uygulamalar için değil, başkaları için bu yaklaşımlar yeterli hale getirebileceğini belirli artıları ve eksileri vardır. Sık karşılaşılan sorunlar birkaç hücrelerde değil bütün bir halkın ve / veya eksikliği 8,9 teslim edilir ne kadar malzeme kontrolü, toksisite veya zararlı fizyolojik etkisi 10,11, zamansal kontrol eksikliği, teslimat kötü teslimat verimliliği (dahil örn., mikroenjeksiyon) 12 ve karmaşık kimyasal çekimi veya formülasyon şemaları 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Son zamanlarda, biz bu sınırlamaları ortadan bir roman teslim strateji geliştirdik. Bu strateji dfTAT adında bir peptid (dimer floresan TAT) 13 dayanır. dfTAT iyi bilinen hücre nüfuz peptid (CPP) TAT türetilmiştir. dfTAT fluorofor tetrametilrodamin ile etiketlenmiş TAT iki disülfür bağlı bir kopyasını içerir. Onların benzerliklere rağmen, TAT ve dfTAT aktivitesinde önemli ölçüde farklıdır. TAT tipik endositoz ile hücre içine yerleştirilebilir. Bu CPP Ancak çoğunlukla (floresan mikroskobu ile incelendiğinde bu genellikle hücrelerin içinde peptid bir noktalı dağılımına yol) endozomlardan içinde sıkışıp kalır. TAT gibi, dfTAT verimli hücreler tarafından endocytosed edilir. Ancak, dfTAT endozomlardan içinde sıkışıp kalmıyor. Bunun yerine, son derece verimli bir şekilde endozomal sızıntı aracılık eder. DfTAT ve endosomolitik aktivitesi daha sonra basit bir kuluçka testi ile makromoleküllerin teslim için kullanılabilir. şöyle ntent &quot;&gt; dağıtım işleminin mevcut anlayış. dfTAT makropinositoz neden olur. Sonuç olarak, dfTAT kuluçkaya hücreler sıvı faz ortam içinde mevcut olan çözünür protein, peptid, veya küçük molekülleri (ilgili moleküller, MOI) sürebilir endositoz (Şekil 1). dfTAT ve İçişleri arasındaki etkileşimler birlikte endositik yolunun içinde hem de kurumlar trafik sürece gerekli değildir. dfTAT endositik organellerin lümeni içinde belirli bir eşiğe ulaştığında, onun endozomal kaçak aktivitesini (moleküler ayrıntıları ifade dfTAT, çünkü bu yaklaşım Ayrıca. Bu nedenle MOI konjugasyon veya formülasyon düzenleri gerekli olduğu gibi çok uygundur.). tam olarak karakterize olması sızıntılı organellerin lümenin içeriğini kalır ve bu nedenle, İB, daha sonra hücrelerden salınan hücre içi taşıyıcı ulaşıldıktan sonra doğrudan MOI değiştirerek değil, aynı zamanda MOIS işlevine müdahale etmemelidir. Buna ek olarak, konsantrasyondfTAT dağıtım medyada MOI bu bağımsız kullanılır. Örneğin, dfTAT konsantrasyonu endozomal kaçağı tekrarlanabilir verim sağlamak için farklı deneyler arasında sabit tutulabilir. Bunun aksine, ortam içinde MOI konsantrasyonu giderek MOI sitozol içinde teslim istenen seviyelerinin elde edilmesi için değiştirilebilir. DfTAT ile elde yüksek endozomal kaçak verimliliği bugüne kadar test edilen hücrelerin birçok dikkat çekici zararsız olduğunu. Endositik organelleri hücre önemli bir bileşenidir ve bir dfTAT aracılık dramatik kaçak zararlı hücresel yanıtları eşlik edeceğini beklenir, çünkü bu bir sürpriz oldu. Bununla birlikte, tedavi edilen hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere aynı hızda çoğalır ve transcriptome önemli bir değişiklik göstermez. Ayrıca, dağıtım hücreleri kaybetmeden teslim sürecinden tahammül ya kurtarabilirsiniz ya belirten tekrarlanabilir dağıtım verimliliği ile birkaç dakika içinde tekrar edilebilirendositoz veya endozomal sızıntı onların kapasitesi. Ince hücresel yanıtları dfTAT teslimat ve bu yanıtların keşfedilmeyi beklemektedir ne olabileceğini moleküler ayrıntıları sırasında yer alabilir. Ancak, yüksek verim, protokollerin kolaylık ve toksisite eksikliği birleştirerek, bu teslim yaklaşımı birçok hücre tabanlı uygulamalarda hemen kullanışlı ispatlamak zorundadır. Burada sunulan protokolleri araştırma topluluğuna bu teknoloji erişilebilir hale getirmeyi amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Heparin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Mavi</td><td>İnvitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Yeşil</td><td>İnvitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&ndash;) sistein</td><td>Hidroklon</td><td></td><td>Özel sipariş</td></tr><tr><td>Fmoc korumalı Amino asitler</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Numuneler talep üzerine sağlanacaktır (iletişim: pellois@tamu.edu)</td></tr> <tr><td>Biyogüvenlik Kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters epifloresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td>, <td>37 ° C'de tutulan bir ısıtma kademesi ile donatılmıştır; C ve Rolera-MGI Plus arkadan aydınlatmalı elektron çoğaltan şarj bağlantılı cihaz (EMCCD) kamera (Qimaging) ile.</td></tr><tr><td>37 & derece; C nemlendirilmiş,% 5 CO2 inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manuel peptit sentezini</td><td></td><td></td><td></td> önceden oluşturmak için peptit sentezleyici veya kap</tr></tbody></table>

