Name: Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme Gaussia Lusiferaz SERCaMP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin endoplazmik retikulum kalsiyum dengesizliğini Gaussia lusiferaz SERCaMP ile izleme yöntemini. Viral vektör aracılığıyla karaciğerde transgenesis yaparak biyolojik sıvılardan örnek alın ve luminesans ölçümüyle kalsiyum homeostazını uzun süre takip edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü'ndeki Okul İçi Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Bu yöntemin geliştirilmesine katkılarından dolayı Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno ve Josh Hinkle'a teşekkür ederiz.

Vitro Tahlili: 1. Bir Kararlı SH-SY5Y Hücre Line algılama SERCaMP Yayın <ol><li> Levha SH-SY5Y-glukozit-ASARTDL (SERCaMP) doku kültürü içinde yüzey alanının cm2 başına 150.000 hücre plakaları işlemden geçirildi. 96 oyuklu plakalar için, örneğin, 50,000 hücre, oyuk başına (Şekil 1A) tohum. DMEM (yüksek glukoz, GlutaMAX, piruvat) +,% 10 büyükbaş hayvan büyüme serumu + 1 x penisilin / streptomisin SH-SY5Y hücreleri büyütün. <ol><li> 15 kez (Şekil 1B) kadar Passage hücreleri. Yüksek geçit numarası test edilmemiştir. </li><li> % 5.5 CO2 ile 37 ° C &#39;de nemlendirilmiş inkübatör hücreleri dönün ve gece boyunca inkübe edilir. </li></ol></li><li> Deneysel tedavi (ler) önce, iyi bir opak kültür süpernatant 5 ul aktararak her biri için bir temel numune toplamak 96 plaka duvarlı. Toplama önce, hafifçe her tarafta plaka dokunun ve degrade etkileri önlemek için girdap. Yapışkan bir s ile opak plaka Sealenzimatik analiz zamanına kadar 4 ° C&#39;de ealing tabaka ve saklayın. Not: Salgılanmış glukozit-SERCaMP hücre kültür ortamı içinde çok kararlıdır. Daha önce glukozit aktivitesinin yaklaşık% 5-10 (SH-SY5Y hücreleri üzerinde inkübe) 37 ° C&#39;de 12 bir 72 saat inkübe edildikten sonra kaybolur bildirilmiştir. </li><li> ER kalsiyum tükenmesi incelemek için arzu edildiği gibi (örneğin çevre, farmakolojik, genetik manipülasyonlar) hücreleri davranın. Hızla atmosferik CO 2 de oluşacak pH değişiklikleri olarak (kontrollü inkübatör dışında) çevre ortama uzun maruz kalmaktan kaçının. Uzun süreli manipülasyonlar gerekli ise, pH değeri 14 stabilize edilmesi için, 20 mM kültür ortamına HEPES ekleyin. Kültür ortamında 15 HEPES kullanırken ışığa maruz kalmaktan kaçının. <ol><li> Pozitif kontrol: SH-SY5Y hücrelerinde deneyler için 4-6 saat boyunca 100 nM thapsigargin (Tg) ya da 50 uM siklopiazonik asit (CPA) ve hücreleri tedavi edin. Diğer hücre hatlarında maksimal tepkisi uzun inkubasyon ya da farklı yoğunlaştırma gerektirebilirBileşiklerin, yerel yönetim bu. </li><li> Negatif kontrol: Ebeveyn SH-SY5Y hücrelerinin topla kültür ortamı. Deneyimlerimize göre, bu deneyde arka plan lüminesans stabil SH-SY5Y-glukozit-SERCaMP hücreleri bazal salgılama az% 0.05. </li></ol></li><li> Adım 1.2&#39;de belirtildiği gibi, istenen zaman noktalarında toplayın ve klimalı ortamın mağaza 5 ul örnekleri. </li><li> Bölüm 5&#39;te belirtildiği gibi orta enzimatik aktivitesini değerlendirmek. </li><li> Immunoblot veya lüminesans deneyi ile hücre içi glukozit inceleyin. <ol><li> 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl,% 0.25 sodyum deoksikolat, 1 mM EDTA,% 1 NP40 içeren değiştirilmiş RIPA tamponunda lize hücreleri ve proteaz inhibitörleri: immünoblot için. 0,20 um PVDF membrana SDS-poliakrilamid jeli ve transfer ayrı. (: 2000 seyreltme 1) gece boyunca 4 ° C&#39;de glukozit antikor ile membran inkübe edin. Seçim tespiti ayıraç için kullanıcı tanımlı protokole göre sekonder antikor inkübasyon ve membran yıkar gerçekleştirin. </li><li> Nedeniylelüminesans tahlil (Şekil 2): buz üzerinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin: <ol><li> Bir doku kültürü plakasının gözeneklerine tüm orta çıkarın ve soğuk 200 ul PBS ile yıkayın. </li><li> Her bir oyuğa 50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl,% 1 NP40 ihtiva eden liziz tamponu ve proteaz inhibitörlerinin 75 ul ekle. </li><li> 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir orbital çalkalayıcı (120 rpm) üzerine plaka döndürün. </li><li> Yavaşça yukarı ve çok kanallı pipet kullanarak hava kabarcıkları kaçınarak aşağı lizat pipetle. Opak plaka lizat 5 ul aktarın ve Bölüm 5&#39;te belirtildiği gibi lüminesans değerlendirmek. </li></ol></li></ol></li></ol> İn Vitro Tahlili: 2. SERCaMP ölümsüzleştirilmiş Hücreler geçici transfeksiyonu Not: geçici transfeksiyon prosedürleri hücresel strese neden olabilir ve daha sonraki glukozit-SERCaMP yanıtı künt olduğunu gözlemledik. Aşağıdaki yaklaşım transfeksiyon eff en aza indirmek için geliştirildi<html> SH-SY5Y hücrelerinde ects. Alternatif hücresi soyları (transfeksiyon reaktifi seçimi de dahil olmak üzere), bu prosedürün optimize edilmesi gerekli olabilir. Mümkün olduğunda, bu sırasıyla Bölüm 1 ve 3 de tarif kararlı hücre kuşaklarının ya da viral transdüksiyon yöntemleri kullanmak tavsiye edilir. <ol><li> 4 x 10 6 hücre, bir 100 mm çanak Levha SH-SY5Y