Name: Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin, formalin sabit parafin gömülü referans standart hücre hatlarından otomatik DNA izolasyonu ve dijital damlacık PCR ile BRAF V600E mutasyonlarının hassas tespiti yöntemini. Bu yaklaşım, moleküler onkolojide nadir mutasyonların güvenilir analizi için klinik uygulamalarda yüksek duyarlılık sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Science, ICT ve Gelecek Planlaması (Hibe No 2013M3C8A1075908) Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı Derneği için Ar-Ge Programı (UÇK) tarafından desteklenmiştir.

FFPE Referans Standart Hücre Hatları 1. DNA Ekstraksiyon Not: Bu işlem için, DNA izolasyonu, aşağıdaki protokolde tarif edildiği gibi FFPE Doku DNA izolasyon kiti kullanılarak FFPE referans standardı hücre hatları (HD598, HD593, HD617, HD273 ve vahşi tip (WT)) için yapıldı. Otomatik DNA ekstraksiyon toplam DNA izolasyonu için üreticinin yönergelerini izleyerek elde edildi. <ol><li> Bir mikrotom ve orijinal FFPE bloğunu kullanan, elle prosedürlere göre, önce, DNA ekstraksiyon ve analiz taze kesitler hazırlamak. Doku bölümünde (ler) için örnek bir giriş 10 um arasında kombine bir toplam kalınlığını aşmaz analiz emin olun ve yüzey alanı, tek bir bölüm için 600 mm 2 aşmamasına dikkat. </li></ol> 1.2 TPS protokolü Not: Tablo 1 &#39;de gösterilen birimleri 48 numune işleme için gereken minimum karşılık gelir ve prosedür,gösterilen TPS kurallarına uygundur. Deneye başlamadan önce otomatik programı sırasında örneklerin kaybını önlemek için, 600 x g&#39;de santrifüj e-tüp içinde FFPE örnekleri yerleşmek. <ol><li> Otomatik DNA izolasyonu enstrüman ve bilgisayarı açın. Run kontrol yazılımı açın ve TPS güverte yükleme alanı içine otomatik yük tepsi yerleştirin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, karşılık gelen olukları içine reaktifleri koyun. <ol><li> Numune taşıyıcı raflarına 4 örnekleri (BRAF WT BRAF V600E 50,% 5 ve% 1%) yerleştirin. </li><li> Sütunları 2 ve 3 teknelerde uç kutuları yerleştirin ve çalıştırın iptal edecek, ucu başına birden fazla filtre varlığını ipuçlarına bakın. </li><li> Onlara 3-5 kez ters yüz edilerek lizis tamponu ve yıkama tamponu uygun karışmasını sağlamak ve sütunda 4 (Şekil 1) ilgili olukları içine yerleştirin. </li><li> Birkaç kez veya hafif Vort için tersini sonraexing, (Şekil 1, Tablo 1) belirtilen yerlerde 1 yuva boş bırakarak, sütunda 5 küçük teknelerde elüsyon tamponu, manyetik boncuk ve FFPE tampon yerleştirin. </li><li> Plaka taşıyıcısı (Şekil 1) üzerine 2 ml derin kuyu plaka (DWP) yükleyin. </li></ol></li><li> Bir çalışma başlamadan önce aşağıdaki nihai adımları gerçekleştirin: <ol><li> Tüm tüpleri ve reaktif olukları şapkasını çıkarmak. Yeterli kapasite sıvı atık şişe mevcuttur onaylayın. Katı atık şişesi boş ve biyolojik tehlikeli bir çanta ile kaplı olduğunu doğrulayın. Ucu çıkarma plaka atık montaj merkezli olduğunu doğrulayın. </li><li> Ön kapağı kapatın. </li></ol></li><li> Yazılımını başlatın. NA_Prep_Main_MLSTARlet.med dosyasını açın. </li><li> Tıklayın &quot;Başlat&quot;. Enstrüman durumu çalıştıran boşta geçiş olacaktır. </li><li> Bu çalışma için örneklerin sayısını girin. Bu çalışma (DNA = 0) için istenen yöntemi seçin. İlk yüksek vol konumunu girinume ucu, tüm tepsiler doluysa &quot;1&quot; seçilmesi. Tüm tepsiler doluysa &quot;1&quot; seçilerek, ilk standart hacim ucunun konumunu girin. Not: Cihaz sonra kullanıcı müdahalesi olmadan otomatik adımlarda çalışacaktır. Ayrıntılı iş akışı Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Deney bittiğinde, reaktif atıklar ve ipuçları atık montaj enjekte edilir. </li><li> Florometrik bir yöntemi kullanarak saflaştırılmış genomik DNA ölçmek. Not: 3,3 ng / ul&#39;lik bir konsantrasyona az ihtiva eden DNA numuneleri ddPCR analizi (bölüm 2) tabi tutulur. </li></ol> 2. DNA Mutasyon profil: ddPCR Protokolü Not: 1) Damlacık nesil 2) Konvansiyonel PCR büyütmesi, 3) Damlacık okuma ve 4), DNA mutasyonu profilleme: DNA mutasyonu profilleme için protokol 3 büyük adımlardan oluşur. 2.1. Damlacık oluşturma Not: ddPCR Supermix olduğuBu karışım damlacık üretimi için gerekli olan reaktif içerdiğinden, ddPCR için önerilir. <ol><li> , Kontaminasyonu önlemek gibi bir temiz PCR kaput, temiz pipetleri ve düşük protein bağlama tüpleri kullanan, eldiven giymiş gibi standart önlemler, izleyin. </li><li> İnsan genomik DNA örneği minimum konsantrasyonu 3.3 ng / ml olduğundan emin olun. Not: saflaştırılmış DNA örneği konsantrasyonu miktarı% mutasyon sıklığı algılama analizine göre değişir. </li><li> 96 gözlü PCR plakaları içinde reaksiyon karışımlarını bir araya getirin. Çözülme ve oda sıcaklığına kadar reaksiyon bileşenlerini dengeye getirin. (Her saflaştırılmış DNA örneği (66ng / 2 ul), distile su ile 20 ul&#39;ye kadar yapmak, 2X ddPCR SuperMix (10 | il) ve 20 primerleri (ileri ve geri, 900 nM) ve sonda (250 nM) birleştirilerek PCR reaksiyonları hazırlayın ) damlacık jeneratör protokolü başına </li><li> Dağıtım önce tüpün alt kısmında içeriğini toplamak için homojenlik ve kısaca santrifüj sağlamak için iyice karışımı karıştırın. Yük 20 &amp; #181; damlacık oluşumu için kartuş üzerine l. </li><li> İmalatçının tavsiye ettiği protokole göre damlacık jeneratör çalışması, <ol><li> Sahibinin sol üst tarafına yerleştirilmiş kartuş içinde çentik ile tutucu içine kartuşu takın. Alt kuyulara ortasına örnekleri içeren bir reaksiyon karışımı 20 ul, ve jeneratör yağı 70 ul ekle. </li><li> Kartuşun üstünde conta takın. Conta sahibinin iki ucunda güvenli bağımlısı olduğundan emin olun; aksi halde, damlacık oluşturma için yeterli basınç elde edilemez olacaktır. </li><li> Cihazın üstündeki yeşil düğmeye basarak damlacık jeneratör açın ve kartuşu takın. Tutucu gücü (sağdan sola) ve tutucu (orta sağ) gösterge ışıkları yeşil, hem doğru konumda olduğunda. </li><li> Kapıyı kapatmak için tekrar enstrüman üst düğmesine basın ve damlacık nesil başlatırlar. Not: b bastıktan sonrabasıp bırakın, damlacıklar oluşturulan mikroakışkan kanallar aracılığıyla petrol ve örnekleri çizim çıkış kuyuları üzerinde manifoldu pozisyonları kendisi. Onlar birikir nerede Damlacıklar, iyi damlacık içine akar. 10 saniye damlacık nesil devam etmekte olduğunu göstermek için daha sonra damlacık gösterge ışığı (sağda) yeşil renkte yanıp söner. </li><li> Damlacık oluşturma tamamlandığında, 3 gösterge ışıkları katı yeşile; düğmesine basarak kapıyı açın ve üniteden tutucu çıkarın. Yuvasından atılan contasını çıkartın ve atın. Not: kartuşun üst kuyu damlacıkları içerir ve orta ve alt oyuklar kalıntı yağın küçük bir miktarı ile, hemen hemen boş olduğunda. </li></ol></li></ol> 2.2. PCR için Preparasyon <ol><li> Üreticinin aygıt protokolde belirtilen her bir numune için, tavsiye edilen bir 96-çukurlu PCR plaka tek bir kuyunun içine en iyi