endosomolitik reaktif dftat ile kuluçkaya yatırılması ile canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Makromoleküler teslim stratejileri genellikle hücresel bir giriş yolu olarak endositik yolu kullanmaktadır. Ancak, endozomal tuzak ciddi hücrelerin sitozolik alan nüfuz makromoleküller hangi ile verimliliği sınırlar. Son zamanlarda, biz reaktif dfTAT, fluorofor tetrametilrodamin etiketli peptid TAT bir disülfit bağ dimer belirleyerek bu sorunu hile var. Bu, canlı hücreleri nüfuz eder ve özellikle yüksek bir verimlilik ile hücrelerin sitosolik alan ulaşır prototip hücre nüfuz peptid (CPP) TAT, dfTAT, bir floresan etiketli dimer yarattı. DfTAT bölgesinin Sitosolik dağıtım birincil hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre çizgileri elde edilir. Ayrıca, dağıtım belirgin hücre canlılığı, proliferasyonu veya gen ekspresyonunu etkilememektedir. dfTAT küçük moleküller, peptitler, antikorlar, enzimler ve biyolojik olarak aktif bir transkripsiyon faktörünü sağlayabilir. Bu raporda, dfTA katılan protokol tarifT sentezi ve hücresel teslimat. Eser hücre dışı İlaç olarak verilen proteinin miktarının değiştirilmesiyle hücre sitosolik alan teslim proteinin miktarının kontrolü açıklamaktadır. Son olarak, bu yeni teknoloji ve teslimat doğrulayarak katılan adımların güncel sınırlamalar tartışılmıştır. Tarif edilen protokoller, hücre bazlı deneyler hem de hücrelerinin ex vivo, manipülasyon ve yeniden programlama için çok yararlı olacaktır.

FTAT ve dfTAT arasındaki farkı değerlendirmek için, HeLa hücreleri, hücresel lokalizasyon farkını belirlemek için her peptit ile 1 saat süre ile inkübe edilir. İki CPP en içselleştirilmesi floresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. FTAT (20 mcM) bir noktasal dağılımı lokalize 2 gösterileri Şekil. Peptid endozomlardan içinde sıkışan kalan bu dağılım tutarlıdır. Bunun aksine, dfTAT (5 uM) floresans sinyali sitosol ve nükleus içinde homojen bir dağılım gösterir. Şekil 3</str...

