Name: Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin, tavuk embriyolarından bütün retina eksplantlarını disseksiyon, elektroporasyon ve kültür yöntemleriyle nasıl hazırlayacağınızı. Bu teknik, plazmid DNA transferi ve retinal gelişim çalışmaları için güvenilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma Barncancerfonden (PR2013-0104), İsveç Araştırma Konseyi (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond ve St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol &quot;vizyonu ve Oftalmoloji araştırma Derneği Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu&quot; nda tavsiyeleri doğrultusunda yapılır. 1. Yumurta Taşıma ve Göz koleksiyonu <ol><li> 1 hafta daha uzun süre 12-14 ° C&#39;de beyaz Livorno yumurta saklayın. Varsa, döllenmiş yumurta saklamak için buzdolabında şarap soğutucu kullanın. Not: düşük sıcaklıklar mortaliteyi artırırken yüksek mağaza sıcaklıkları, embriyo anormal gelişmesine yol açar. Genişletilmiş depolama süresi, mortalite ve anormal gelişimi hem de artırır. </li><li> Yumuşak, 24 saat başına 5 kez sıklıkta sallanan bir 37.5 ° C ve% 60 yumurta nemlendirilmiş kuluçka inkübe edin. </li><li> İstenilen embriyonik yaşta yumurta inkübatör kuluçkaya yumurta çıkarın. Not: Tavuk embriyo yaşı fırınlama süresi olarak belirlenir ve embriyonik gün (E) ya da aşamaları olarak ifade edilmektedir (st), Hamburger ve Hamilton 12 tarafından açıklanan gelişim evrelerinin serilere göre. </li><li> Laminer akış kaputu seçilen yumurta yerleştirin. Embriyonun kirlenmesini önlemek için% 70 etanol ile yumurta kabuğu silin. Not: Steril çözümleri ile aseptik şartlarda tüm işlemleri yürütmek <url> https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> ve aletleri. </li><li> Yumurta açık çatlamak sıkıca sert bir yüzeye karşı yumurtanın yan dokunun. 100 mm Petri kabındaki içeriği yerleştirin. Kurumasını önlemek için doku önceden ısıtılmış (37 ° C) 1x PBS içeren 35 mm Petri kabı embriyo transferi için küçük bir kaşık kullanın. </li><li> Laminer akış kaputu bir binoküler mikroskop stereovision üzerine embriyonik doku içeren 35 mm Petri kabı yerleştirin. Ince forseps ile boyun sıkıştırarak embriyo başını kesmek ve vücudu atın. </li><li> Inci bir kesi yapmak için ince forseps kullanınGöze ventral kaba ağız. Kesi yerinde başlayan, tüm göz çevreleyen doku yırtarak açın. Optik siniri çimdik ve göz prizden sağlam gözü kaldırın. Kontrol veya tedavi göz ya da kullanım için aynı embriyodan sol ve sağ göz hem de toplayın. </li><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C) 1 x PBS içeren yeni bir 35 mm Petri kabı gözleri aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. </li></ol> Tüm Retina Eksplantlarından 2. Hazırlık <ol><li> Skleral anlage dahil gözün çevresindeki tüm doku kaldırmak için ince forseps kullanın. Not: Doku kolayca pigment epiteli bozulmamış (Şekil 1A-B) ile vitreus ve retina mercek üzerinde bırakarak ayırmak olacaktır. </li><li> Nöral retina (Şekil 1C) zarar vermeden, gözün dorsal kısmında pigment epiteli içine küçük bir kesi tutam ince forseps kullanın. </li><li> Yavaşça pigment epitel starti açmak gözyaşı ince forseps kullanın, kesi yerinde ng lens ve vitreus (Şekil 1D) bağlı tüm retina bırakarak. Pigment epitelinin çıkarılmasını kolaylaştırmak için sıcak (37 ° C) 1 x PBS içinde göz tutun. Pigment epitel, gözün ön bölgesinde, öğrenci etrafında siliyer cisim boyunca, özellikle çıkarılması zor olabilir ve koroid fissür boyunca Not:. Bu nedenle, pigment epitel bazı nöral retina (Şekil 1E-F) bırakılabilir. </li></ol> Tüm Retina Eksplantlarından 3. Tedavi <ol start="1"><li> Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon Not: Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon aşama 2&#39;de hemen sonra gerçekleştirilebilir. <ol><li> 1 DMEM: F12 Besin karışımı,% 10 FBS, 10 U / ml penisilin streptomisin, 5 ug / ml insülin, 2 mM L-glutamin ihtiva eden 1 kültür ortamı hazırlayın. </li><li> 1.5 ml tek kullanımlık plastik küvetini kesti (12.5 mm x 12.5 mm x 45 mm) (ya da ince bir testere kullanmak sureti alttan olarak) yaklaşık 8 mm 300-400 ul çözelti tutma kapasitesine sahip herhangi bir küçük kap. </li><li> 0.1 ug / ul son konsantrasyon 1xDPBS tercih edilen bir DNA plazmidi seyreltilir. </li><li> ST20 için 15 V Electroporator ve ayarlanan parametreler açın - ST25 (E3-E4) retina ve st26 20 V - st27 (E5) retinanın. 1 sn aralıklarla 50 msn darbe uzunluğu 5 darbeleri darbe tekrarlar ayarlayın. Her iki elin yerine Elektrotları tutmak için gerekli olacak şekilde kat bir ayak pedalı, edilebilir bir puls jeneratörü kullanın. </li><li> İki kürek biçimli (düz, yuvarlak diam. 4 mm) bağlayın platin elektrotlar (Şekil 2A) puls üreteci üzerine çıkış soketine. Not: Bu protokolde kullanılan platin elektrot üniversite atölyesi tarafından yapılmıştır. Elektrotlar 0.1 mm platin plak &quot;rondelles&quot; (: 950 Pt / 5 Cu platin notu) yapılmıştır. Bağlanma 0,8 mm wiyeniden plastik boru kullanılarak izole edilmiştir. </li><li> Dikkatle retina eksplant için doğru ucu açılma boyutunu elde etmek kesilmiş ucu ile bir polietilen Pasteur pipeti kullanarak küvete (veya eşdeğer küçük kap) Adım 2.3 kadar tüm retina eksplant aktarın. Retina plastik eklemek ve parçalıyorlar eğilimi pipet uçları kullanmaktan kaçının. </li><li> Yavaşça yırtılmasını önlemek için retina dokunmamaya retina eksplant özen çevreleyen tüm 1x PBS kaldırmak için 100 ul pipet kullanın. </li><li> Bütün retina eksplant kapsayacak şekilde küvete 100 ul plazma çözeltisi ekleyin. O üstüne yüzen eğer hafifçe forseps ile retina eksplant aşağıya doğru bastırın. Küvete altına beher ve optik sinir herhangi bir tarafı yüz merceği için forseps veya elektrotlar kullanın. </li><li> Doku dokunmadan, lens ve retina (Şekil 2A) arkasına negatif elektrodun karşısında pozitif elektrot yerleştirin. </li><li>Ayak pedalına basarak akımı uygulayın. Başarılı akıntı belirten elektrotlarda baloncuklar için kontrol edin. </li><li> Retina zarar vermeden küvetin tüm plazmid karışımı kaldırmak için 100 ul pipet kullanın. Plazmid karışımı üç beş kez tekrar edilebilir. </li><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C) 1x PBS ile küveti doldurun. Yavaşça küvetin duvardan retina eksplant ayırmak için forseps kullanabilir. Elektroporasyondan sonra retina bazen küvetin çeperine bağlı yapan, kabarcıkları ile kaplıdır. </li><li> Oyuk başına 1 mi, önceden ısıtılmış (37 ° C) ihtiva eden bir kültür ortamı, 24 oyuklu bir plaka içine bütün retinal eksplant aktarmak için polietilen bir Pasteur pipeti kullanarak. Kuyu başına bir retina eksplant inkübe edin. </li><li> 