kartuşlardan damlacık içeriğinin 40 ul üzerinden pipetleyin. Hayırte: çok kanallı bir pipet kullanarak damlacıklar emülsiyon aktarmak için idealdir. Damlacıkların Yavaş ve nazik aspirasyon transferleri sırasında damlacık kesme aza indirmek için tavsiye edilir. </li><li> Hemen buharlaşmasını önlemek için damlacıkların aktardıktan sonra folyo ile PCR plaka mühür. PCR plaka kapatıcı ve damlacık okuyucu iğneler ile uyumlu delinebilir folyo plaka contaları kullanın. PCR plaka mühürleyen kullanım kılavuzunda yönergeleri izleyin. </li><li> 180 ° C plaka mühürleyen sıcaklığı ve 5 sn saati ayarlayın. </li><li> Tepsi kapıyı açmak için oka dokunun. 96-iyi tarafı yukarı bakacak şekilde tepsiye destek bloğu yerleştirin. Destek blok üzerine 96-plaka koyun ve tüm plaka kuyuları destek bloğu ile uyumlu olduğundan emin olun. </li><li> Delinebilir folyo mühür 1 levha ile 96-plaka örtün. 96-plaka destek bloğu üzerinde güvenli ve delinebilir folyo mühür ile kaplıdır sonra, mühür düğmesine dokunun. Tepsi kapanacakve ısı yalıtım başlatacaktır. </li><li> Isı yapıştırma işlemi tamamlandığında, kapı otomatik olarak açılır; Termal bisiklet için ısı bloğu plaka kaldırmak ve daha sonra ısı bloğu kaldırmak. </li><li> Plaka tüm kuyu folyo depresyonlar her bir üzerinde aşikar olduğu kontrol ederek sızdırmaz olduğundan emin olun. Mühürlü sonra, plaka, termal bisiklet için hazırdır. </li><li> Damlacıklar çıkarıldıktan sonra, açmak için kartuş tutucu üzerindeki mandalları basın. Boş kartuşu çıkarın ve atın. </li><li> Tablo 2&#39;de ayrıntılı parametreleri takip ederek geleneksel PCR gerçekleştirin. </li></ol> 2.3 Damlacık okuma (üreticinin tavsiye ettiği protokole göre) Not: damlacıklar halinde nükleik asit hedefin PCR amplifikasyonu takiben damla okuyucu cihaz tek bir 2-renk algılama sistemi 13 kullanılarak her damlacık analiz eder. Biz genellikle FAM algılayıp ayarlamakd VIC muhabiri floroforlar. <ol><li> Başbakan damlacık okuyucuya &quot;Flush sistemi&quot; tıklayın ve ddPCR analiz için hazır olun. </li><li> Damlacık okuyucu plaka yükleyin ve tıklayın &quot;start&quot;. Damlacık okuyucu, her bir örnek aspire damlacıkları singulates ve 2 renkli dedektörü geçmiş bunları tek dosyaya akarsu. Dedektör olumlu ve olumsuz örnekleri numaralandırmak damlacıkları okur. </li><li> Damlacık okuma tamamlandığında, kapıyı açmak ve üniteden plaka tutucu çıkarın. Sahibinden 96-PCR plakasını çıkarın ve atın. </li><li> Doğru bakım için, damlacık okuyucu yağı yerine ve gerektiğinde atık yuvasını boşaltın. Mikrobiyal büyümeyi önlemek için atık şişeye% 10 çamaşır suyu 50 ml ekleyin. </li></ol> 2.4 DNA mutasyonu profilleme (üreticinin tavsiye ettiği protokole göre) Not: PCR pozitif ve PCR-negatif damlacıkları mutlak quantific sağlamak için sayılırveri analiz yazılımı kullanılarak dijital formda, hedef BRAF V600E DNA mutasyonlarının asyon. <ol><li> Numuneler, tahliller ve deneyler hakkında bilgi girmek için Kur&#39;u tıklatın. </li><li> Kurulumu penceresinde, bir tabak (filename.qlp) yüklemek, sonra verileri açıp analiz analiz tıklatın. Sonuçlar Tablo, Kuyu Seçici ve İşlenmiş Data / Grafik Ekran: Veri analizi arayüzü üç pencere ayrılır. </li><li> İşlenmiş Veri penceresinde, her hedef için konsantrasyon veri plakası haritası kuyularda görünür ve Sonuçlar Tablo tabloda gösterilmektedir. Konsantrasyon araziler verileri görselleştirmek için Konsantrasyon tıklayın. </li></ol>