Endositik organellerin sızmasına neden olan bir reaktifle basit bir birlikte inkübasyon protokolü ile proteinlerin ve hücre geçirimsiz küçük moleküllerin kültürlenmiş memeli hücrelerine nasıl verileceğini açıklıyoruz.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücrelere zarar vermeden onları çok verimli bir şekilde geçebilen bir reaktif olan dimer, floresan tat veya df tat kullanarak canlı hücrelere makromoleküller iletmektir. Bu, ilk olarak iletim ajanının üretilmesi ve saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak Dfta kullanılır.Dfta, ilgilenilen makromolekül yükü varlığında 37 °C'de bir saat boyunca hücrelerle inkübe edilir; df tat, yükün endositik veziküller içerisine alınmasını sağlar. Veziküller olgunlaşarak erken endozomlara dönüşür ve nihayetinde DF tat'ın yükü hücrelerinle sitozolik boşluğa bırakabildiği geç endozom aşamasına ulaşır. Ardından, detta ve ilgilenilen yükün iletim verimliliğini değerlendirmek amacıyla hücreler floresan mikroskobu ile görüntülenir.Sonuçlar, DF TT'nin hücrelere yüksek verimlilikle girebildiğini ve gözlemlenebilir birle sitotoksisite oluşturmadığını göstermektedir; floresan mikroskobisi ile gözlemlenebileceği üzere, DF tat farklı boyutlardaki makromolekülleri hücrelerin sitozolik boşluğuna iletebilmektedir. Bu tekniğin mevcut katı iletim yaklaşımlarına göre temel avantajı, iletim ajanımızın hücresel fizyoloji üzerinde gözlemlenebilir herhangi bir olumsuz etkisi olmadan yüksek bir iletim verimliliğine sahip olmasıdır. Ayrıca, yalnızca basit bir birlikte inkübasyon adımı gerektirdiği için kullanımı kolaydır.Başlamak için, FTA sentezi için 500 miligram R amid, MBHA reçinesi ve dimetilformamid veya DMF'yi standart 50 mililitrelik bir SPPS kabında bir saat boyunca şişirin; reaksiyonu, reaksiyonu kabarcıklanacak kadar azot gazı kullanarak oda sıcaklığında gerçekleştirin. Her bir amino asit kenetlenme reaksiyonu için metin protokolünde listelenen FM korumalı amino asitlerin her birinden 1,2 milimol kullanarak Rink amid MBHA reçinesi üzerinde FTA sentezleyin. Ayrıca 0,44 gram HBTU ve DMF içinde çözülmüş 0,51 mililitre DIEA ekleyin; her bir amino asit kenetlenme reaksiyonunu dört saat boyunca gerçekleştirin, dört saatlik kenetlenmeyi takiben.Reçineyi DMF ile yıkayın ve metin protokolünde açıklandığı şekilde FD koruma adımını gerçekleştirin. FTA'nın lineer peptit zinciri sentezlenene kadar işlemi tekrarlayın. Ardından, reçineyi 20 mililitre %1 trifloroasetik asit (TFA) ve %2 triizopropilsilan (TIS) içeren DCM çözeltisi ile beş dakika inkübe ederek MTT koruyucu grubunu uzaklaştırın.MTT koruyucu grubunun uzaklaştırılması sarı bir renk oluşumuyla sonuçlanacağından, rezin ara aşamalarda DCM ve DMF ile yıkanarak sarı renk gözlemlenmeyene kadar bu işlem tekrarlanır. Rezin üzerine, artık MTT uzaklaşmadığından ve çözeltinin berrak kaldığından emin olmak için DCM içinde %1 TFA içeren ek bir çözelti ekleyin.Ardından, T-M-R-H-B-T-U ve DIEA'yı DMF içerisinde çözün ve bu karışımı reçineye ekleyin. Fmoc koruması ve amino asit konjugasyonu sonrası karıştırmayı sağlamak için kuru nitrojen kullanarak reaksiyonu gece boyunca sürdürün. Reçineyi DCM ile yıkayın ve peptidin reçineden tamamen ayrılması için kurumaya bırakın.Küresel derin koruma ve reçineden koparma işlemini gerçekleştirmek için, peptidil reçinesine %92,5 TFA, %2,5 su, %2,5 TIS ve %2,5 etan ditiyol içeren bir çözelti ekleyip oda sıcaklığında üç saat bekletin. Hazırlanan çözeltiyi 40 mililitre etil eter içine boşaltarak, soğuk anhidroz etil eter yardımıyla ham peptid ürünlerini çöktürün. Bu karışımı dört santigrat derecede ve 4.000 G'de 20 ila 25 dakika boyunca santrifüjleyin.