Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Bu makale, dolaşımdaki tümör hücrelerinden (CTC'ler) prostat kanseri hastasından türetilen ksenogreftler (PDX'ler) oluşturmak için kullanılan bir yöntemi detaylandırmaktadır. CTC'lerden PDX modellerinin oluşturulması, prostat kanserini incelemek için alternatif bir deneysel model sağlar; En sık teşhis edilen tümör ve erkeklerde kanserden sık görülen bir ölüm nedenidir.

Aşağıdaki protokolün genel amacı prostat kanseri oluşturmaktır. Hasta, dolaşımdaki tümör hücrelerinden elde edilen ksenogreft. Bu, ilk olarak ilerlemiş prostat kanseri olan hastalardan periferik kan toplanarak elde edilir.

İkinci adım olarak, dolaşımdaki tümör hücrelerini içeren kan mononükleer hücre bölmesi izole edilir. Daha sonra, mononükleer hücreler bir CD 45 ZI antikoru ile boyanır Akış sitometrisi kullanılarak dolaşımdaki tümör hücrelerini seçmek için, hücreler daha sonra bağışıklığı baskılanmış farelere enjekte edilir. Sonuçlar, prostat kanseri hastalarının periferik kanından akış sitometrisi ile izole edilen dolaşımdaki tümör hücrelerinin enjeksiyonuna dayalı olarak prostat kanseri ksenogreftlerinin oluşumunu göstermektedir.

Bu yöntem, prostat kanserinin moleküler karakterizasyonu ve yeni biyobelirteçlerin geliştirilmesi için kullanılabilecek yeni deneysel modeller üreterek prostat kanseri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvardan bir öğrenci olan Williams ve Mount Sinai'deki onkoloji bölümünden bir araştırmacı olan Omada olacak Metastatik prostat kanseri olan seçilmiş hastalardan tam kan toplamaya başlamak için, çünkü periferik kanlarında çok sayıda dolaşımdaki tümör hücresine sahip olma potansiyeline sahiptirler. 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, tam kanı Hank'in denge tuzu çözeltisi ile birlikte 50 mililitrelik polistiren konik bir tüpe aktarın.

Bire bir oranda, karışımı homojen hale getirmek için hafifçe pipetleyin. Daha sonra, boş bir 50 mililitre polistiren konik tüpe 15 mililitre FI çağrı paketi çözeltisi ekleyin. Seyreltilmiş tam kandan 20 mililitre hafifçe pipetleyin ve belirgin bir üst tabaka oluşturmak için çözeltinin üstündeki en düşük ayarı kullanın.

Daha sonra tüpü 30 dakika boyunca 400 Gs'de santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, ayrıldıktan sonra çözeltilerin karışmasını önlemek için santrifüjün yavaşlamasını en düşük ayara getirin. Santrifüjlemeyi takiben, periferik kan mononükleer hücrelerinin ince, beyaz, gri şeridini ve plazma üst tabakası ile ayırma çözeltisi arasına sıkışmış dolaşımdaki tümör hücrelerini tanımlayın.

Tüpün dibinde, hücreleri beyaz gri şeritten dikkatlice toplayın ve bunları 50 mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın. Plastik bir transfer pipeti kullanarak Hank'inkini ekleyin. Toplam 10 mililitre hacim için izole edilmiş hücrelere tuz çözeltisini dengeleyin.

Karışımı tekrar 400 Gs'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Hücreleri yıkamak için, süpernatanı çıkarın ve bu yıkamayı tekrarlayın. Bir kez daha adım atın.

İkinci yıkamanın ardından süpernatanı atın. Kalan peleti beş mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda askıya alın ve çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, numuneyi oda sıcaklığında üç dakika boyunca 400 Gs'de santrifüjleyin ve süpernatanı atarak lizis tamponunu çıkarın.

Son olarak, boyamadan önce peleti% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bir hemo, sitometre veya otomatik hücre sayacında standart trian mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücrelerin sayısını ölçün. Daha sonra hücreleri% 10 FBS ile PBS'de mililitrede 1 milyon hücreye seyreltin ve bir saat boyunca buza koyun.

Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için, hücre süspansiyonunu iki ayrı tüpe dağıtın. Kontrol tüpündeki kontrol hücreleri için bir tüpü ve CD 45 boyama hücreleri için bir tüpü etiketleyin. IgG, bir ila 250 arasında bir seyreltmede, mililitre başına 10 nanogramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin.

CD 45 boyama tüpünde. Mililitre başına 10 nanogram aynı konsantrasyonda CD 45 ZI konjuge primer antikor ekleyin ve hücre süspansiyonlarını 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede üç dakika boyunca 400 Gs'de santrifüjleyin ve ardından snat'ı atın.

Her bir peleti% 10 FBS ile desteklenmiş steril PBS'de askıya alarak hücreleri iki kez yıkayın, ardından dört santigrat derecede üç dakika boyunca 400 Gs'de santrifüjleyin. Resus'u yıkadıktan sonra, hücreleri mililitre başına 10 mikrogram içeren bir mililitrelik PBS çözeltisinde askıya alın. Herhangi bir hücre kümesini veya kalıntısını dışlamak için nihai çözeltiyi 35 mikrometre süzgeç kapaklarından 12 milimetreye 75 milimetre polistiren tüplere süzün.

Daha sonra, CD 45 pozitif hücreleri ve ölü hücreleri, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi çıkarmak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını kullanarak süspansiyondan çıkarın. Sıralanan prostat tümör hücresi süspansiyonunu hücre dışı matriks proteinleri ile bire bir oranında karıştırın ve karışımı buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, sekiz ila 10 haftalık bir erkek immün yetmezliği olan bir ağzı, dakikada bir litre oksijende% 5 inhale izoflor kullanarak kurumsal yönergelere uygun olarak uyuşturun.

Farede kornea ve ayak parmağı refleks kaybını kontrol ederek uygun anesteziyi sağlayın. 25 gauge iğne ve bir mililitrelik bir şırınga kullanarak 250 mikrolitre hücre süspansiyonu çizin. Daha sonra, deri altı nodüler yoğunlukların büyümesi için fare enjeksiyon bölgelerinin haftalık palpasyonunu gerçekleştirerek, hücre dışı matris hücre süspansiyonunun tüm hacmini deri altından fare monitörü tümörlerinin her iki üst tarafına enjekte edin.

Bu protokolde kullanılan negatif seçim yöntemine dayanarak, DAPI boyası kullanılarak ölü hücrelerin dışlanması gerekir. Burada gösterildiği gibi, kalan canlı hücrelerden CD 45 negatif hücrelerin yüzdesi değişkendir ve hastanın tümör yüküne bağlıdır, ancak CD 45 pozitif hücrelerden kolayca ayrılır. Uygun geçit kullanıldığında, prostat tümör hücresi süspansiyonunun implantasyonunu takiben, farenin her iki tarafında deri altı nodüler yoğunluklar görünür hale gelecektir.

Her nodüler yoğunluk, ksenogreft büyümesini temsil eder ve farenin dorsal kas sisteminden çıkıntı yaptığı ve doku olarak daha sıkı olduğu için sağlıklı dokudan farklı olarak takdir edilebilir. Dolaşımdaki tümör hücrelerinden üretilen hasta kaynaklı ksenogreft modelleri, ksenogreftler oluşturulduktan sonra hemat, toin ve eozin boyaması ve androjen reseptörü ve prostat spesifik membran antijeni gibi prostat spesifik hücresel belirteçler için immünohistokimya ile görüldüğü gibi insan prostat tümörlerini özetlemektedir. Prostat kanserinin agresifliğine katkıda bulunan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için gen veya protein ekspresyon profili oluşturma gibi diğer protokoller yapılabilir.