hücreleri. Bu bulaşık transfeksiyon prosedürü izleyerek yaklaşık 300 kuyu (96 oyuklu plaka formatı) tohum yeniden için yeterli olacaktır. </li><li> Xfect plazmid DNA 20 ug (kodlayan glukozit-SERCaMP) ile reaktif ve Xfect reaktifi 6 ul Transfect hücreleri. Büyük veya daha küçük kültür hazneleri göre ölçekli DNA and Xfect reajanı. </li><li> 48 saat boyunca inkübatör hücreleri dönün. </li><li> Hücreleri tripsinize edin ve oyuk başına 60,000 hücre olacak şekilde 96 oyuklu plakalara reseed. Bölüm 1&#39;de özetlenen sonraki adımları izleyin. </li></ol> İn Vitro Tahlili: 3. Viral vektör aracılı İfade glukozit-SERCaMP tert &quot;&gt; Not: Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü ambalaj 16 ve arıtma için 12 ve lentivirüs üretimi 13, daha önce rapor edilmiştir. <ol><li> Titer glukozit-SERCaMP AAV aşağıdaki primerler ve problar kullanılarak: ileri primer, 5&#39;-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 &#39;; ters primer, 5&#39;-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 &#39;; Prob (5&#39;-6-FAM / BHQ-3&#39;-1 etiketli) kantitatif PCR için, 5&#39;-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 &#39;. <ol><li> Glukozit içeren bir plazmid linnerleştirilmesi ve spin-kolon (örn Machery-Nagel NucleoSpin Jel ve PCR temizleme) kullanılarak DNA&#39;nın saflaştırılması ile standart eğri hazırlayın. Kütle merdiven birlikte bir agaroz jeli üzerinde ayırarak DNA nicelleştirmektedir. PBS içinde 10 fg / ml aralığındadır 100 ug / DNA 1:10 dilüe. Plazmidin molekül ağırlığına dayalı olarak her bir konsantrasyonunda, glukozit plazmid DNA&#39;nın kopya / ml hesaplanır. </li><li> PBS AAV stokları seyreltin (uygun seyreltme bağlı olacaktırViral hazırlama parametreleri ve) ampirik olarak belirlenir. </li><li> 94 ° C 20 sn ×, 95 ° C x 5 dakika ve 41 çevrim için, 60 ° C x 1 dak:, aşağıdaki koşullar kullanılarak, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde PCR reaksiyonu. Ml standart eğri kullanılarak / kopya hesaplayın. </li></ol></li><li> Bir p24 Lenti-X, hızlı titre kiti ile titre lentivirüs. Buz üzerinde lentiviral alikotları çözülme ve SH-SY5Y ortamında p24 proteini kontrol sulandırmak. <ol><li> Standart eğrinin (: 20,000 ya da 1: 100.000 örneğin 1) düşecek şekilde lentivirüs sulandırmak. Gerekli seyreltme faktörü lentiviral hazırlık parametrelere göre değişir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. Sonraki tüm adımlar için üreticinin talimatlarına uyun. </li></ol></li><li> 96 gözlü plakalara plakası hücreleri. SH-SY5Y hücreleri için, Bölüm 1&#39;de belirtilen kaplama prosedürleri takip edilebilir. Fare birincil kortikal nöronlarda için, hücreler izole edilir ve uygun bir şekilde kaplanmış plakalar, bir üzerine ekildi olmalıdırs, daha önce tarif edilen 16. 1x B27 ve 500 uM L-glutamin ile takviye edilmiş ortam içinde Neurobasal sıçan birincil kortikal nöronlar koruyun. Her gün yarım orta alışverişi yapın. </li><li> Virüs hücreleri nakletmek. Gaussia lusiferaz güçlü bir sinyal sağlar viral transdüksiyon hedefi, düşük düzeyde ekspresyonunu elde etmektir. <ol><li> AAV transdüksiyon SH-SY5Y hücreleri: kaplama ertesi gün transdüse. AAV seyreltme tamponu (PBS + 0.5mm MgCl2) 6.0 x 10 7 vg / ul AAV sulandırmak. (, Yaklaşık 6000 arasında MOI 3.0 x 10 8 vg) 96 oyuklu bir plaka (Şekil 3A) oyuk başına seyreltilmiş AAV 5 ul ekleyin. Viral vektör atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın. </li><li> Sıçan primer kortikal nöronların AAV transdüksiyon: kaplama sonrası 6-8 gün transduce. AAV seyreltme tamponu 4.0 x 10 6 vg / ul AAV sulandırmak. Seyreltilmiş AAV&#39;nin 5 ul ekleyin (2.0 x 10 7 VG, İçişleri Bakanlığı, yaklaşık 350) oyuk başına96 gözenekli bir plaka (Şekil 3B). Optimal MOI diğer hücre tipleri için ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. Viral vektör atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın. </li><li> SH-SY5Y hücrelerinin lentiviral transdüksiyon: kaplama ertesi gün transdüse. Hank dengeli tuz çözeltisi içinde (konsantrasyon titerleme kiti kullanılarak belirlenen) 20 pg / ml için, p24 lentivirüs seyreltin. 100 ul hacimde 96 oyuklu bir plakanın (1.250.000 lentiviral parçacıklara eşdeğerdir p24 100 ug, veya ~ 1250 IFUs) oyuk başına seyreltilmiş virüs 5ul ekleyin. Büyük biçimleri için buna göre ölçeklendirin. Viral atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın. </li></ol></li><li> Ortamının bir ön-işleme örneği toplamak ve deneysel tedavi 48 saat (SH-SY5Y) ya da transdüksiyon sonra 5-7 gün (sıçan primer kortikal nöronlar) başlar. </li></ol> Vivo SERCaMP Tahlili 4. Not: herhangi bir hayvan prosedürleri kurum aracılığıyla uygun onay almak için emin olun gerçekleştirmeden önce. Hepsihayatta kalma ameliyatlar yeterli anestezi ile steril koşullar altında yapılması için vardır. Aşağıda açıklanan tüm prosedürler onaylanmış ve NIH ACUC kurallarına uygundur oylandı. <ol><li> Otoklav cerrahi aletler cerrahi başlatmak için önce (121 ° C, 30 dakika sterilizasyon, 20 dakika kuruma süresi). Hemen tüm prosedürler