Çökeltinin soğuk anhidrat etil eter ile yıkanmasını sağlamak için bu adımı tekrarlayın. Çökeltileri su içinde süspande edin, liyofilize edin ve ardından elde edilen ürünleri %0,1 sulu TFA ACEDONITE denemesinde yeniden süspande edin. Analitik bir C 18 kolon ile yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC analizi gerçekleştirin.Her bir peptidi analiz etmek için, dakikada bir mililitre akış hızı ile 214 nanometre ve 550 nanometre dalga boylarında deteksiyon kullanın. Ardından, peptid saflaştırması için C 18 kolonda yarı preparatif HPLC uygulayın. Tüm analizler için dakikada dört mililitre akış hızı ve 214 nanometre ile 550 nanometrede deteksiyon kullanın.Oksidasyon reaksiyonunu gerçekleştirmeden önce doğrusal gradyanlar kullanın. Peptitlerin doğru kimliğini, üretici protokolüne uygun olarak MALDI ile doğrulayın. FTA'yı havalandırılmış fosfat tamponlu salinde çözün.pH değerinin 7,0 ile 7,5 arasında olduğundan emin olun. Peptit ilavesinden sonra, reaksiyonun tamamlanması için karışımı gece boyunca inkübe edin. Ürünü ters faz HPLC kullanarak saflaştırın ve kütle spektrometrisi ile analiz edin; ardından saflaştırılmış DF tat'i liyofilize edin ve konsantrasyonu ölçmek için 200 µL su içinde yeniden süspanse edin.İlk olarak, saflaştırılmış DF tat'in bir alikotunu 149 µL 50 mM TCEP çözeltisi içinde süspanse edin ve örneğin yaklaşık 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin. Bu adımda, TMR flor 4 ve DF tat'in birbirine yakınlığı nedeniyle meydana gelen absorbans sönümlenmesini gidermek için DF tat, monomer karşılığı olan F tat'e indirgenir. Tüm çözeltileri kuvars bir küvete ekleyin ve 556 nm'de absorbansı ölçün.Beer yasasını kullanarak çözeltinin konsantrasyonunu belirleyin. Bu değer fta konsantrasyonuna karşılık gelmektedir.dfta konsantrasyonunu elde etmek için FTA konsantrasyonunu ikiye bölün. Hücreleri, %5CO2 içeren 37 degrees Celsius sıcaklığındaki nemlendirilmiş bir atmosferde, %80 ila %90 konfluense ulaşana kadar uygun bir besiyerinde büyütün; ardından hücreleri 200 microliters PBS ile üç kez ve bir kez NRL 15 ile yıkayın. Endozomal sızıntıyı indüklemek için hücreleri, geliştirilmiş yeşil floresan protein gibi kargolarla veya kargosuz olarak beş micromolar df tat ile inkübe edin ve inkübasyon sonrası bir saat boyunca 37 degrees Celsius sıcaklıkta tutun.Hücrelerin plazma membranına bağlanan DF tat'i uzaklaştırmak için hücreleri L 15 ortamındaki heparin ile üç kez yıkayın. Son adım olarak, F TAT ve D ftt arasındaki farkı değerlendirmek için kırmızı floresan protein veya RFP filtresi kullanarak bir floresan mikroskobu ile DF tat'in görüntülemesini yapın. Peptidlerin hücresel lokalizasyonlarındaki farkı belirlemek için HeLa hücreleri her bir peptid ile inkübe edilir.Burada gösterildiği gibi, FTA noktasal bir dağılım sergiler. Bu dağılım, peptidin endozomlar içinde hapsolmuş olduğuyla tutarlıdır. Buna karşılık, dfta'nın floresan sinyali sitozol ve çekirdek boyunca homojen bir dağılım gösterir.DF tat'ın sitozolik dağılımı, bir dizi farklı hücre hattında gözlemlenir. 20x görüntüler, bir kapta çok yüksek bir yüzdenin, hücresel toksisite olmaksızın DF tat'in sitozolik dağılımı sergilediğini göstermektedir; bu durum, dfta aracılı endozomal sızıntının büyük proteinleri hücrelerin sitozolüne iletip iletmediğini belirlemek için yapılan cyt blue nükleer boyamasında görülmüştür. Doğru katlanmış proteinin iletimini tespit etmek için EGFP kullanılmıştır.EGFP, gözlemlenebilir bir toksisite olmaksızın hücrelerin %90'ından fazlasında DF tat için gözlemlenene benzer şekilde, sitozolik ve nükleer bir yeşil floresan dağılım göstermiştir. Bu prosedürü uygularken, hücrelerin aşırı konflu olmaması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ayrıca, df tap eklemeden önce FPS'yi uzaklaştırmak için hücreler iyice yıkanmalıdır.

