Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sağlam ve hidrate hücrelerin plazma membranındaki epidermal büyüme faktörü reseptörlerinin veya EGFR'lerin dağılımını ve stokiyometrisini floresan ve elektron mikroskobu ile görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle merkezde yer alan bir pencere alanını kaplayan 50 nanometre ince silikon nitrür membrana sahip mikroçipler üzerinde cos seven gibi EGFR eksprese eden hücrelerin büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından hücreler, reseptöre bağlanan ve EGFR'nin konformasyonunu değiştirerek dimerizasyona ve aktivasyona yol açan biyotinize edilmiş bir epidermal büyüme faktörü ile inkübe edilir.

Ardından, reseptörleri immobilize etmek amacıyla hücreler fikse edilir ve EGF ile aktive edilmiş reseptörlere bağlanan, strip edilmiş Hagen konjuge kuantum noktaları ile inkübe edilerek hücrelerin görüntülemesi yapılır. Son olarak, glutaraldehit ile yapılan ikinci bir fiksasyon, strip edilmiş habit konjuge kuantum noktalarını EGFR ile çapraz bağlar ve numuneyi elektron mikroskobu için stabilize eder. Sonuçlar, floresan kuantum nokta görüntülemesi aracılığıyla kırmızı floresans emisyonunu ve taramalı geçirimli elektron mikroskobu aracılığıyla EGFR dağılımını ve stokiyometrik durumunu veya kümelenmesini göstermektedir.

Bu yöntem, sağlam hücrelerdeki membran reseptörlerinin stok geometrisi ve dağılımı hakkında benzersiz bilgiler sağlar; normal ve kanser hücrelerinde epidermal büyüme faktörü reseptörünün aktivasyonuna dair içgörü elde etmek için kullanılabilir. Ayrıca, iyon kanalları gibi diğer membran reseptörlerini incelemek için de uygulanabilir. Başlamak için bir kimyasal çeker ocak altında çalışın. Silikon nitrür membran mikroçiplerinin ilk hazırlık aşamaları için ve metin protokolüne uygun olarak asetona daldırdıktan sonra, mikroçipleri doğrudan bir etanol beherin içine aktarın ve iki dakika bekleyin, ardından çipleri etanolden çıkarıp temiz oda mendili üzerine yerleştirin.

Çipler kuruduğunda, onları daha önce bir Petri kabına yerleştirilmiş olan bir lam üzerine aktarın. Ardından, kabın kapağını kapatın. Sonrasında, mikroçiplerin bulunduğu lamı bir plazma temizleyiciye yerleştirin.

Silikon nitrür membranın yüzeyini hidrofilik hale getirmek için beş dakikalık standart bir temizleme programı çalıştırın. Ardından, laminar akışlı ön kaporta altında, mikrochipleri camdan aktarın. Mikrochipleri, poly L lysine çözeltisi veya PLL ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna yerleştirmeden önce temiz oda mendili üzerine kaydırın ve beş dakika inkübe edin.

Ardından mikroçipleri tek tek, HPLC grade su içeren ikinci bir kuyuya aktarın ve ardından ikinci bir su kuyusunda durulayın. Son olarak, mikroçipleri tek tek 96 kuyucuklu bir plakanın DM ile doldurulmuş kuyucuklarına yerleştirin ve plakayı COS yedi hücreli subkültür kullanarak bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Yaklaşık beş x 10⁵ konsantrasyonunda monodisperse bir hücre süspansiyonu hazırlayın.

Mililitrede beş hücre. Hücre süspansiyonundan bir damlayı 96 kuyucuklu plaka içindeki her bir mikroçipe ekleyin ve ters mikroskop altında oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. 150 by 400 µm pencere başına yaklaşık 20 ila 30 cos seven hücre yoğunluğu elde etmek için mikroçiplerin bölgelerini incelemeye başlayın.

Hücreler yeterince yapıştığında, mikroçipleri hücre aralıkları yukarı gelecek şekilde dm içeren yeni kuyucuklara dikkatlice aktarın. Yeterli sayıda hücre yapışık kaldığında, mikroçipleri hücreler yukarı bakacak şekilde serumsuz dmm içeren yeni kuyucuklara aktarın. Ardından, sonraki adımlar için mikroçipleri bir karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de birkaç saatten bir geceye kadar inkübe edin.

96 kuyucuklu plakayı kullanarak kuyucukları gerekli solüsyonlarla doldurun ve her mikroçip için bir satır veya sütun kullanın. Mikroçipleri taze B-S-A-G-E-L-P-B-S içeren bir kuyucuğa yerleştirerek durulayın ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Hücrelerin EGF etiketli egfr'yi endosite etmeye başlayabilmesi için mikroçipleri 300 nM EGF biyotin solüsyonuna aktarın ve üç dakika boyunca tekrar inkübatöre yerleştirin.

Mikroçipleri PBS kullanarak hızlıca üç kez durulayın. Ardından örnekleri durulamak için 0,1 molar kate tamponu veya CB kullanın. Sonrasında mikroçipleri %3 PFA içerisine aktarın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.

Bir kez CB ve üç kez PBS ile duruladıktan sonra, çipleri G-L-Y-P-B-S içerisine aktarın ve iki dakika boyunca inkübe edin. Ardından PBS kullanarak iki kez durulama yapın. Şimdi, mikroçipleri B-S-A-P-B-S ile dört kez durulamadan önce 10 NANOMOLAR S-T-R-Q-D içerisinde 10 dakika boyunca bekletin.