<ol><li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li>
<li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li>
<li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras%2FRaf%2F+MEK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+anti-cancer+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li>
<li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li>
<li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline%2C+%27definetherain%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological+methods%22%5BJournal%5D)">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li>
<li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943(2013).</li>
<li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li>
<li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+using+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li>
<li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li>
<li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+detection+and+quantification%22%5BJournal%5D)">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li>
<li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li>
<li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li>
<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim ve Young DEUG Kim ABION CRO çalışanlarıdır.

Burada, belirli bir gen mutasyonu değerlendirmesi için FFPE referans standardı hücre çizgisi örneklerinden ddPCR uygulanabilirliğini ve DNA izolasyonu vurgulayın. Bu çalışmada, TPS otomatik DNA izolasyon yöntemi kolayca, otomatik adapte edilebilir kullanılır ve büyük ölçekli deneyler ve alt değişkenliği sağlayan, aynı anda 48 farklı örnekleri kapasitelidir. Mevcut çalışmada DNA izolasyonu sınırlamaları biri her FFPE örnek tektir ve yüzey kirleticiler, mikrobiyal flora birbirlerini değişecektir ve / veya insan genetik ar...

Kilit düzenleyici genlerde genetik mutasyon birikimi kanseri 1 giden, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma gibi normal hücre programlamayı değiştirir. RAS-RAF-MAP kinaz yolu, büyüme sinyallerine hücresel tepkileri aracılık eder. Onkogenik BRAF mutasyonlar 2 aşırı aktif olma onkoprotein BRAF neden olabilir BRAF genindeki mutasyonlar sürücüsü, kaynaklanabilir. BRAF genindeki mutasyonlar da sırayla, büyüme faktörü aracılığında düzenlenmesinin 4-6 bağımsız aşırı hücre büyümesi ve çoğalmasına neden, MEK ve ERK 3 aracılığıyla aşırı akış aşağı sinyal ile sonuçlanır. Bazı araçlar örneğin ddPCR tarafından formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) referans standardı hücre hatlarında kantitatif gerçek zamanlı BRAF V600E mutasyonlar gibi DNA mutasyonu profil mevcuttur. ddPCR mutlak ölçümü için bir PCR bazlı yöntemGeleneksel kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) 7,8 oranla daha yüksek doğruluk sunar. ddPCR aynı zamanda daha detaylı kanser araştırma ve tanı 9 sağlayan DNA şablonları nadir mutasyonların saptanması için güç ve doğruluk çözme daha içerir. Düşük şablon kopya sayıları 10-12 okuyan zaman geleneksel qPCR üzerinde ddPCR ek avantajları geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk içerir. Burada, otomatik ddPCR tarafından BRAF V600E mutasyonların varlığını veya yokluğunu tespit ederek, ardından FFPE referans standardı hücre çizgileri, DNA ekstre için bir protokol olduğunu göstermiştir. Veri analizi ve sonuçlarının grafik bir gösterimi için yazılım kullanımı da tarif edilmektedir. Tüm işlem nispeten basittir ve tamamen profilli numune sayısı ve mevcut klasik bir PCR ve ddPCR makineleri sayısına bağlıdır. Aşağıdaki protokol BR standart prosedürleri açıklar<html> AF V600E pozitif FFPE referans standardı hücre çizgileri (HD598, HD593, HD617, HD273 ve yabani tipteki (WT)) Doku Hazırlanması System (TPS) protokolü kullanılarak tam otomatik bir cihaz içinde gerçekleştirilir. Ardından, izole edilmiş DNA örnekleri ddPCR sistemi kullanılarak BRAF V600E mutasyonların varlığı için analiz edilir. Tüm örnekler profilli edildikten sonra hedeflenen mutasyon analizi yapılır ve veri veri analiz yazılımı içine yüklendi. Örneklerin sayısına bağlı olarak / grup çalışıldı, veri analizi bir ile birkaç saat gerekebilir. Metodolojinin deneysel bileşeni alınmasında doğruluk gerektirir <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Maya nükleik asitlerin izole bir vallahi Fen Bilgisi Öğretmenliği, video RNA bağlamında ilgili daha fazla açıklama">DNA</a> vesayısal hava Pipetler ve Pipet, pipetleme bağlamında ilgili daha fazla açıklayan bir jove Öğrenim Video &quot;&gt; 96 gözlü plakalara pipetleme veri analiz yazılımı kullanılarak yapılır ise.