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Bu protokol, büyük unilamellar lipid veziküller içine peptid translokasyonu kantitatif ölçmek için bir yöntem. Bu yöntem ayrıca membran translokasyon oranı hakkında bilgi sağlar ve çift katlı lipit katmanını etkin ve kendiliğinden geçtiğini peptidler tanımlamak için kullanılabilir.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

Bu videoda, bakteriyel efektör proteinlerin elektroporasyon yoluyla memeli hücrelerine girişini gösteriyoruz. Bakteriyel efektör proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, spesifik florofor konjuge antikorlarla boyamayı takiben konfokal mikroskopi ile tespit edilir.

Bakteriyel Efektör Proteinlerin Elektroporasyon ile Memeli Hücrelerine Sokulması

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için sistemin nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı adımlar sağlar.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Bu hücre Penetran dizileri birleştirme biotin avidin açılan yenilik ile tabanlı sisteme intraselüler protein-protein etkileşimleri çalışmaya bir protokoldür. Ana avantajdır hedef sıra canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe ve bu nedenle etkileşimleri hücresel bağlamı içinde ortaya çıkar.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Biz algılama deterjan-duyarlı sıralama reseptör, sortilin, GLUT4, glukoz taşıyıcı protein ilk luminal döngü için bağlama örnek olarak kullanarak zar proteinleri arasında bir köprü işlevi için bir iletişim kuralı tanımlamak.

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Boncuk yükleme, bağlı memeli hücrelerine proteinleri, plazmidleri ve parçacıkları tanıtır. Bu hücre yükleme tekniği ucuz, hızlıdır ve hücre sağlığını önemli ölçüde etkilemez. Canlı hücre görüntüleme için en uygun olanıdır.

Boncuk, Proteinleri ve Nükleik Asitleri Yapışan İnsan Hücrelerine Yüklüyor

Öğrenin, endosomolitik reaktif dfTAT kullanarak canlı memeli hücrelerine protein ve hücre geçirmez küçük moleküllerin teslimatını. Bu yöntem, sitotoksisite olmadan yüksek verimlilik sağlar.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi (Video) | JoVE Journal

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Daha fazla video keşfet