Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

Bu prosedürün genel amacı, tavuk embriyolarından bütün retinal implantları deneysel olarak diseke etmek, manipüle etmek ve kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle tavuk embriyosundan her iki gözün toplanması ve bir Petri kabına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ince pensler kullanılarak sklera ve pigment epitelyumunun çıkarılmasıdır.

Ardından, tüm retinal açıklık, düz dairesel elektrotlar kullanılarak plazmid DNA elektroporasyonuna tabi tutulur. Son adım ise retinal açıklığın, bir inkübatördeki 24 kuyucuklu plakada, kültür ortamında inkübe edilmesidir.

Son aşamada, retinal implantların tamamı fikse edilir, kriyoseksiyon yöntemiyle kesitleri alınır ve retinal nöronları görselleştirmek için immünofloresan mikroskopi ile analiz edilir. Bu tekniğin, in OVO elektro operasyonlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı hızlı olması, uygulanmasının kolay olması ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamasıdır. Bu yöntem, inkübasyonu takiben, nörojenezin enzim inhibitörleri veya hücre döngüsünü hedefleyen gen ürünleri gibi spesifik kimyasal reaktiflerden nasıl etkilendiği gibi merkezi sinir sistemi gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

İstenen embriyonik yaştaki yumurtaları laminer akış kabinine yerleştirin ve embriyonun kontamine olmasını önlemek için yumurta kabuklarını %70 etanol ile silin. Yumurtayı kırmak için yan tarafını sert bir yüzeye kuvvetlice vurun ve ardından içeriği 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Dokunun kurumasını önlemek için embriyoyu, içinde 37 °C'de önceden ısıtılmış PBS bulunan 35 mm'lik bir Petri kabına aktarmak üzere küçük bir kaşık kullanın.

Ardından, embriyoyu kafasını kopararak öldürün ve embriyonik dokuyu içeren 35 milimetrelik Petri kabını laminar akışlı kabindeki binoküler stereo diseksiyon mikroskobunun üzerine yerleştirin. İnce pensler kullanarak gözün ventralindeki ağız kısmından bir insizyon yapın. İnsizyon bölgesinden başlayarak, gözün tamamını çevreleyen dokuyu yırtarak açın.

Ardından, optik siniri sıkıştırarak koparın ve sağlam gözü göz çukurundan çıkarın. Hem kontrol hem de işlem görmüş göz olarak kullanmak üzere aynı embriyodan hem sol hem de sağ gözü toplayın. İnce pensler kullanarak gözleri, önceden ısıtılmış PBS içeren yeni bir 35 milimetrelik Petri kabına aktarmak için küçük bir kaşık kullanın.

Sklera on laga dahil olmak üzere gözün etrafındaki tüm dokuları temizleyin. Ardından, nöral retinaya zarar vermemeye dikkat ederek, gözün dorsal kısmındaki pigment epitelinde küçük bir insizyon yapın. Daha sonra, insizyon yerinden başlayarak pigment epiteliyle yavaşça yırtarak açın.

Lensi ve retinanın tamamını vitreus gövdesine bağlı bırakın. Gözün ön bölgesindeki pupil çevresindeki siliyer cisim boyunca ve çıkarılması zor olduğu için koroid fissürü boyunca dikkatli davranarak pigment epitelyumunu kaldırın. Elektro cihazını açın ve voltajı, hamburger ve Hamilton evre 20 ila 25 retina için 15 volt'a veya evre 26 ila 27 retina için 20 volt'a ayarlayın.

Ardından, puls tekrarlarını 50 milisaniyelik beş puls olarak, puls uzunluğunu ise bir saniyelik aralıklarla ayarlayın. Her iki el de elektrotları yerinde tutmak için gerekeceğinden, zeminde bulunan bir ayak pedalı ile kontrol edilebilen bir puls jeneratörü kullanın. Özel yapım iki adet kürek şeklinde platin elektrodu, puls jeneratöründeki çıkış soketine bağlayın.

Burada gösterilen elektrotlar 0,1 milimetre platin plaka rls'den yapılmış olup 0,8 milimetrelik bağlantı teli izole edilmiştir. Plastik tüp kullanarak, tüm retinal eksplantı, ucu kesilmiş bir polietilen pastör pipeti yardımıyla dikkatlice bir vete'ye aktarın. Retinanın plastiğe yapışma ve yırtılma eğilimi olduğu için pipet uçları kullanmaktan kaçının.

Ardından, retinal explanı çevreleyen tüm PBS'yi nazikçe uzaklaştırmak için 100 µL'lik bir pipet kullanın. Retinayı yırtmamak için ona temas etmemeye özen gösterin. QVE'ye 100 µL seyreltilmiş plazmit çözeltisi ekleyin ve tüm retinal explanın çözeltiyle kaplandığından emin olun.

Retinal preparat yukarı çıkarsa, pens yardımıyla nazikçe aşağı itiniz. Lensin vete'nin herhangi bir yanına bakacak şekilde konumlandırılması ve optik sinirin vete'nin tabanına yönlendirilmesi için pens elektrotlarını kullanınız. Ardından, dokuya temas etmeden pozitif elektrodu lensin önüne, negatif elektrodu ise retinanın arkasına yerleştiriniz.

Ayak pedalına basarak akımı uygulayın ve başarılı bir boşalmayı gösteren elektrotlardaki kabarcıkları kontrol edin. Retinaya zarar vermeden tüm plazmit karışımını qve'den çıkarmak için 100 µL'lik bir pipet kullanın. Plazmit karışımı, plazmit çıkarıldıktan sonra üç ila beş kez yeniden kullanılabilir.

Vete'yi önceden ısıtılmış PBS ile doldurun. Retinal eksplanı vete duvarından nazikçe ayırmak için pens kullanın. Ardından, tüm retinal eksplanı bir mililitre önceden ısıtılmış kültür içeren 24 kuyucuklu plakaya aktarmak için pipetinizin polietilen ucunu kullanın.

Her kuyucukta yalnızca bir retinal eksplant inkübe edin. Retinal eksplantı 37 °C ve %5CO2 sıcaklık ile 50 RPM sabit hızda bir rotator çalkalayıcıda inkübe edin. Rotasyon, besiyerine maksimum maruziyeti sağlar ve retinanın 24 kuyucuklu plak tabanına yapışmasını önler.

24 saatlik kültürlemenin ardından, elektroporasyonun geniş bir retinal alanın plazmidi almasını ve reporter genini eksprese etmesini sağlaması sonucunda, sağlam retinanın büyük bir kısmında GFP pozitif hücreler görünür hale geldi. Kesit alma işleminden sonra, retinanın ACO bazal ekseni boyunca tekil GFP pozitif hücreler kolayca tespit edildi. Tüm retinal eksplant yaklaşık 24 saat daha kültürlenebilir.

İnkübasyon süreleri gelişimsel gecikmeye, morfolojik malformasyonlara, apoptoza ve nihayetinde retinanın bütünlüğünün bozulmasına yol açabilir. 24 saat boyunca kültüre edilen bütün bir retinal eksplanttan alınan bir kesit, burada kırmızı kanalda görünen fosfo histon üç ile immün boyanmıştır; fosfo histon üç, geç G2 fazındaki hücreleri işaretler. pH üç pozitif hücreler, normal retinal gelişimle uyumlu olarak retinanın apikal tarafında tespit edilmiştir.

Burada gösterildiği gibi, bu gelişim bir CDK 1/2 inhibitörü eklenerek engellenebilir; görüntüleme öncesinde inhibitör ile dört saat boyunca inkübasyon yapmak, gelişim sonrası retinadaki pH 3 pozitif hücrelerin sayısını önemli ölçüde azaltmıştır. Bu teknik, yeni DNA plazmitlerinden rapor edilen gen ekspresyonlarını incelemek ve retinal eksplantları, DNA hasar yolu ve hücre döngüsü düzenleyicileri dahil olmak üzere kimyasal reaktiflerle işlemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu prosedürün ardından, sonuçları daha fazla teyit etmek amacıyla in ovo elektroporasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.