<table><tbody><tr><td>Hamilton MICROLAB STARlet IVD cihazı</td><td>Siemens</td><td>10701001</td><td>Otomatik DNA izolasyon cihazı</td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Jeneratörü</td><td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Okuyucu</td><td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>Rampa süresi ayarı yapabilen konvansiyonel PCR makinesi</td><td>621BR17718</td><td></td>PX1 PCR plaka kapatıcı Bio-Rad 770BR1575 QuantaSoft yazılımı Bio-Rad DNA izolasyon kiti&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Doku Hazırlama Reaktifleri Kutusu 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632398</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Doku Hazırlama Reaktifleri Kutusu 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE ipuçları</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR mutasyon analizi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix&nbsp;</td><td>Biyo-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3010</td><td>2X konsantrasyon</td></tr><tr><td>DG8 kartuşu&nbsp;</td><td>Biyo-Rad&nbsp;</td><td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td>Damlacık Jeneratör yağı</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Conta</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>Damlacık okuyucu yağı</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

dijital damlacık pcr formalin sabit parafin gömülü referans standart hücre hatlarında braf v600e mutasyonları tespit etmek istihdam

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR, su-yağ emülsiyon sistemi kullanan oldukça hassas bir PCR yöntemidir. Bir damlacık üreteci kullanılarak, ekstrakte edilmiş bir nükleik asit numunesi ~ 20.000 nano boyutlu, yağda su damlacıklarına bölünür ve PCR amplifikasyonu tek tek damlacıklarda gerçekleşir. ddPCR yaklaşımı, dizi mutasyonlarını, kopya sayısı değişikliklerini ve hedeflenen genleri içeren yapısal yeniden düzenlemeleri seçmektir. Burada, kanserli bireylerin belirlenmesinde yardımcı olan, FFPE referans standart hücre hatlarındaki nadir BRAF V600E mutasyonlarını hassas bir şekilde ölçmek için güçlü bir teknik olarak ddPCR'nin kullanımını gösteriyoruz. Sonuç olarak, ddPCR tekniği, çeşitli FFPE örneklerinde farklı genlerdeki spesifik nadir mutasyonların kesin profilini çıkarma potansiyeli sunar.

Bizim ddPCR analizi için, biz BRAF V600E mutasyonu FFPE referans standardı hücre hatları okudu. Damlacık okuyucu dizüstü bilgisayar çalıştıran veri analiz yazılımı bağlanır. Her bir damlacık pozitif ya da negatif olarak flüoresan genlik bazında tanımlanır. Üretici tarafından sağlanan yazılım da kullanıcı tanımlı kesim pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki eşiği tanımlamak için girilmesine izin verir. Bir numune, pozitif ve negatif damlacık sayısıdır kopya / ul açısından hedef konsantrasyonunu hesaplamak içi...

Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Bu deneyin genel amacı, bir doku hazırlama sistemi kullanarak formalinle fikse edilmiş parafin gömülü referans standart hücre hatlarından insan genomik DNA'sını izole etmek ve ardından dijital damlacık PCR (ddPCR) yöntemiyle genomik DNA'daki BRAF V600E mutasyonlarını analiz etmektir. ddPCR, düşük kalıp kopya sayılarında nükleik asit kantifikasyonu ve BRAF sekans mutasyonunun varlığı ve bolluğu gibi moleküler onkolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem standart hücre hatları üzerinden gösterilmiş olsa da, ilgilendiğiniz DNA'yı izole etmek için koşulları optimize ettiğinizden emin olmak kaydıyla diğer biyolojik örneklerde de kullanılabilir.Bu doku hazırlama sistemi, diğer manuel prosedürlerle karşılaştırıldığında, dört saat içinde kontaminasyondan arındırılmış 48 adede kadar insan genomik DNA örneği izole etmek için kullanılabilir. Manyetik boncuk kullanımı nedeniyle bu sistemin hazırlık aşaması oldukça maliyetlidir. Bununla birlikte, daha güvenlidir ve yüksek kalitede ürün sağlar. İşlemin uygulaması, laboratuvarımızdan bir teknisyen tarafından gösterilecektir.DNA ekstraksiyonu, doku hazırlama sistemi veya TPS protokolü kullanılarak tam otomatik bir DNA izolasyon cihazında gerçekleştirilecektir. Cihazı ve bilgisayarı açarak başlayın. Çalıştırma kontrol yazılımını açın ve TPS güverte yükleme alanına bir otomatik yükleme tepsisi yerleştirin.Ardından, bu şekildeki görselde gösterildiği gibi reaktifleri karşılık gelen haznelere dağıtın ve dört örneği örnek taşıyıcı rafa yerleştirin. Lizis tamponu ve yıkama tamponlarının uygun şekilde karıştığından emin olmak için bunları üç ila beş kez tersyüz edin ve ardından dördüncü sütundaki ilgili haznelere yükleyin. Birkaç kez tersyüz ettikten veya hafifçe vortekslendikten sonra, elüsyon tamponunu, manyetik boncukları ve FFPE tamponunu beşinci sütundaki küçük haznelere yükleyin ve belirtilen iki yuva boş bırakın.İki mililitrelik derin kuyucuklu bir plakayı plaka taşıyıcısına yerleştirin. Çalışmayı başlatmadan önce tüm tüpleri ve reaktif kanallarını UNC kapaklarla kapatın. Sıvı atık şişesinde yeterli kapasite olduğunu ve katı atık şişesinin boş olduğunu ve biyotehlike torbasıyla astırıldığını onaylayın.Uç atma plakasının atık düzeneğinin merkezinde olduğundan emin olun. Ön kapağı kapatın, yazılımı başlatın, NA prep main ML starlet'i açın. Med dosyasını yapın.Başlat'a tıklayın. Cihaz durumu boşta konumundan çalışıyor konumuna geçecektir. Bu çalışma için örnek sayısını girin.Bu çalışma için istenen yöntemi seçin. Birini seçerek ilk yüksek hacimli uç ucun konumunu girin. Tüm tepsiler doluysa, birini seçerek ilk standart hacimli ucun konumunu girin.Tüm tepsiler doluysa, cihaz kullanıcı müdahalesi olmadan otomatik adımları gerçekleştirecektir. Kontaminasyonu önlemek için ayrıntılı bir iş akışı burada gösterilmiştir. Eldiven giymek ve temiz bir PCR kabini kullanmak gibi standart önlemleri uygulayın.Pipetleri ve düşük protein bağlamalı tüpleri temizleyin. Reaksiyon karışımlarını PCR tüp şeritlerinde hazırlayın, reaksiyon bileşenlerini çözdürün ve oda sıcaklığına gelene kadar bekletin. Dijital damlacık PCR veya D-D-P-C-R analizi için kullanılacak insan genomik DNA örneği, microliter başına minimum 3.3 nanogram konsantrasyona sahip olmalıdır.PCR reaksiyonlarını hazırlayın. İki adet X-D-D-P-C-R süper karışım, 20 x ileri ve geri primerler ile probu her bir saflaştırılmış DNA örneği ile birleştirin