Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

Evans Blue Boyası ve Fitzy Dekstrin ortak kardinal ven enjeksiyonunun genel amacı, çeşitli kas distrofisi alt tipleriyle ilgili hastalığa neden olan mekanizmaların karakterize edilmesine yardımcı olmak için canlı zebra balıklarında iskelet kası membran bütünlüğünü gözlemlemektir. Evans Blue boyası enjeksiyonu, kas distrofisi hayvan modelleri karakterize edilirken hastalık patolojisine katkıda bulunan biyolojik mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir; ayrıca hastalık tedavisi için potansiyel terapötik mekanizmalar konusundaki anlayışımıza katkıda bulunabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı zebra balıkları kullanılarak gerçekleştirilebilmesi ve analiz edilebilmesidir.

Ek olarak, Fitz Dextrin'in birlikte enjeksiyonu, başarılı enjeksiyon için bir kalite kontrolü sağlayarak titizliği ve nicelleştirmeyi artırır. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, kas hastalığı zebrafish modellerinin validasyonundaki kullanışlılığı ile ilgilidir. Ayrıca, belirli mutasyonların musküler distrofi gibi kas hastalığı fenotiplerine nasıl yol açtığına dair anlayışı geliştirirler ki bu durum, tedavi ve çarelerin bulunması için kritik öneme sahiptir.

Agar enjeksiyon plakalarını hazırlamak için, %2 ila 3'lük agar içeren E üç ortamını kaynatın ve çözeltinin tezgah üzerinde hafifçe soğumasını bekleyin. Soğumuş agar çözeltisinden her bir 100 milimetrelik kaba yaklaşık 35 mililitre dökün. Ardından, tercih edilen enjeksiyon kalıbının bir ucunu çözeltiye yerleştirin ve kalıbın geri kalan kısmını agar çözeltisinin üzerine yatırın.

Agro çözeltisinin oda sıcaklığında veya 4 °C'de yaklaşık 30 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Ardından, kalıbın bir ucunu katılaşmış agrolardan ayırmak için bir spatula kullanın ve kalıbın geri kalanını yavaşça çıkarın. 1x ringer çözeltisi içinde %1'lik Evans Blue Boyası veya EBD stok çözeltisi hazırlayın.

Ardından, bir x ringer çözeltisi içinde Fitzy Dekstrin stok çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Enjeksiyon karışımını hazırlamak için EBD'yi doğrudan Fitz Dekstrin stok çözeltisi içinde %0,1'e seyreltin; enjeksiyon karışımını iyice vorteksleyin ve enjekte etmeden önce tüpü alüminyum folyo ile sararak doğrudan ışıktan uzak tutun. Enjeksiyon plakasını oda sıcaklığına kadar önceden ısıtın.

Mikromanipülatörü bir metal plaka üzerine yerleştirin ve enjeksiyon mikroskobunun yanına konumlandırın. Hava tahrikli mikroenjeksiyon kontrol cihazını açın. Ardından, yaklaşık 2-4 µL EBD karışımı ile enjeksiyon iğnesini geri doldurun.

Ardından, yaklaşık beş nanolitre EBD karışımı ile enjeksiyon hacmini kalibre edin. Daha sonra enjeksiyon plakasını ıslatmak için bir x ringer çözeltisi kullanın ve kuyucuklardaki fazla çözeltiyi uzaklaştırın; cam pipetle enjeksiyon yapmadan önce larvaları tamamen immobilize etmek için onları bir x ringer çözeltisinde seyreltilmiş %0,04 trica ile ön işlemden geçirin. Anestezize edilmiş larvaları, tamamen yan tarafları üzerine yatmış olacak şekilde auger enjeksiyon plakalarının kuyucuklarına yerleştirin.

Kuyu içindeki larva hareketini en aza indirmek için fazla trica çözeltisini uzaklaştırın, ancakdehidrasyonu önlemek için yeterli miktarda bırakın. Larvaların bulunduğu enjeksiyon plakasını bir disseksiyon mikroskobuna yerleştirin ve EBD içeren enjeksiyon pipeti iğnesini konumlandırın. Zebrafish larvasının kalp bölgesinin yakınında ve anterior-posterior eksenden yaklaşık 45 derece açı ile karışım yapın.

Enjeksiyon iğnesini, vena cardinalis communis'e (CCV) veya venin başlangıçta dorsal yöne döndüğü yumurtanın anterior kısmına yakın olan ortak kardinal vene yerleştirin. Ardından, beş nanolitre EBD karışımı enjekte edin ve enjeksiyon iğnesini beş ila sekiz saniye boyunca konumda tutun. EBD karışımının anında sızmasını en aza indirmek için, başarılı bir enjeksiyonda boya kalp odacıklarında görülmelidir; gerekirse işlem tekrarlanabilir.

Başarılı bir enjeksiyondan hemen sonra kalpte EB DMX görülmezse, embriyo burada gösterildiği gibi vaskülatürde Fitz Dextrin biriktirecektir. İstenen sayıda larva enjekte edildikten sonra, sağkalım oranını artırmak ve sinyal gücünü korumak için larvaları 100 millimeter kaplardaki trica içermeyen 1 x ringer çözeltisine geri döndürün. Kapları alüminyum folyoya sarılı tutun.

Verimli EBD alımını sağlamak için larvaları 28.5 °C'de dört ila altı saat inkübe edin. Kaslardaki EBD'yi görselleştirmek için, larvaları kırmızı floresan altında incelemeden önce anestezi yapmak amacıyla %0.04'lük trica kullanın. EBD, 3D PF aşamasındaki Sapia homojen mutantların ve yabani tip kardeşlerin CCV'sine burada gösterildiği gibi kalp odacıklarını dolduracak şekilde enjekte edilmiş; ardından damar sistemindeki fitzy dekstrin yeşil floresan altında görselleştirilerek başarılı boya perfüzyonu açısından analiz edilmiştir.

Dört saatlik inkübasyon süresinin ardından, EBD alımı bu şekildeki figürde gösterildiği gibi somit düzeyinde incelenmiştir. Yaban tipi kardeşlerde görünür herhangi bir kas lifinde EBD floresansı gözlemlenmezken, sapia homozigot mutantlar kas membranında hasara işaret eden EBD alımı göstermiştir. Zebrafishlerin ortak kardinal venine yapılan Evans mavi boya enjeksiyonunda yetkinlik kazanıldıktan sonra, larvalara uygulama, enjekte edilen larva sayısına bağlı olarak 30 ila 60 dakika içinde tamamlanabilir.

Ek olarak, yetkinliği sağlamak amacıyla deneysel sonuçlar tek bir günde elde edilebilir. Tutarlı ve yorumlanabilir sonuçlar üretmek için kardinal vene dikkatlice nişan almanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu işlem zorlayıcı olabilir ve bu prosedürü uygularken muhtemelen pratik gerektirecektir.

Kas distrofisiyle ilişkili membran hasarından sorumlu moleküler mekanizmaları belirlemek amacıyla, kimyasal ve genetik taramalar gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu deneyler, kas hastalıkları için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu teknik, kas hastalığı araştırmaları alanındaki araştırmacıların, kas distrofisi zebrafish modellerinde membran bütünlüğünü incelemelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, zebrafish larvalarının common cardinal venine Evan's blue boyasının nasıl enjekte edileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, lifler içindeki Evan's blue boyasının varlığı sayesinde, membran hasarı oluşmuş kas liflerinin nasıl tanımlanacağını da anlamalısınız.