ve önceki otoklav aşağıdaki bir ultrasonikatör tüm enstrümanları temizleyin. Sağkalım ameliyat sırasında steril koşullar koruyun. Birden hayvanları gerektiren ameliyatlar için,% 70 alkol, ultrasonicate ve boncuk sıçanlarda arasında sterilize ile cerrahi aletler silin. Gerekli aletleri Malzeme Listesine bakınız. </li><li> Ameliyat için, sıçan hazırlayın. Burada Erkek Sprague-Dawley (180-200 g) kullanın. <ol><li> Ksilazin (8 mg / kg) ve ketamin (/ kg ile 80 mg), intraperitonal enjeksiyonlar izledi 3 dakika boyunca (4-5% Isoflurane 1000 cc / dakika verilir) gaz izofluran kullanılarak sıçan anestezisi. Kurumasını kornealar korumak için oftalmik merhem sürün. Bkuyruk veya ayak tutam aşağıdaki çekme refleksi eksikliği gösterdiği gibi sıçan kez Eğin cerrahi derin anestezi olduğunu. </li><li> Biraz orta karın bölgesine kaburga (düşük göğüs bölge) altında karın bölgesini tıraş. Cerrahi parkı% 70 alkol ve Betadinede fırçalayın alternatif üç kez, fırçalayın. Steril cerrahi örtüler ile steril cerrahi alanda yatar pozisyonda sıçan yerleştirin. </li></ol></li><li> 7,6 x 10 9 vg / ml (son konsantrasyon) &#39;daki AAV-glukozit-SERCaMP seyreltilir. Tersine tüp iyice karıştırın. Not: viral konsantrasyon aralığı (Şekil 4) değişebilir. <ol><li> Pipet steril kap içine seyreltildi AAV 105 ul. Bir şırınga içine virüs toplamak için 30 iğne kullanın. </li></ol></li><li> AAV-glukozit-SERCaMP karaciğer ortaya çıkarmak ve enjekte etmek ameliyat. <ol><li> Önceki karın bir kesi yapmadan, insizyon alanı% 0.25 bupivakain uygulayın. Bir neşter kullanılarak, göğüs kafesinin altında yatay bir kesi (ap yapmakproximately 2-3 cm). Hipodermis gelen bağ dokusu ayırmak için disseke künt. </li><li> Karaciğer sağ lobunu medial açığa karın kası kesti. Not: Diğer loblar son uygulamaya göre enjekte edilebilir. </li><li> Cerrahi mikroskop altında hayvan koyun ve görüş alanında karaciğer sağ lobunu medial almak için ayarlayın. Medial lob parankimi içine virüs enjekte; 3 ayrı siteler, site başına yaklaşık 33 ul. Not: Tüm enjeksiyon hacminin teslim edilmesini sağlamak için enjeksiyonu takiben 5-10 saniye dokuda iğne bırakın. </li><li> Ayrı ayrı karın kas ve cilt sütür ve pamuk uçlu aplikatör kullanarak Neosporin ekleyin. Bilinç kazanmış ve sıçan dik pozisyonunu koruyabiliyor kadar bir iyileşme odasında sıçan yerleştirin. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sıçan (ler) gözetimsiz bırakmayın. Ev tek başına kesi iyileşene kadar ve dikişler (7-14 gün) kaldırılmıştır. <br/&gt; Not: NIH ameliyat sonrası kurallar gereği, cerrahi kaydını tutmak. Prosedür, tarih, deney tanımlayıcısı, vücut ağırlığı ve cerrahi gününde kafes kartı açıklama. Ağrı / sıkıntı, dışkı üretim, aktivite, gıda ve su tüketimi izlenir ve 3 gün sonrası ameliyat kayıt altına alınmaktadır. Biz genellikle cerrahi sonrası ağrı veya sıkıntı belirtileri gözlemlemek olmamasına rağmen Post-operatif analjezi içme suyu (450 mg / 100 cc) asetaminofen eklenerek sağlanır. </li></ol></li><li> 4-7 gün enjeksiyonundan sonra kuyruk kan toplama başlayın. Etiketleme ve ön tartarak kan alma tüpleri hazırlayın. Her tüpe 50 ul heparin (1000 U / ml) eklenir. </li><li> (1000 cc / dak teslim% 4-5 İsofluranın) 3 dakika boyunca izofluran anestezi odasına yerleştirin sıçan. (500 cc / dak teslim% 2-3 İsofluranın) burun konisi odasından ve yerden sıçan çıkarın. Kuyruk pi aşağıdaki çekme refleksi eksikliği ile gösterildiği gibi kan toplama sıçan derinden uyuşturulduktan sonra başlayabilirnch. <ol><li> Steril makas kuyruk (1-2 mm) kesilerek ucu kullanarak ve önceden doldurulmuş heparin tüp içine damla damla kan toplamak. Heparin oranı (&gt; 100 ul kan / 50 ul heparin) 1 kan: hacim 2&#39;den büyük ulaşana kadar kan toplayın. Kan alma hacimleri deneysel tasarım dayalı olarak ayarlanabilir. Kanamayı durdurmak için kuyruk kanamayı durdurucu pudra uygulamak için ıslak pamuk aplikatör kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın kan tüpleri sonraki örneklerin toplanması durumunda. Koleksiyonlar arasında sterilize etanol pedi ve boncuk ile makas silin. </li><li> Toplama tüpleri tartılır ve 2 elde heparin ile ayarlayın: 1 oranını (kan: heparin). Bu adım, her bir örnek (Tablo 1) &#39;de heparin miktarını normale olacaktır. </li><li> Santrifüj tüpleri 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de. Lusiferaz deneyi (bölüm 5) zamanına kadar -80 ° C taze tüp ve saklamak için yüzer (plazma) aktarın. Not: 72 saat kadar önce, enzimatik deney için 4 ° C&#39;de numunelerin depolama &#39;ye sahiptirlüminesans (Şekil 5A) üzerinde inimal etkisi. Plazma numunelerinin 3 kadar donma-çözülme döngüsünden lüminesans üzerinde etki göstermemiştir (Şekil 5B) sahiptir. </li></ol></li><li> Thapsigargin uygulama (pozitif kontrol): <ol><li> 2.5 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar etanol içinde seyreltilerek thapsigargin hazırlayın. Alt karın içine 1 mg / kg ip thapsigargin enjekte edilir. Not: thapsigargin trombine bağlı platelet pıhtılaşmasını 17 artar ve daha zor kuyruk