24 saat boyunca% 5 CO2 ile bir hücre kuluçka makinesi içinde, 50 rpm&#39;lik sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C&#39;de retina eksplant inkübe edin. Rotasyon orta ve Preve için maksimum etkiyi sağlamak için24 oyuklu plakanın alt retinanın nt yapışır. </li><li> 4. adıma geçin. </li></ol></li><li> Kimyasal reaktifler ile bütün retinal eksplantlar tedavisi Not: Bütün retina eksplantlar kimyasal işleme aşamasının 2 hemen sonra gerçekleştirilebilir. <ol><li> 1 DMEM: F12 Besin karışımı,% 10 FBS, 10 U / ml penisilin streptomisin, 5 ug / ml insülin, 2 mM L-glutamin ihtiva eden 1 kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Oyuk başına (37 ° C) kültür ortamı önceden ısıtılmış 1 ml ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içine adım 2.3 retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Kuyu başına bir retina eksplant inkübe edin. </li><li> Kimyasal reaktif veya aracına ilave edilmeden önce% 5 CO2 ile bir hücre kuluçka makinesi içinde, 50 rpm&#39;lik sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C&#39;de 60 dakika boyunca, tüm retina eksplant inkübe edin. </li><li> Örneğin, kimyasal çözelti hazırlayın Cdk1 / 2 inhibitörü III, nihai olarak M faz ilerlemesi 13 inhibitörü,DMSO içinde 30 uM konsantrasyonu. </li><li> Hücre inkübatör, tüm retina eksplant içeren 24 kuyu plakasını sökün. % 0.01 DMSO içinde 300 nM CDK1 / 2 inhibitörü III&#39;ün bir nihai konsantrasyonu elde retina ortamı doğrudan kimyasal reaktif ya da araç (DMSO), 10 ul ekle. El ile çözelti içinde kimyasal reaktif veya aracın eşit dağılımını sağlamak için 24 oyuklu plaka döndürün. </li><li> İstenen süre (en fazla 24 saat) süreyle% 5 CO2 ile bir inkübatör içinde 50 rpm sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C&#39;de retina eksplantlar inkübe edin. </li><li> 4. adıma geçin. </li></ol></li></ol> 4. Tespit ve Tüm Retina Eexplants dondurulması <ol><li> Hücre inkübatör tedavi bütün retina eksplant içeren 24 kuyu plakasını sökün. </li><li> 1 ml 1xPBS bölgesindeki / oyuk buz soğuğu% 4 paraformaldehid içeren bir 24-çukurlu plaka retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Incuba15 dakika süreyle buz üzerinde te. </li><li> Retina yıkamak için 1 ml / oyuk buz soğuğu 1xPBS ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bütün retinal eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 1 ml / 1xPBS iyi buz soğukluğunda% 30 sukroz ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bütün retinal eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. 1-3 saat retinanın embriyonik gün bağlı buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. ST20 için - ST25 (E3) retinalar, 1 saat süre ile inkübe edilir, daha eski retinalar sukroz uzun inkübasyon süresi gerekir. </li><li> Yaklaşık 500 ul kriyostat dondurma montaj orta içeren bir parafin film üzerine tüm retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Yavaşça küçük kaşık kullanarak dondurma ortamda retina eksplant hareket ettirerek kadar sakaroz mümkün olduğunca kaldırın. </li><li> Donma orta içeren bir gömme kalıp retina eksplant aktarın. Gelecekteki bölümlendirilmeleri kolaylaştırmak için göz yerleştirin. Dr üzerinde tüm retina eksplant içeren gömme kalıp koyunorta kadar y buz katı dondurulur. -80 ° C saklayın. </li></ol>

<ol><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commu%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li>
<li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res+Dev+brain+re%22%5BJournal%5D)">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+US%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+eye+re%22%5BJournal%5D)">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li>
<li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li>
<li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycl%22%5BJournal%5D)">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu çalışmada diseksiyon, elektroporasyon veya kimyasal arıtma ve tavuk embriyoları tüm retina eksplant kültür için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, hızlı, kolay ve hem de yüksek bir başarı oranı ve tekrarlanabilir sağlar Sonuçlar. Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon söz konusu gen yapısını eksprese eden hücrelerin büyük bir kısmını oluşturur. Bu doğru elektrotları konumlandırmak için ve tanımlanmış bir DNA plazmid konsantrasyonuna retinanın belirli bir...

Retina, merkezi sinir sisteminin bir parçasıdır ve göreli olarak basit ve iyi karakterize edilmiş hücre mimarisi, merkezi sinir sistemi gelişme eğitim için uygun bir model ile, bir. Tavuk embriyo göz embriyo geri kalanına kıyasla nispeten büyüktür. Bu nedenle bu tür enjeksiyonlar veya elektroporasyon gibi deneysel manipülasyonlar için ovo kolayca erişilebilir ve retina hücre ve in vivo gelişimsel biyoloji hakkında bilgi sahibi için mükemmel bir araç olarak hizmet vermektedir. Deneyler elektroporasyon, tekrar enjeksiyonları ya da kombine deneysel manipülasyonlar ile olduğu gibi invazif zaman bu büyük avantajlara rağmen, embriyoların sağkalım düşük olabilir. Ovo tavuk embriyo DNA plazmid Elektroporasyon önemli ve iyi bilinen bir tekniktir 1&#39;dir. Bu merkezi nerv hücre kaderinin yanı sıra nöronal yolları izleme, nöronların etiketlenmesi için izin verirlı sistemi ve in vivo proteinin fonksiyonunu analiz etmek için ektopik gen ifadesi için izin verir. Tekniğin 3 arka beyin ve 4 retina, nöral tüp 2 çalışmaları için kullanılmıştır. Ovo embriyonik retinanın Elektroporasyon in vivo durumla ilgili bazı deneysel zorlukları vardır. Embriyonun kranyal katlama nedeniyle göz konumu, kalpten nispeten yakındır. Bu yakınlık elektroporasyon aşağıdaki kardiyak arrest riskini ve embriyonun yaşla birlikte riski de artmaktadır. Ayrıca, göz erişmek için, bu suretle kanama, malformasyonlar ve sonraki azaltılmış canlılığı riskini artırarak, embriyonik zarlar açmak için gereklidir. Test ve bilinen bir fenotipik sonuç olmadan sık sık yeni bir DNA plazmid optimize ederken, bu sınırlamalar bile deneyimli bir deneye ilişkin yöntemin etkinliğini ve gücünü azaltabilir. Bu protokol, w kültüründe görüldüğü gibikaldırıldı pigment epiteli ile tüm nöral retina olarak tanımlanan deliğin retina eksplant, ovo yaklaşımda tamamlar verimli bir yöntemdir. Kimyasal reaktifler Göz içi enjeksiyonları ovo gerçekleştirmek için göreceli olarak kolaydır. Ancak, sinir retinada enjekte reaktiflerin etkili ve tam konsantrasyonu, tam olarak kontrol etmek zor olabilir. Enjekte edilen hacim kaçak nedeniyle değişebilir ve enjeksiyon tam site gözün içindeki reaktif dağılımı ve vitreus yoluyla yayılmasını hem de etkileyebilir. Değişkenlik, yani bir enzim inhibitörü bir doz-yanıt eğrisi belirlenir sonuçların yorumlanması için önemli etkileri olacaktır; etkisi küçük ve etkisi zamansal pencere dar özellikle. Ovo deneylerde yaparken Üstelik, yalnızca tek göz, kan akışı yoluyla sistemik potansiyel etkilerine her embriyo kullanılabilirkontralateral gözün üzerine. Geliştirilmesi ve tedavi ve kontrol embriyolar ek deneysel değişkenliği yol açabilir arasındaki bireysel değişkenliği çalışılırken yaş eşleştirme önemlidir. Bu nedenlerden dolayı, tavuk embriyolarından retina eksplantlar göre yöntem ovo eski bir nöral retinanın tekbiçimli maruz kalabilir ve in vitro deney koşullarını kontrol geliştirilmiştir. Mevcut protokol önceki protokollere 5-9 dayanarak geliştirilmiştir. Aşamasından Retina eksplantlar (st) st31 20 (3, embriyonik gün [E]) (E7) tavuk embriyoları kültürlendi, parçalara ayrıldı ve elektroporasyona tanımlanmış bir DNA plazmid konsantrasyonu veya bir kimyasal madde belirli bir konsantrasyonunu içeren bir ortama maruz bırakıldı. Burada sunulan protokol başarılı şekilde KU55933, SB 218078 ve NSC 109555 dito gibi DNA hasar yolağının regülatörleri de dahil olmak üzere, pek çok farklı kimyasal reaktif maddeler kullanılarak son yayınlarda uygulanmıştırBöyle CDK1 / 2 inhibitörü III 10,11 olarak mesilattır ve hücre döngüsü.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (tablet)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri kabı</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &; l pipet uçları</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml tek kullanımlık plastik küvet</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri kabı</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2 inhibitörü III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM'de %0.01 DMSO</td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Elektrotlar</td><td></td><td></td><td>Platina, özel yapım</td></tr><tr><td>Elektro kare poratör ECM 830</td><td>Harvard Aparatı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Besin karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Donma ortamı NEG50</td><td>Cellab, İsveç</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP eksprese eden DNA plazmidi (pZG'ler)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nemlendirilmiş inkübatör</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Almanya</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Life Technologies</td><td>ile ProLong Gold montaj ortamı</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Parafin filmi</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way gömme kalıbı ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfohiston 3 (PH3)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Seyreltme 1/4.000</td></tr><tr><td>Platin elektrotlar ("rondelles" den özel olarak üretilmiştir)</td> <td>Sargenta</td><td>390-R (rondeller)</td> <td>Çap: 4 mm, 0.1 mm kalınlık</td></tr><tr><td>Platimun elektrotları&nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Çapı: 4 mm</td></tr><tr><td>Polietilen pastör pipeti</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Döndürücü çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Küçük kaşık</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>VWR</td><td>443815S</td> Beyaz Leghorn yumurtaları <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Yerel tedarikçi</td></tr><tr><td>Şarap soğutucu</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlin Almanya</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporasyon ve kimyasal reaktif tedaviler için tavuk embriyolar gelen bütün retina eksplantlarındaki

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Retina gelişen santral sinir sistemi için iyi bir modeldir. Ovo / in vivo deneysel manipülasyonlar için gözün büyük boy ve en önemlisi erişilebilirlik tavuk embriyonik retina çok yönlü ve çok verimli deneysel bir model yapar. Tavuk retina göz içi enjeksiyonlar veya elektroporasyon ile ovo hedef kolay olmasına rağmen, retinada reaktiflerin etkili ve tam konsantrasyonu, tam olarak kontrol edilmesi zor olabilir. Bu göz veya maddelerin dengesiz difüzyon tam enjeksiyon yerinde, kaçak varyasyonları nedeniyle olabilir. Ayrıca, bu tür elektroporasyon gibi invaziv manipülasyonlara sonra malformasyonlar ve ölüm sıklığı oldukça yüksektir. Bu protokol, tavuk embriyolarından bütün retinal eksplantlar kültürlenmesi için tekniğin ovo bir eski açıklar ve reaktifler retinanın kontrol maruz için bir yöntem sağlar. Protocol deneysel, incelemek işlemek ve tavuk embriyoları kültür bütün retina eksplantlar açıklamaktadır. Eksplantlar, yaklaşık 24 saat boyunca kültüre edilebilir ve elektroporasyon gibi farklı manipülasyonlara tabi. Önemli avantajları Deney embriyo hayatta kalma ve katılan reaktif maddenin konsantrasyonu değişebilir ve etkili konsantrasyonunu tespit etmek ve optimize etmek için kontrol edilebilir bağımlı değildir vardır. Ayrıca, teknik, yüksek deneysel bir başarı oranı ile birlikte, hızlı, ucuz ve, bu tekrarlanabilir sağlar Sonuçlar. O ovo yapılan deneyler için mükemmel bir tamamlayıcı olarak hizmet ettiği vurgulanmalıdır.

