Prematüre Modelleme Ensefalopati Sıçanlarda İçi amniyotik Lipopolisakkarid ile Prenatal Hipoksi-iskemi kullanma
20 Kasım 2015
Prematüre ensefalopatisi, erken doğumdan kaynaklanan yaralanma ile ilişkili merkezi sinir sistemi anormalliklerini kapsar. Bu rapor, koryoamniyoniti taklit eden in utero geçici sistemik hipoksi-iskemi ve intra-amniyotik lipopolisakkarit uygulamasının (LPS) klinik olarak anlamlı bir sıçan modelini ve enfeksiyöz uyaranların ve plasental underperfüzyonun CNS gelişimi üzerindeki ilişkili etkisini açıklamaktadır.
Bu cerrahi prosedürün genel amacı, sıçanlarda utero, geçici sistemik hipoksi, iskemi ve intra amniyotik inflamasyon, plasenta yetmezliği ve koryoamniyoit indüksiyonu yoluyla aşırı erken doğumla ilişkili tekrarlanabilir bir beyin hasarı modeli sağlamaktır. Bu yöntem, intrauterin süreçlerden kaynaklanan perinatal beyin hasarının patogenezi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve yönlendirilmiş terapötik stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem enfeksiyon hem de hipoksiden intrauterin hakaretleri taklit eden sistemik yaralanmayı indüklemesidir, iskemi olgun sıçanlarda fonksiyonel nörolojik defisitlere neden olur.
Bu model özellikle inflamasyonla ilgili yaralanma mekanizmalarını incelemek için uygundur. Hipoksi, iskemi ve enfeksiyöz uyaranlar ayrı ayrı veya kombine bir yaralanma olarak test edilebildiğinden, prosedürü laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Lindsey Chan gösterecektir. Prosedüre başlamadan önce, embriyonik bir günün alt karın bölgesindeki tüm tüyleri çıkarmak için küçük hayvan makası kullanın.
18 Dikdörtgen şeklinde hamile sıçan, meme uçlarını çentiklememeye veya jilet döküntüsü oluşturmamaya dikkat edin. Daha sonra, steril pamuklu çubuklar kullanarak, cildi üç alternatif povidon iyot ve% 70 etanol uygulamasıyla ovalayın. Cilt kuruduğunda, uygun anestezi derinliğini ayak parmağınızla onaylayın, hayvanı çimdikleyin ve örtün.
Daha sonra, hayvanın karnında üç santimetrelik bir orta hat kesisi yapmak için bir neşter kullanın, ardından deri tabakasının karın fasyasından makasla künt bir şekilde diseksiyonu yapın. Forseps ve cerrahi makas kullanarak. Abdominal fasya tabakasını yükseltin ve avasküler lineer dirsekten bir kesi yapın.
Periton boşluğu açığa çıktığında, insizyonun dışına cerrahi gazlı bez yerleştirin ve gazlı bezi steril tuzlu su ile nemlendirin. Daha sonra künt forseps ve karın üzerine dış baskı uygulayarak, uterus boynuzlarını periton boşluğundan nazikçe çıkarın ve boynuzları nemli gazlı bez üzerine yerleştirin. Bağırsaklarla dolaşma ve temastan kaçınmaya özen göstererek, fetüsleri düzenlemek için sadece tek tek amniyotik keseler arasındaki kas dokusunu kullanın.
Daha sonra künt diseksiyon kullanarak, dört uterus arterini açığa çıkarın ve izole edin. Arterler izole edildiğinde anne damarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Her damara 30 gauge sıçan anevrizması klipsi yerleştirin Klipsleri uygulamadan önce, çevredeki tüm dokunun tamamen temiz olduğundan emin olmak önemlidir.
Klipsleri yerleştirirken, künt forseps ile sabitleyin ve ardından paralel olarak yerleştirin. Nabzın durmasını gözlemlemek, tam hipoksi iskemisi Tüm klipsler yerleştirildiğinde. Proksimal ve distal nabızların durduğunu ve tek tek plasentalar da dahil olmak üzere uterus damarlarının koyulaşmasını onaylayın.
Daha sonra tüm cerrahi alanı gazlı bezle örtün ve dokuyu steril tuzlu su ile sulayın. 60 dakika sonra bir saat boyunca her 10 dakikada bir, gazlı bezi çıkarın ve tarlayı tekrar sulayın. Rahim boynuzları ve damarları yeterince nemlendirildiğinde, her bir anevrizma klipsini nazikçe çıkarmak için forseps kullanın, damarda travma oluşturmamaya ve doku bütünlüğünü korumaya özen gösterin.
Ardından boynuzları ve tarlayı iyice sulayın. Son bir kez, amniyotik keselerden başıboş gazlı bez ipliklerini çıkarmaya özen gösterin. Fetüsleri LPS ile tedavi etmek için, her bir amniyotik kesenin tabanı görünecek şekilde her bir amniyotik kesesi stabilize etmek ve döndürmek için künt forseps kullanın.
Daha sonra bir ultra ince 0.3 mililitre insülin şırıngasını LPS çözeltisi ile bağlı sekiz milimetre 31 gauge iğne ile yükleyin ve her plasental plakanın hemen önüne 100 mikrolitre çözelti enjekte edin. İğne çıkarılırken, herhangi bir sıvı sızıntısını durdurmak için amniyotik keseye doğrudan basınç uygulayın. Amniyotik kesenin tabanına ultra ince 31 gauge iğnenin yerleştirilmesi, herhangi bir amniyotik sıvının kaçmasına izin vermeden uygun LPS iletimi için kritik öneme sahiptir.
Rahim boynuzlarını steril tuzlu su ile üç kez suladıktan sonra, boynuzları periton boşluğuna geri döndürmek için forseps kullanın. Daha sonra, bir torbanın içine veya içinden dikiş atmadan kaskulo fasyal tabaka kenarlarını yeniden yaklaştırmak için çalışan üç oh ipek sütür kullanın, ardından cildi başka bir çalışan 3.0 ipek sütür ile kapatın. Ardından, deri altına almak için 26 gauge bir iğne kullanın.
Yara kenarlarına bir mililitre% 0.125 bupivakain enjekte edin. Fareyi gerektiği gibi havluyla kurulayın, ense kısmına kilogram başına 0.1 miligram buprenorfin enjekte edin. Hayvanı, tamamen iyileşene kadar izlemeli temiz bir ev kafesine yerleştirin.
Embriyonik 18. günde geçici sistemik hipoksi iskemisi ve LPS uygulamasını takiben, az önce gösterildiği gibi, het ve eozin boyaması hem plasentada hem de beyinde önemli histopatolojik anormallikler ortaya çıkarmaktadır. Gerçekten de, embriyonik 19. ve 21. günlerde incelenen plasenta, desidua ve labirent boyunca büyük ölçüde mikro kanama ve nekroz ile yayılır. Önemli inflamatuar infiltrasyon ve artmış vaskülarite de gözlenir.
Doğum sonrası ikinci günde incelenen diğer beyinler, geçici sistemik hipoksi, iskemi ve LPS'ye kıyasla ventriküler magalinin yanı sıra beyaz cevher ve alt plaka nöron kaybını da ortaya çıkarır, ayrıca potasyum klorür kotransporter iki proteinin ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı, Doğum sonrası 15. günde kortekste GABAerjik inhibisyon gelişiminin merkezinde yer alan bir klorür kotransporter, Bu, devre olgunlaşmasının kritik doğum sonrası döneminde gözlenen bozulmuş gelişimsel yukarı regülasyon ile tutarlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, hamile sıçanlarda bu ameliyatın nasıl yapılacağı ve intra amniyotik lipopolisakkarit solüsyonu enjeksiyonu yoluyla uterin arter tıkanıklığı ile uterin arter tıkanıklığı yoluyla prenatal geçici hipoksi iskemisinin nasıl indükleneceği konusunda sağlam bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 90 dakika içinde tamamlanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, utero geçici sistemik hipoksi-iskemi ve intra-amniyotik inflamasyon yoluyla aşırı prematüre doğumla ilişkili beyin hasarını simüle eden bir sıçan modeli sunmaktadır. Model, enfeksiyon ve plasental yetmezlikle ilişkili perinatal beyin hasarının mekanizmalarını aydınlatmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Perinatal Tıp
Arka Plan
- Prematüre ensefalopatisi, prematüre doğumdan kaynaklanan MSS anomalilerini içerir.
- Koryoamnionit ve plasental hipoperfüzyon, MSS gelişimi üzerinde önemli faktörlerdir.
- Bu faktörlerin anlaşılması, terapötik stratejiler geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
- Uterus içi süreçler, fonksiyonel nörolojik defisitlere yol açabilir.
Çalışmanın Amacı
- Çok prematüre sıçanlarda tekrarlanabilir bir beyin hasarı modeli oluşturmak.
- Uterin içi hasarları taklit eden sistemik yaralanmaların etkilerini incelemek.
- Perinatal beyin hasarının patogenezini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Utero geçici sistemik hipoksia indüksiyonu.
- İskemi ve intra-amniyotik inflamasyon indüksiyonu.
- Kombine yaralanmaların etkilerini incelemek için sıçan modelinin kullanımı.
- Yetişkin sıçanlarda fonksiyonel nörolojik defisitlerin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Model, enfeksiyon ve hipoksi-iskemi etkilerini başarıyla taklit etmektedir.
- Bireysel ve kombine yaralanma etkilerini test etme yeteneği gösterilmiştir.
- İnflamasyonla ilişkili yaralanma mekanizmalarına dair içgörüler sağlanmıştır.