Ardından, hücreleri DIC ve floresan mikroskopisi ile görüntülemek için, oda sıcaklığında B-S-A-P-B-S ile önceden doldurulmuş cam tabanlı 35 milimetrelik bir kaba bir mikroçip daldırın. QD 6 55 ile işaretlenmiş hücrelerin genel görüntüleri için 40 x hava objektifi kullanın. Kuantum noktalarını 340 ile 380 nanometre arasında uyaran ve 420 nanometrenin üzerinde emisyon sağlayan bir filtre küpü kullanın.

Numuneye zarar verebilecek aşırı ışık yoğunluğunu önlemek için ışık şiddetini minimuma indirin. Tüm QD'lerin sinyallerinin yakalanabilmesi için pozlama süresini en az 300 milisaniyeye ayarlayın; QD floresans yanıp sönmeleri sırasında, ışık şiddetini minimumda tutarken görünür görüntü gürültüsü olmadan parlak görüntüler elde etmek için ışık yoğunluğunu ve amplifikasyonu ayarlayın. Görüntüleme işleminden sonra, mikroçipi B-S-A-P-B-S içeren bir 96'lık duvar plakasına geri yerleştirin.

Bir kez cb ile durulayın, ardından %2 glutaraldehit transfer edin ve sonrasında 10 dakika inkübe edin. Mikroçipi üç kez yıkamak için B-S-A-P-B-S kullanarak yıkayın ve CB uygulayın; her bir mikroçip için yeni bir 96 kuyucuklu plakanın önceden B-S-A-P-B-S ile doldurulmuş kuyucuklarında saklayın. Dört kuyucuktan oluşan bir sırayı HPLC grade su ile doldurun.

Metin protokolüne uygun olarak ESEM kurulumunu tamamladıktan sonra, 96 WAT plağını soğutma kabından çıkarıp açık olan ESEM tablasının yakınına yerleştirerek pre-COOL ESEM STEM tablasına bir numune yükleyin. Yanına temiz oda mendili koyun. Bir mikroçipi, HPLC grade su ile dolu bir kuyucuğa her biri bir saniye sürecek şekilde dört kez daldırarak hızlıca durulayın.

Mikroçipin arka tarafını doku üzerinde hafifçe kurulayın ve mikroçipi, 3 µL soğutulmuş HPLC grade su içeren ön soğutmalı sahneye yerleştirin. Numunenin yüzeyini ıslatın ve numuneyi sahneye sabitleyin. Ardından, sahneye numunenin yakınına üç adet ek 3 µL su damlası yerleştirin ve örnek haznesini kapatın.

İlgilenilen bir hücre belirlendikten sonra, metin protokolüne uygun olarak hücrenin bir STEM genel görüntüsünü kaydedin, hücre sınırının görünür olduğu bir çevre bölgesine geçin ve 50.000 X büyütmeye yakınlaştırın. Tekil qd'leri gösteren görüntüleri kaydedin; burada gösterilen 20 ila 30 mikrosaniye piksellerinde bekleme süreleri, sağlam ve tamamen hidrate edilmiş COS seven hücrelerde QD 6 55 ile işaretlenmiş membran bağlı EGFR'yi göstermektedir. Buradaki DIC görüntüsü hücrelerin membran topografyasını örneklendirmekte ve ilgili floresan görüntüsü, üç dakikalık EGF biyotin inkübasyonundan sonra tüm hücre yüzeyindeki EGFR dağılımını göstermektedir.

Bu düşük büyütmeli ESEM STEM görüntüleri, hücreden komşu hücrelere doğru uzanan filopodlar gibi ince yapıları ve hücrenin daha ince bölgelerinin içindeki bazı yapıları ortaya koymaktadır. Çekirdek de dahil olmak üzere kalın merkezi hücresel bölgeler, kullanılan enerjideki elektronların numuneden geçişi mümkün olmadığı için beyaz görünmektedir. Yüksek çözünürlük.

İnce periferik bölgelerin ESEM STEM görüntüleri, görüntüyü diyagonal olarak kesen bir membran katlanması üzerindeki QD etiketlerini göstermektedir. Bu membran yapısı, birkaç noktada çevreleyen membran bölgelerinden daha yüksek bir EGFR yoğunluğuna sahiptir ve iki etiket birbirine yakın konumdadır. 20 ve 24 nanometre mesafedeki iki örnek ok uçlarıyla belirtilmiştir.

Bu etiket çiftlerinin EGF Fers'e ait olduğu yorumlanmıştır. Bu görüntü, EGFR yoğunluğunun ve floresan sinyalinin daha düşük olduğu bir bölgeden kaydedilmiştir. Buna rağmen, EGFR burada da dimerler şeklinde bulunmuş ve 10 veya 11 EEG'den oluşan iki küme saptanmıştır.

Yöntem öğrenildikten sonra, numune hazırlama işlemi, elektron mikroskopisinde yaygın olarak kullanılan tekniklerden çok daha hızlı bir şekilde, iki saat içinde tamamlanabilir. Ardından gelen essem STEM görüntülemesi, yarım gün içinde 100'e kadar yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayabilir.