Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, salgılanan bir raporlayıcı protein kullanarak endoplazmik retikulum kalsiyum disregülasyonunu zaman içinde izlemektir. Bu işlem, hedef dokunun, özellikle de karaciğerin viral vektör aracılı transgenezi ile gerçekleştirilir. Gai lüsiferaz circa raporlayıcısı ile yapılan bu örnekte, dokudan salınan circa miktarını ölçmek için kan gibi bir sonraki biyolojik sıvı toplanır, ardından plazma örneklerine lüsiferaz substratı eklenir ve ER kalsiyum tükenmesini belirlemek için lüminesans ölçülür.

Sonuçlar, plazma C camp seviyelerindeki artışla belirtilen ER kalsiyum disregülasyonunu göstermektedir; ER homeostazı, biyolojik sıvıların küçük hacimlerinin tekrarlanan örneklemesi yoluyla uzun süreler boyunca izlenebilir. Bu tekniğin, düşük afiniteli kalsiyum boyaları veya genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ER kalsiyum homeostazının minimal invaziv bir prosedür aracılığıyla in vivo olarak zaman içinde izlenebilmesidir. Bu tekniğin iki terapötik yolu bulunmaktadır.

Birincisi, ER kalsiyum homeostazını normal fizyolojik duruma getirebilen veya koruyabilen ilaçların taranmasıdır. İkinci yaklaşım ise, terapötik proteinleri, ER kalsiyum tükenmesine yanıt olarak salgılanan terapötik AMP'lere dönüştürmektir. Bu yöntem, karaciğerdeki ER kalsiyum disregülasyonu hakkında bilgi sağlayabilir.

Beyin, kalp, kas veya pankreas gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Anestezi uyguladıktan sonra, metin protokolüne uygun olarak, bir sprat dolly sıçanına oftalmik pomad uygulayın ve anestezinin gerçekleştiğini doğrulamak için kuyruk sıkıştırma testi yapın; kaburgaların biraz altından orta karın bölgesine kadar olan karın bölgesini tıraşlayın ve cerrahi alanı Betadine ve %70 etanolü dönüşümlü kullanarak üç kez fırçalayın. Ardından sıçanı steril bir cerrahi alanda sırtüstü pozisyona getirin ve steril cerrahi örtülerle örtün; a v gluc samp örneğini kullanıcı tarafından optimize edilmiş konsantrasyona kadar seyreltin.

Bu vakada, mililitre başına 7,6 x 10⁹ viral genom kullandık ve tüpü tersyüz ederek karıştırdık. Ardından, seyreltilmiş AAV'den 105 µL'yi steril bir kaba pipetleyin ve virüsü bir şırıngaya toplamak için 30 gauge'lik bir iğne kullanın. Enjeksiyon için karaciğeri açığa çıkarmak amacıyla hedef insizyon bölgesini bir skalpel kullanarak işaretleyin.

Kaburga kafesinin altına yaklaşık iki ila üç santimetre uzunluğunda yatay bir insizyon yapın. Bağ dokusunu hipodermisten ayırmak için künt diseksiyon uygulayın. Karın kasını keserek karaciğerin sağ medial lobunu açığa çıkarın.

Ardından, hayvanı cerrahi bir mikroskobun altına yerleştirin ve karaciğerin sağ medial lobunu görüş alanına getirecek şekilde ayarlayın. Daha sonra şırıngayı kullanarak, toplam virüs hacminin üçte birini sağ medial lobun parankimindeki üç farklı bölgeye enjekte edin; tüm enjeksiyon hacminin verildiğinden emin olmak için iğneyi enjeksiyondan sonra beş ila 10 saniye boyunca dokuda bırakın, karın kasını ve insizyonu sütüre edin ve Neosporin uygulamak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Sıçanı, bilinci yerine gelene ve dik pozisyonunu koruyabilene kadar bir iyileşme odasına yerleştirin, ardından hayvanı tekli konaklamalı ev kafesine geri götürün.

Enjeksiyondan dört ila yedi gün sonra. Kan toplama tüplerini etiketleyerek ve önceden tartarak hazırlayın. Ardından her tüpe 1000 units/mL konsantrasyonunda 50 µL heparin ekleyin.

Sıçanı metin protokolüne uygun olarak anestezi altına aldıktan sonra, sedasyonu doğrulamak için kuyruk sıkıştırma testi uygulayın ve steril makas kullanarak kuyruğun uç kısmından yaklaşık bir ila iki milimetreye kadar kesin. Kanamayı durdurmak için, 100 µL'den fazla kanı damla damla heparinle önceden doldurulmuş bir tüpe toplayın.

Kuyruğa STIC tozunu uygulamak için ıslak bir pamuklu aplikatör kullanın. Toplamalar arasında makasları silmek için etanol pedi kullanın ve boncuk sterilizasyonu yapın. Kan tüplerini dört derece Celsius'ta saklayın.

Sonraki örnekler toplanacaksa, toplama tüplerini tartın ve kan ile heparin arasında ikiye bir oran elde etmek için heparini ayarlayın. Bu adım, her örnekteki heparin miktarını normalize edecektir. Tüpleri 2000 ×g ve dört °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Plazma süpernatantını yeni bir tüpe aktarın ve lüsiferaz analizi için pozitif kontrol olarak thaa garin uygulamak üzere 72 saate kadar 4 °C'de veya uzun süreli saklama için -80 °C'de muhafaza edin. Etanol ile 2,5 mg/mL nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Ardından, alt karın bölgesinden intraperitonal olarak 1 mg/kg dozunda enjekte edin.

Yukarıda açıklandığı gibi, enjeksiyondan 24 saat sonra ilk kan örneğini alın. Lüminesansı ölçmek için, selen ezine çalışma substratını metin protokolüne göre hazırlayın ve ışıktan korunmuş şekilde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

Bu sırada, tüm örnekleri buz üzerinde çözün ve biyolüminesansı izleyebilen ve bir substrat enjektörü ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak 10 µL plazmayı opak duvarlı bir plakaya aktarın. Hatları substrat ile hazırlayın. Bir kuyucuğa 100 µL substrat enjekte edin.

İn vitro örnekler için orta hızda beş saniye boyunca çalkalayın ve ışık emisyonunu ölçün. Okuma adımı için ışık emisyonunu 0,5 saniye boyunca entegre edin; in vivo örneklerde ise ER kalsiyum homeostazını değerlendirmek için okuma adımında beş saniye boyunca entegre edin. Gluc SAR Camp yöntemi kullanılarak, bu durumda Gluc Noag gibi sürekli salgılanan bir raporlayıcı dahil olmak üzere çeşitli kontroller eklenebilir.

Deneysel koşullara yanıt olarak hem GLUC SAR camp hem de Gluc noag ekstrasellüler seviyelerindeki artış belirsiz bir sonuç olarak değerlendirilir. Ancak, gluc noag yanıtı olmaksızın gluc SAR camp salgılanmasındaki artış, ER kalsiyum bağımlı bir olayı destekler. Yeni paradigmalarla SAR camp salınımına ER kalsiyumun katkısını doğrulamak için ER kalsiyum deposunun farmakolojik modülatörleri kullanılabilir.

Örneğin, burada gösterildiği üzere, ER kalsiyumunu stabilize eden bir INE reseptör antagonisti olan dantrolene, thic argon'a yanıt olarak SAR camp salınımını inhibe eder. Gluk bazlı SAR camp kullanılan in vitro çalışmalar için, tedavi ile indüklenen yanıt en iyi şekilde zaman seyri boyunca değerlendirilir. Kontrollere karşı bir plaka içindeki göreceli yanıttaki değişiklikler takip edilmelidir; substrat bozulmasının ham değerlerde değişikliklere yol açabileceği çoklu plakalar arasında ham sayıların karşılaştırılması tavsiye edilmez. In vivo çalışmalar için veriler, her hayvanın kendi ön tedavi kontrolü olarak hizmet ettiği şekilde, her hayvan için bağımsız olarak değerlendirilmelidir.

Bu, hayvanlar arasındaki transgen iletimi ve ekspresyonundaki değişkenlikleri hesaba katmak için gereklidir. Bu videoyu izledikten sonra, karaciğer hastalığının kemirgen modellerinde ER kalsiyum düzenlemesini incelemek için sircam teknolojisinin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Viral vektörlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipmanın giyilmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.