- Hedefe yönelik terapötik stratejilerin geliştirilmesine olanak tanımıştır.
Sonuçlar
- Bu model, perinatal beyin hasarı mekanizmalarının incelenmesi açısından değerlidir.
- Rahim içi koşulların MSS gelişimi üzerindeki etkisinin anlaşılmasına yardımcı olabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, terapötik müdahaleleri keşfetmek için bu modeli kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Bu prenatal sıçan modeli, insan plasental hipoperfüzyonunu ve koryoamniyoniti taklit etmek için geçici sistemik hipoksi-iskemiyi intraamniyotik inflamasyonla birleştirerek prematüre ensefalopatisi araştırmalarındaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Model; iskemik ve enfeksiyöz olmak üzere farklı yaralanma türlerinin mekanistik olarak ayrıştırılmasına olanak tanıyarak, perinatal nöroproteksiyonda hedef doğrulamayı ve biyobelirteç keşfini desteklemektedir. Modelin, yetişkin sıçanlarda klinik fenotipleri yansıtan fonksiyonel eksiklikler oluşturabilme yeteneği, preklinik terapötik taramalar için öngörüsel güvenilirliği artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Birleşik bir yaralanma modelinde hipoksi-iskemi ve enflamatuar yolakları izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Beyaz madde, subplate nöron ve oligodendrosit kaybı dahil olmak üzere ölçülebilir MSS hasarı aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Tahminleyici Değer: Çok prematüre bebeklerde gözlemlenen yakınsak patofizyolojileri modelleyerek portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonu için hastalığa özgü nöroanatomik ve fonksiyonel veriler (yürüyüş anomalileri, ventriküler morfoloji, KCC2 azalması) üretir.
- Operasyonel Değer: Yüksek doğrulukta bileşik taramasına olanak tanımak için plasental ve fetal bölümlerde tekrarlanabilir, ölçülebilir sonuçlar sağlar.
- Platform Kullanımı: Öncü bileşiklerin belirlenmesindeki mekanistik belirsizliği gidermek için bireysel ve kombine etkilerin sıralı olarak test edilmesine izin verir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Nöronal/aksonal kayıp, subplate dejenerasyonu ve kalıcı fonksiyonel eksiklikler gibi çok sayıda EoP kriterini yeniden ortaya koyarak translasyonel geçerliliği artırır.
- Operasyonel Değer: Prenatal hasardan postnatal fenotipe kadar süreklilik sağlayarak boylamsal biyobelirteç takibini destekler.
- Risk Azaltma: Kombine plasental yetmezlik ve inflamatuar etiyolojileri modelleyerek riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarına temel oluşturur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu model; hedef hipotez testinden fenotipik taramaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle de enflamatuar veya hipoksik-iskemik yolakları hedefleyen nöroprotektif ajanlar için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: İn utero ortamda farklı yaralanma türlerinin (iskemik ve enfeksiyöz) enflamasyondan ayrıştırılmasına olanak tanıyarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Tarama: Analiz tekrarlanabilirliği ve bileşik değerlendirmesi için gerekli olan standartlaştırılmış, kantitatif histopatolojik ve davranışsal çıktılar sağlar.
- Analitikler: Plasental histopatoloji, fetal beyin histolojisi ve postnatal nörofonksiyonel analizler yoluyla yaralanma şiddetinin karşılaştırılmasına imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Klinik EoP patofizyolojisi ile uyumlu olup biyobelirteç uyumunu ve preklinikten kliniğe geçiş sürekliliğini destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı yaralanma modalitelerinde monoterapilerin ve kombinasyon müdahalelerinin değerlendirilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform görevi görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Sinerjik plasental ve fetal hasarları modelleyerek perinatal beyin hasarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış cerrahi zamanlama (E18), klips yerleştirme ve LPS dozaj protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Nöroproteksiyondaki geç evre klinik başarısızlığa yol açan çok faktörlü etiyolojileri modelleyerek devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: İskemik, inflamatuar veya kombine hasar paradigmaları genelindeki etkinliğe göre bileşiklerin risk tabanlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Kemirgen mikrocerrahisi, uterin arter izolasyonu ve amniyotik kese manipülasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- Hassas enstrümantasyona bağımlıdır: 30 gauge anevrizma klipsleri, 31 gauge insülin şırıngaları ve steril alanın korunması.
- Tutarlı fenotipleme için cerrahi, histoloji ve davranışsal analiz ekipleri arasında ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Diğer modellere adaptasyon, plasental perfüzyon dinamiğinin ve inflamatuar doz-yanıtının doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında, nabız durması doğrulaması ve salin irrigasyonu yoluyla kontrol edilmesi gereken, klips yerleşimi ve LPS difüzyonundaki cerrahi değişkenlikler yer alır.