kan alma yapabilir. </li></ol></li><li> Gaussia lusiferaz deneyi: <ol><li> Buz üzerinde plazma örnekleri çözülme. Uzunlamasına çalışmalarda, çözülme için ve (alt tabakanın tek hazırlık kullanarak) aynı gün tüm timepoint örnekleri için ışıldama tahlil gerçekleştirin: Not. </li><li> Opak duvarlı plaka transfer plazma 10 ul ve kesit her bir plazma numunesinin 5. Çalışma 3-4 teknik çoğaltır tarif edildiği gibi enzimatik aktivitesini ölçmek. </li></ol></li><li> Euthanasibir Not: SERCaMP teknolojinin avantajı monitör ER kalsiyum uzunlamasına yeteneğidir. Deneysel parametreleri ve son nokta analizleri bağlı hayvanlar son nokta analizleri için uygun ve kurumsal ACUC kurallarına uygun önlemler ötenazi edilmelidir. </li></ol> 5. Lüminesans Deneyi <ol><li> 20 mM (3 ml metanol, 10 N HCI 30 ul) ile asitleştirildi, metanol içinde bir bileşik seyreltilmesiyle coelenterazine (CTZ) stok çözelti hazırlayın. -80 ° C tek kullanımlık alikotları ve mağaza hazırlayın. </li><li> Deney gününde çalışan alt-tabakanın hazırlanması. <ol><li> In vitro değerlendirmeler için, örneğin, PBS içinde 8 uM koelenterazin seyreltik PBS, 25 ml 20 mM CTZ stokunun 10 ul (Şekil 6A, B). </li><li> İn vivo deneyler için, PBS içinde 100 uM, 500 mM askorbik asit, 5 mM NaCl koelenterazin seyreltin. </li></ol></li><li> En az 30 dakika süreyle inkübe edin hazırlanan CTZtahlili başlamadan önce oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Not: hazırlanması sonra ilk 30 dakika boyunca hızlı bir şekilde alt-tabaka çürüme çalışma vardır Bu adım genellikle Gaussia lusiferaz analizleri dahildir. Bizim sistemde (Şekil 6C) bu etkiyi gözlenen değil; Biz tahlil üzerinde hiçbir olumsuz etkisi bulduk gibi ancak, biz sık sık kuluçka aşamasını içerir. </li><li> İzleme biyolüminesans edebilen bir alt-tabaka enjektör ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak. Substrat ile Başbakan hatları. Not: hatları üzerinden, ilk alt-tabaka bozunmaya eğilimli olabilir. Erken örnekleri için yapay olarak düşük okumaları önlemek için deneysel örnekleri ölçümünden önce (okuyucu boş bir levha yüklenmesi) 20-30 boş kuyu enjekte edilir. </li><li> , Kuyunun içine substrat 100 ul enjekte 5 saniye boyunca orta hız sallamak ve ışık emisyon ölçümü. Biotek Sinerji II plaka okuyucu için, (0.5 sn boyunca (in vitro örnekleri) ve 5 saniye ışık emisyonu entegreokuma adımı için in vivo örnekleri). İdeal tahlil performansı için plaka okuyucu parametrelerini optimize. Not: (diğer lusiferazlarm gözlenen kinetik kızdırma karşılaştırıldığında) hızlı sinyal çürümesi ile Gaussia lusiferaz sergiler flaş kinetiği. Glukozit flaş kinetiği örnekleri arasında, orta bileşimin kontrol edilmesinin önemini vurgular hücre kültür ortamı (Şekil 7A) serum etkilenir. Nedeniyle alt tabaka (flaş kinetik) eklendikten sonra lüminesans hızlı çürüme, enjekte ve tüm örnekler için üniform olmalıdır adımları okumak arasında zaman. Plaka okuyucu (biz 5 sn sallamak adımı kullanmak gibi) ve bu iyi okumak sabit bekleme süresi, bir kuyunun alt tabakayı enjekte ayarlanmalıdır. Alt-tabaka, aynı anda tüm oyuklara ilave edilebilir sürece okumadan önce bütün bir plaka alt-tabakanın eklenmesi önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bir enjektör kullanılabilir durumda değilse, sorunu kısmen alt-tabaka addin arasında 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırılarak atlatılabiliryon ve ölçüm (Şekil 7B) (böylece bozulma eğrisinin dik parçası kaçınarak). </li><li> , Enjeksiyon Tekrar bekleme süresi ve iyi plaka üzerinde her adımları okuyun. </li></ol>

<ol><li>Sitia, R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum+protein+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory.</a> Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).</li>
<li>Fu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+lipid+metabolism+disrupts+calcium+homeostasis+causing+liver+endoplasmic+reticulum+stress+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity.</a> Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).</li>
<li>Micaroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in intracellular trafficking.</a> Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).</li>
<li>Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic-reticulum+calcium+depletion+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+probes+for+measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium.</a> Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).</li>
<li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2%2B+dynamics+in+high+Ca2%2B+concentration+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li>
<li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intraorganellar+Ca2%2B+at+subcellular+resolution+using+CEPIA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nat Commun. 5, 4153(2014).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).</li>
<li>Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCaMP%3A+a+carboxy-terminal+protein+modification+that+enables+monitoring+of+ER+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis.</a> Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).</li>
<li>Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+astrocyte-derived+neurotrophic+factor+%28MANF%29+secretion+and+cell+surface+binding+are+modulated+by+KDEL+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors.</a> J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).</li>
<li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+4-%282-hydroxyethyl%29-1-piperazine%C3%ABthanesulfonic+acid+%28HEPES%29+as+a+tissue+culture+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).</li>
<li>Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cytotoxic+effects+of+light-exposed+HEPES-containing+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).</li>
<li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li>
<li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
<li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+gene+therapy%3A+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, in vitro vurgular ve glukozit-SERCaMP in vivo programı ER kalsiyum tükenmesi izlemek için. SERCaMP oluşturmak için protein modifikasyonu, diğer raportör protein 12 genelleme gibi görünüyor olsa da, biz diğer lusiferazlarm 18 oranla sağlam (200-1,000 kat daha büyük) biyoparlaklık için Gaussia lusiferaz seçti. Primer sıçan kortikal nöronlarında, SH-SY5Y hücrelerinin ve sıçan karaciğer teslim glukozit-SERCaMP virüsünün 100 katı doz aralığında tespit tha...

Endoplazmik retikulum (ER) 1 sinyalizasyon protein katlanması, protein salgılanması, lipid homeostazı ve intraselüler dahil olmak üzere birçok hücresel kapasitelerde çalışır. Normal ER işlevine Merkez ~ 5000 kez luminal kalsiyum konsantrasyonlarını sitoplazma 2-4 bulunanlar sürdürmektedir. Bu enerji yoğun bir süreç Sarko / endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), ER içine kalsiyum iyonlarını hareket eden bir pompa tarafından düzenlenir. ER kalsiyum bir akış esas olarak riyanodin (RyR) ve inositol trifosfat (IP3R) reseptörleri tarafından aracılık eder. Birçok ER işlemler kalsiyum bağımlı olduğundan, mağaza kesintiye ER stres ve sonuçta hücre ölümüne neden olabilir. ER, kalsiyum disregülasyon, kardiyomiyopati, diyabet de dahil olmak üzere, Alzheimer hastalıkları gözlenmiştir, ve Parkinson 5. Bu hastalıkların ilerleyen doğası nedeniyle, bir sebep-sonuç yeniden çizmek için zorlu olmuşturER kalsiyum deposunda patogenezi ve değişiklikler arasında lationship. Teknolojilerin bir dizi boyalar ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) dahil ER kalsiyum dinamikleri, anlayışımızda önemli gelişmeler için izin vermiş. Ca2 + bağlandığmda floresanstaki artış, düşük afinite kalsiyum boyalar, kalsiyum 6 konsantrasyonu yüksek olan hücre içi bölmelere incelemek için hücrelere yerleştirilebilir. Böyle D1ER ve Catcher olarak geçiş, subsellüler lokalizasyonu 7-9 daha hassas kontrolü ile kalsiyum dalgalanmaların izlenmesi için izin verir. Son zamanlarda, geçiş bölgesinin bir başka sınıfı olarak adlandırılır kalsiyum ölçüm organel tutulmuş protein göstergeleri (CEPIA) 10 tarif edilmiştir. Genetik ve birleştiren üçüncü bir yaklaşım küçük moleküllü kimya hedeflenen esteraz boya yükleme bir ester bazlı kalsiyum boya 11 (ER hedeflenen) genetik olarak kodlanmış karboksilesteraz kullanır (TED). Afor ikenementioned yaklaşımlar da floresan akut ölçümlerle aracılığıyla ER kalsiyum dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir, doğal güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bununla birlikte, çoğu zaman, hastalığın ilerlemesini araştırmak için gerekli boyuna çalışmalar için uygun değildir. Zaman genişletilmiş süreler boyunca kalsiyum dinamiklerini izlemek için bir yöntem oluşturulması amacıyla, biz tespit ve salgılanan ER kalsiyum izleme proteinleri (SERCaMPs) 12 oluşturmak için bir protein modifikasyonu geliştirdi. SERCaMP defalarca ER kalsiyum deposu sorgulamak için minimal invaziv bir yaklaşım sağlayarak, diğer yöntemlerle ilişkili çeşitli sınırlamalar circumvents. Daha önce karboksi-terminal peptit ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-treonin-aspartik asit-leucine) ER-retensiyon teşvik etmek için yeterli olduğunu göstermiştir; Bununla birlikte, ER kalsiyum düşüşler neden olan koşullar altında, peptid dizisi, artık ER localizatio muhafaza edebilmektedirn ve protein 13 salgılanır. SERCaMP teknoloji temelinde bir salgılanmış proteininin karboksi-terminalinde salgılanması dolayısıyla ER kalsiyum disregülasyonun 12 sağlam bir raportör oluşturma ER kalsiyum azalması ile tetiklenir, bu durumda (örneğin, lusiferaz Gaussia veya glukozit) için ASARTDL bir ek alım düzenidir. Transgenik yöntemlerle glukozit-SERCaMP ekspresyonu ER Kalsiyum homeostazında bir göstergesi olarak glukozit aktivitesindeki değişikliklerin analiz edilmesi için hücre kültür aracı ve plazma da dahil olmak üzere, biyolojik sıvıları sağlar. Yöntem, in vitro ve in vivo olarak ER kalsiyum deposunda progresif değişiklikler uzunlamasına çalışma için uygulamalar vardır. Aşağıdaki protokol ER kalsiyum homeostazını incelemek için glukozit merkezli SERCaMP kullanmak için genel bir taslak olarak yazılır, ama protokol alternatif raportör SERCaMPs için bir rehber olarak hizmet verebilir.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml tüpler</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>%10 NP-40 çözeltisi&nbsp;</td><td>Hücre içi GLuc testleri için</td> <td>Pierce</td><td>28324</td></tr><tr><td>1 ml luer-lok şırıngalar</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>200 mikrolitre filtre uçları</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 cerrahi sütürler</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>30 G iğneler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkanlı mikroplaka sızdırmazlık levhaları</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Alkol hazırlama pedleri</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Anestezi Otomatik Akış Sistemi</td><td>EZ Anestezi</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Hayvan kurtarma odası</td><td>Lyon Veteriner</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Betadine çözeltisi</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sığır büyüme serumu</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk uçlu aplikatörler</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Kesme iğneleri 3/8 daire sütürler</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Dijital ultraskonik temizleyici</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz, GlutaMAX, piruvat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DNA kütle merdiveni</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia lusiferaz (rekombinant protein)</td> <td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia lusiferaz antikoru (WB, ICC veya IHC için)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1: 2.000 (WB)</td></tr> <tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Gluc test plakaları (96 kuyulu, opak)</td> <td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in dengeli tuz çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran Uşak</td><td> Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Styptic toz</td><td>Uşak Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj 22R Santrifüj</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Jel ve PCR Temizleme</td><td>Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X hızlı titre kiti</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>PCR film contası</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Kömür Filtresi bidonu</td><td>EZ Anestezi</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçakları, # 10</td><td>Güzel Bilim araçları A.Ş</td>. <td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>SD sıçanlar 150-200 g</td><td>Charles Nehri</td><td>Sıçanlar</td>: <td>150-200 g sipariş edilen sıçanlar. Varıştan 5 gün sonra ameliyat</td></tr><tr><td>Küçük hayvan kulak küpeleri</td><td>National Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Steril cerrahi örtüler</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 plaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td></td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td> 4304437 <td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>zararlı insan sağlığı</td></tr><tr><td>Virapower lentiviral ambalaj karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Transfeksiyon reaktifi</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

bir kullanılması endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; gaussia</em&gt; lusiferaz sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplazmik retikulum (ER) konsantrasyonu yaklaşık sitoplazmik kıyasla daha fazla 5000 misli, hücre içi kalsiyum üst düzeyde bulunmaktadır. ER kalsiyum üzerinde sıkı kontrol protein katlanması, modifikasyonu ve insan ticareti için zorunludur. ER kalsiyum düzensizlikler katlanmamış protein karşılığının bir üç uçlu ER stres tepkisi mekanizmasının aktivasyonu ile sonuçlanan ve hastalıkların çok çeşitli patogenezine katkıda bulunabilir. Hastalık başlangıcı ve ilerlemesi sırasında ER kalsiyum değişiklikleri izleme yeteneği pratikte prensipte önemli, ama zor olduğunu. Kalsiyum bağımlı floresan boyalar ve proteinler gibi izleme ER kalsiyum yönelik güncel yöntemler arasında, ancak bu araçlar, in vivo çalışmalar için uygun değildir, hücrelerde ER kalsiyum dinamiklerinin kazanmasını sağlamıştır. Bizim laboratuvar Gaussia lusiferaz karboksi-terminalinde bir modifikasyon yanıt olarak raportör salgılanmasını sağladığını göstermiştirER kalsiyum tükenmesi. In vitro ve in vivo uygulamaları bir lusiferaz göre, salgılanan ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) kullanmak için yöntemler burada tarif edilmiştir. Bu video ER kalsiyum boyuna izlenmesi için karaciğer enjeksiyonları, glukozit-SERCaMP, kan toplama ve işleme farmakolojik manipülasyon ve tahlil parametrelerini vurgulamaktadır.

Glukozit-SERCaMP yöntemi dışı sıvılar örnekleyerek ER kalsiyum homeostasisin değerlendirilmesi için izin verir. Birkaç kontrol sonuçların yorumlanmasını geliştirmek için deney tasarımı dahil edilebilir. İlk olarak, (C-terminali ASARTDL veya &quot;glukozit-Resim Tag&quot; olmayan, örneğin glukozit) kurucu salgılanmış habercinin kullanılması salgı yoluna (global hücresel sekresyon) ve transgen ekspresyonu üzerindeki deneysel tedavilerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Örneğin, glukozit-SERCaMP ve glu...

Endoplazmik retikulum kalsiyum homeostazı çeşitli patolojilerde bozulur. ER kalsiyum deposundaki bozulmaları tespit etmek için salgılanan bir ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) raportörü kullanılabilir. Bu protokol, ER kalsiyum homeostazını in vitro ve in vivo olarak incelemek için bir Gaussia lusiferaz SERCaMP'nin kullanımını açıklar.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, salgılanan bir raporlayıcı protein kullanarak endoplazmik retikulum kalsiyum disregülasyonunu zaman içinde izlemektir. Bu işlem, hedef dokunun, özellikle de karaciğerin viral vektör aracılı transgenezi ile gerçekleştirilir. Gai lüsiferaz circa raporlayıcısı ile yapılan bu örnekte, dokudan salınan circa miktarını ölçmek için kan gibi bir sonraki biyolojik sıvı toplanır, ardından plazma örneklerine lüsiferaz substratı eklenir ve ER kalsiyum tükenmesini belirlemek için lüminesans ölçülür.Sonuçlar, plazma C camp seviyelerindeki artışla belirtilen ER kalsiyum disregülasyonunu göstermektedir; ER homeostazı, biyolojik sıvıların küçük hacimlerinin tekrarlanan örneklemesi yoluyla uzun süreler boyunca izlenebilir. Bu tekniğin, düşük afiniteli kalsiyum boyaları veya genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ER kalsiyum homeostazının minimal invaziv bir prosedür aracılığıyla in vivo olarak zaman içinde izlenebilmesidir. Bu tekniğin iki terapötik yolu bulunmaktadır.Birincisi, ER kalsiyum homeostazını normal fizyolojik duruma getirebilen veya koruyabilen ilaçların taranmasıdır. İkinci yaklaşım ise, terapötik proteinleri, ER kalsiyum tükenmesine yanıt olarak salgılanan terapötik AMP'lere dönüştürmektir. Bu yöntem, karaciğerdeki ER kalsiyum disregülasyonu hakkında bilgi sağlayabilir.Beyin, kalp, kas veya pankreas gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Anestezi uyguladıktan sonra, metin protokolüne uygun olarak, bir sprat dolly sıçanına oftalmik pomad uygulayın ve anestezinin gerçekleştiğini doğrulamak için kuyruk sıkıştırma testi yapın; kaburgaların biraz altından orta karın bölgesine kadar olan karın bölgesini tıraşlayın ve cerrahi alanı Betadine ve %70 etanolü dönüşümlü kullanarak üç kez fırçalayın. Ardından sıçanı steril bir cerrahi alanda sırtüstü pozisyona getirin ve steril cerrahi örtülerle örtün; a v gluc samp örneğini kullanıcı tarafından optimize edilmiş konsantrasyona kadar seyreltin.Bu vakada, mililitre başına 7,6 x 10⁹ viral genom kullandık ve tüpü tersyüz ederek karıştırdık. Ardından, seyreltilmiş AAV'den 105 µL'yi steril bir kaba pipetleyin ve virüsü bir şırıngaya toplamak için 30 gauge'lik bir iğne kullanın. Enjeksiyon için karaciğeri açığa çıkarmak amacıyla hedef insizyon bölgesini bir skalpel kullanarak işaretleyin.Kaburga kafesinin altına yaklaşık iki ila üç santimetre uzunluğunda yatay bir insizyon yapın. Bağ dokusunu hipodermisten ayırmak için künt diseksiyon uygulayın. Karın kasını keserek karaciğerin sağ medial lobunu açığa çıkarın.Ardından, hayvanı cerrahi bir mikroskobun altına yerleştirin ve karaciğerin sağ medial lobunu görüş alanına getirecek şekilde ayarlayın. Daha sonra şırıngayı kullanarak, toplam virüs hacminin üçte birini sağ medial lobun parankimindeki üç farklı bölgeye enjekte edin; tüm enjeksiyon hacminin verildiğinden emin olmak için iğneyi enjeksiyondan sonra beş ila 10 saniye boyunca dokuda bırakın, karın kasını ve insizyonu sütüre edin ve Neosporin uygulamak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Sıçanı, bilinci yerine gelene ve dik pozisyonunu koruyabilene kadar bir iyileşme odasına yerleştirin, ardından hayvanı tekli konaklamalı ev kafesine geri götürün.Enjeksiyondan dört ila yedi gün sonra. Kan toplama tüplerini etiketleyerek ve önceden tartarak hazırlayın. Ardından her tüpe 1000 units/mL konsantrasyonunda 50 µL heparin ekleyin.Sıçanı metin protokolüne uygun olarak anestezi altına aldıktan sonra, sedasyonu doğrulamak için kuyruk sıkıştırma testi uygulayın ve steril makas kullanarak kuyruğun uç kısmından yaklaşık bir ila iki milimetreye kadar kesin. Kanamayı durdurmak için, 100 µL'den fazla kanı damla damla heparinle önceden doldurulmuş bir tüpe toplayın.Kuyruğa STIC tozunu uygulamak için ıslak bir pamuklu aplikatör kullanın. Toplamalar arasında makasları silmek için etanol pedi kullanın