Bu protokol, tavuk embriyolarından bütün retinal eksplantların preparasyonu (Şekil 1A-F) kültürlenmesini tarif eder. Bu protokol, başarılı bir şekilde st31 için ST20 (E3) embriyolardan tam retina eksplantlar (E7) kullanılmaktadır. Bütün retina eksplantlar, DNA plazmidleri Elektroporasyon retina progenitör hücrelerin etiketlenmesi ve izleme ya da aşırı ifadesi, farklı gen ürünlerinin sağlar. Elektroporasyon deneyleri için, pigment epitel dikkatle ST25 (E4 ½) embriyosunun enük...

Bu protokol, teşrih deneysel işlemek ve tavuk embriyo kültür bütün retinal eksplantlar için bir yöntem tarif eder. Yüksek başarı oranı, etkinlik ve tekrarlanabilirlik elektroporasyon ve / veya reaktif maddelerin, örneğin, enzimatik inhibitörleri için plasmidlerin etkilerini test etmek için gerekli olduğunda eksplant kültürleri yararlıdır.

Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Bu prosedürün genel amacı, tavuk embriyolarından bütün retinal implantları deneysel olarak diseke etmek, manipüle etmek ve kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle tavuk embriyosundan her iki gözün toplanması ve bir Petri kabına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ince pensler kullanılarak sklera ve pigment epitelyumunun çıkarılmasıdır.Ardından, tüm retinal açıklık, düz dairesel elektrotlar kullanılarak plazmid DNA elektroporasyonuna tabi tutulur. Son adım ise retinal açıklığın, bir inkübatördeki 24 kuyucuklu plakada, kültür ortamında inkübe edilmesidir.Son aşamada, retinal implantların tamamı fikse edilir, kriyoseksiyon yöntemiyle kesitleri alınır ve retinal nöronları görselleştirmek için immünofloresan mikroskopi ile analiz edilir. Bu tekniğin, in OVO elektro operasyonlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı hızlı olması, uygulanmasının kolay olması ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamasıdır. Bu yöntem, inkübasyonu takiben, nörojenezin enzim inhibitörleri veya hücre döngüsünü hedefleyen gen ürünleri gibi spesifik kimyasal reaktiflerden nasıl etkilendiği gibi merkezi sinir sistemi gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.İstenen embriyoni

whole-retinal-explants-from-chicken-embryos-for-electroporation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ovo elektroporasyon Civciv kuş embriyonun genetik manipülasyon sağlayan bir tekniktir. Bu tekniğin yaygın uygulamalar genlerin fonksiyonel analiz ve olası artırıcı unsurları içerir. Bu video HH 10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon göstermektedir. Enjeksiyon tekniği ve uygun yumurta taşıma tartışılmıştır.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik...

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Daha sonra kuluçka dönemlerinde (Hamburger ve Hamilton evresi (SS) 22 yaşından büyük) az tavuk embriyosu gen transferi yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, dezavantajların...

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

Biz floresan etiketlemeyi yüzeysel geçirme yöntemleri tarif Hücre çoğalmasıyla tarafından ve geçiş görselleştirmek için bir düz-mount kültür etiketli hücre hareketinin hızlandırılmış görüntüleme için hücre gelişmekte olan piliç optik tectum davranış .

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Tavuk embriyolarının retinasından koni fotoreceptörlerinin birincil kültürlerini elde etmek için bir yöntem ve yüksek içerik taraması için kullanımını açıklıyoruz.

Tavuk Embriyolarının Retinasından Koni Zenginleştirilmiş Kültürler Çubuktan Koni Hücresel Etkileşimlerine

İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Öğrenin, tavuk embriyolarından bütün retina eksplantlarını disseksiyon, elektroporasyon ve kültür yöntemleriyle nasıl hazırlayacağınızı. Bu teknik, plazmid DNA transferi ve retinal gelişim çalışmaları için güvenilir bir platform sunar.

Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

Daha fazla video keşfet