ve distile su ile 20 µL'ye tamamlayın. Homojenliği sağlamak için karışımı iyice vorteksleyin ve dağıtmadan önce tüplerin dibindeki içeriği toplamak için kısa süreli santrifüjleyin.Damlacık oluşturucuyu üreticinin önerdiği protokole göre çalıştırın. Kartuşu, kartuş üzerindeki çentik tutucunun sol üst tarafına gelecek şekilde tutucuya yerleştirin. Orta kuyucuklara örnekleri içeren 20 µL reaksiyon karışımı ve alt kuyucuklara 70 µL oluşturucu yağı ekleyin.Contayı kartuşun üst kısmına yerleştirin. Contanın tutucunun her iki ucuna da güvenli bir şekilde takıldığından emin olun. Aksi takdirde, damlacık üretimi için yeterli basınç sağlanamayacaktır.Cihazın üst kısmındaki yeşil düğmeye basarak damlacık oluşturucuyu açın. Tutucu doğru konumdayken kartuşu yerleştirin. Hem güç hem de tutucu gösterge ışıkları yeşildir.Kapağı kapatmak ve damlacık üretimini başlatmak için cihazın üstündeki düğmeye tekrar basın. Damlacık üretiminin devam ettiğini belirtmek için, 10 saniye sonra damlacık gösterge ışığı yeşil renkte yanıp söner. Damlacık üretimi tamamlandığında, her üç gösterge ışığı da sabit yeşil renge dönecektir.Düğmeye basarak kapıyı açın ve tutucuyu üniteden çıkarın. Tek kullanımlık contayı tutucudan çıkarın ve atın. Kartuşun üst kuyucuklarının damlacıklar içerdiğini, orta ve alt kuyucukların ise damlacık üretiminin ardından çok az miktarda kalıntı yağ ile neredeyse boş olduğunu unutmayın.Konvansiyonel PCR amplifikasyonu için hazırlık yapın. Üreticinin cihaz protokolünde belirtildiği gibi, her örnek için kartuşların üst kuyucuğundaki damlacık içeriğinden 40 µL'yi önerilen 96 kuyucuklu bir PCR plakasının tek bir kuyucuğuna pipetleyin; transferler sırasında damlacık parçalanmasını en aza indirmek için damlacığı yavaşça ve nazikçe aspire edin. Buharlaşmayı önlemek için, damlacıklar transfer edildikten hemen sonra PCR plakası mühürlenmelidir.Plaka mühürleyici sıcaklığını 180 °C'ye ve süreyi beş saniyeye ayarlayın. Tepsi kapağını açmak için oka dokunun. Destek bloğunu, 96 kuyucuklu tarafı yukarı bakacak şekilde tepsinin üzerine yerleştirin.96 kuyucuklu plakayı destek bloğunun üzerine yerleştirin ve tüm plaka kuyucuklarının destek bloğu kapağıyla hizalandığından emin olun. Bir adet folyo sızdırmazlık tabakasıyla birlikte 96 kuyucuklu plaka; PCR plaka kapatıcı ile damlacık okuyucusundaki iğnelerle uyumlu, kürlenebilir folyo plaka sızdırmazlık ürünleri kullanın. 96 kuyucuklu plaka destek bloğuna sabitlendikten ve kürlenebilir folyo sızdırmazlık tabakasıyla kapatıldıktan sonra.Mühürleme düğmesine dokunun. Tepsi kapanacak ve ısı ile mühürleme işlemi başlayacaktır. Isı ile mühürleme tamamlandığında, kapı otomatik olarak açılacaktır.Plakayı ısıtma bloğundan çıkarın ve ardından ısıtma bloğunu kaldırın. Folyo üzerindeki çökmeleri kontrol ederek plaka içindeki tüm kuyucukların mühürlendiğinden emin olun. Her bir kuyucuğun üzerindeki folyo kolayca fark edilmektedir.Kapatıldıktan sonra plaka, termal döngü için hazırdır. Protokol metninde detaylandırılan parametreleri takip ederek konvansiyonel PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin. Damlacıklardaki nükleik asit hedefinin PCR amplifikasyonu tamamlandığında.Bir sonraki adım, iki renkli bir tespit sistemi kullanarak her bir damlacığı ayrı ayrı analiz etmektir. Tipik olarak, damlacık okuyucu cihaz FAM ve VIC raporlayıcı floroforları tespit edecek şekilde ayarlanır. Damlacık okuyucuyu hazırlamak ve D-D-P-C-R analizi için hazır hale getirmek amacıyla sistemi yıka (flush system) düğmesine tıklayın.Plakayı damlacık okuyucuya yerleştirin ve başlat'a tıklayın. Damlacık okuma işlemi tamamlandığında, kapağı açın ve plaka tutucuyu üniteden çıkarın. 96 kuyucuklu duvarlı plakayı tutucudan çıkarın ve atın.Ardından, protokol metninde açıklandığı şekilde veri analiz yazılımını kullanarak DNA mutasyon profillemesi gerçekleştirin. Bu D-D-P-C-R analizinde, RAF V 600 E mutasyonları incelenmiştir. Floresans tespit edilmiş ve iki boyutlu bir saçılım grafiği ekranına dönüştürülmüştür.Uygun geçitleri (gate) çizmek için özel bir yazılım kullanılmış ve her bir geçit içindeki damlacıkların sayısı sayılmıştır. Tüm numuneler için pembe kesim hattının üzerinde mavi noktalarla temsil edilen damlacıklar pozitiftir. Mutasyona uğramış RAF V 600 E vahşi tip bra damlacıkları, her iki grafikte de yeşil noktalarla temsil edilmektedir.Alttaki gri noktalar floresan arka plan olarak kabul edilir. Toplam mutant alel frekansları, bir semester boyunca tespit edilen vahşi tip bra ve brav V 600 E şablon konsantrasyonlarının göreceli yüzdelerine göre hesaplanmıştır. Bireysel analizlerle birlikte HR, bu işlemden sonraki dört saat içinde gerçekleştirilebilir.Kanser progresyonunun izlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, geliştirilmesinin ardından A PPT sıvı biyopsisi gibi diğer örnekler de uygulanabilir. Bu teknik, eşlik eden tanı alanındaki araştırmacıların moleküler onkoloji alanında çeşitli mutasyon tespitlerini keşfetmesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir nokta DNA mutasyon tespiti için doku hazırlama sisteminin ve dijital damlacık P-C-R-S-A'nın nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Vahşi tip blokaj PCR ve ardından doğrudan dizileme, çeşitli numune türlerinde düşük frekanslı somatik mutasyonlar için oldukça hassas bir tespit yöntemi sunar.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Algılama ribonükleik asit (cRNA) kan dolaşan bir karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis olduğunu. Burada küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda hassas ve belirli dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak üzerinden cRNA karakterize yöntemleri açıklanmaktadır. Testleri 72 saat içinde füzyon türevlerini algılamak için tasarım gereksinimlerini karşılamak.

Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

Bu protokol, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku örneklerinde gen amplifikasyonunu görselleştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.

Floresan In Situ Hibridizasyon ile Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Numunelerde Gen Amplifikasyonunun Sağlam Tespiti

Kas hasarı altta yatan mekanizmaların belirlenmesi çok önemlidir. Burada parafine gömülü ve Drosophila torasik kasları bölümleri dondurulmuş hazırlamak için histolojik teknik sunuyoruz. Bu kas morfoloji ve protein ve diğer kas hücre bileşenleri lokalizasyonu analizi sağlar.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Öğrenin, formalin sabit parafin gömülü referans standart hücre hatlarından otomatik DNA izolasyonu ve dijital damlacık PCR ile BRAF V600E mutasyonlarının hassas tespiti yöntemini. Bu yaklaşım, moleküler onkolojide nadir mutasyonların güvenilir analizi için klinik uygulamalarda yüksek duyarlılık sağlar.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam (Video) | JoVE Journal

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

Daha fazla video keşfet