ve boncuk sterilizasyonu yapın. Kan tüplerini dört derece Celsius'ta saklayın.Sonraki örnekler toplanacaksa, toplama tüplerini tartın ve kan ile heparin arasında ikiye bir oran elde etmek için heparini ayarlayın. Bu adım, her örnekteki heparin miktarını normalize edecektir. Tüpleri 2000 ×g ve dört °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Plazma süpernatantını yeni bir tüpe aktarın ve lüsiferaz analizi için pozitif kontrol olarak thaa garin uygulamak üzere 72 saate kadar 4 °C'de veya uzun süreli saklama için -80 °C'de muhafaza edin. Etanol ile 2,5 mg/mL nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Ardından, alt karın bölgesinden intraperitonal olarak 1 mg/kg dozunda enjekte edin.Yukarıda açıklandığı gibi, enjeksiyondan 24 saat sonra ilk kan örneğini alın. Lüminesansı ölçmek için, selen ezine çalışma substratını metin protokolüne göre hazırlayın ve ışıktan korunmuş şekilde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Bu sırada, tüm örnekleri buz üzerinde çözün ve biyolüminesansı izleyebilen ve bir substrat enjektörü ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak 10 µL plazmayı opak duvarlı bir plakaya aktarın. Hatları substrat ile hazırlayın. Bir kuyucuğa 100 µL substrat enjekte edin.İn vitro örnekler için orta hızda beş saniye boyunca çalkalayın ve ışık emisyonunu ölçün. Okuma adımı için ışık emisyonunu 0,5 saniye boyunca entegre edin; in vivo örneklerde ise ER kalsiyum homeostazını değerlendirmek için okuma adımında beş saniye boyunca entegre edin. Gluc SAR Camp yöntemi kullanılarak, bu durumda Gluc Noag gibi sürekli salgılanan bir raporlayıcı dahil olmak üzere çeşitli kontroller eklenebilir.Deneysel koşullara yanıt olarak hem GLUC SAR camp hem de Gluc noag ekstrasellüler seviyelerindeki artış belirsiz bir sonuç olarak değerlendirilir. Ancak, gluc noag yanıtı olmaksızın gluc SAR camp salgılanmasındaki artış, ER kalsiyum bağımlı bir olayı destekler. Yeni paradigmalarla SAR camp salınımına ER kalsiyumun katkısını doğrulamak için ER kalsiyum deposunun farmakolojik modülatörleri kullanılabilir.Örneğin, burada gösterildiği üzere, ER kalsiyumunu stabilize eden bir INE reseptör antagonisti olan dantrolene, thic argon'a yanıt olarak SAR camp salınımını inhibe eder. Gluk bazlı SAR camp kullanılan in vitro çalışmalar için, tedavi ile indüklenen yanıt en iyi şekilde zaman seyri boyunca değerlendirilir. Kontrollere karşı bir plaka içindeki göreceli yanıttaki değişiklikler takip edilmelidir; substrat bozulmasının ham değerlerde değişikliklere yol açabileceği çoklu plakalar arasında ham sayıların karşılaştırılması tavsiye edilmez. In vivo çalışmalar için veriler, her hayvanın kendi ön tedavi kontrolü olarak hizmet ettiği şekilde, her hayvan için bağımsız olarak değerlendirilmelidir.Bu, hayvanlar arasındaki transgen iletimi ve ekspresyonundaki değişkenlikleri hesaba katmak için gereklidir. Bu videoyu izledikten sonra, karaciğer hastalığının kemirgen modellerinde ER kalsiyum düzenlemesini incelemek için sircam teknolojisinin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Viral vektörlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipmanın giyilmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Kaynak: Bannai, H., et. al., Kültürlenmiş Hücrelerde Yerel Ca2+ Sinyallerinin Membran Hedefli Ca2+ Göstergeleri ile Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Video, plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde lokalize kalsiyuma duyarlı proteinleri sırayla izleyerek astrositlerde kompartmana özgü spontan kalsiyum dinamiklerini gözlemlemek için floresan görüntülemeyi göstermektedir.

Astrositlerde Kompartmana Özgü Dinamikler için Spontan Kalsiyum Görüntüleme

Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED) floresan görüntüleme ile hücre içi kalsiyum deposu dinamiklerinin analizini destekler. Yöntem sentetik düşük afinite Ca yerel maskesinin geliştirir endoplazmik retikulum (ER), bir rekombinant karboksilesteraz hedeflenmesi...

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Bu iletişim kuralı hemipteran böcekler, yaprak bitleri gibi besleme tarafından üretilen bitkilerde kalsiyum sinyalleri analiz etmek için basit bir yöntem özetliyor. GFP kalsiyum Biyoalgılayıcı GCaMP3 ile dönüştürülmüş Arabidopsis thaliana kalsiyum dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü ile gerçek zamanlı vivo içinde görüntüleme için izin verir.

Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Öğrenin endoplazmik retikulum kalsiyum dengesizliğini Gaussia lusiferaz SERCaMP ile izleme yöntemini. Viral vektör aracılığıyla karaciğerde transgenesis yaparak biyolojik sıvılardan örnek alın ve luminesans ölçümüyle kalsiyum homeostazını uzun süre takip edin.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme

Daha fazla video keşfet