Name: A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Keşfedin, insan plasentasından elde edilen koşullandırılmış ortam ve jelatin kaplama kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC) kitlesel üretimi için basit ve uygun maliyetli bir yöntemi. Bu teknik, eksojen takviye veya sentetik substrat gerektirmeden hücre çoğalmasını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar plasental doku sağlamak için Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Doçent, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Medical College Kore Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK), Kore Cumhuriyeti hibe (R1211902) tarafından kısmen desteklenmiştir.

Etik bildirimi: İnsan plasenta çalışması Kore Üniversitesi (AN09085-001) insan araştırma için Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile, ileriye dönük olarak. Tüm deneyler Kore Üniversitesi Tıp Merkezi&#39;nde Temiz Germ-Alerjik Oda tesis yapıldı. deneysel tasarım ve hPSCs kullanarak prosedürleri Kore Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (AN12277-003) tarafından onaylanmıştır. Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> % 0.1 jelatin ile kaplayın tüm kültür yemekleri. Otoklav fosfat tamponlu tuz (PBS) ve forseps. Birden fazla 15 dakika £ 15 psi altında 121 ° C &#39;de, cerrahi makas, mikrosantrifüj tüpleri, gazlı bez sterilize edin. </li><li> Hazırlanan önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-etilen amin tetra-asetik asit (tripsin-EDTA) ve önceden ısıtılmış, süzülmüş kültür ortamı (DMEM)% 20 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin içeren ve 100 ug / ml streptomycprosedürleri başlamadan önce. </li></ol> Insan plasentasından 2. Hücre İzolasyonu <ol><li> Yazılı onam alındıktan sonra gebelik 7-32 haftalık normal veya terapötik kürtaj geçiren sağlıklı gebe kadınların sezaryen doğumdan sonra plasenta dokusu, edinin. </li><li> Plasenta obstetrik uzman cerrahi ayrı insan plasenta koryonik plakaları (HPC) var; 20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de% 0.25 tripsin-EDTA, bu inkübe, ve daha sonra 5 ml PBS ile yıkayın. </li><li> Makas kullanarak HPC gelen koryonik villus izole edin; villus kıyma ve 1ml PBS ile onları üç kez yıkayın. Ufalamadan sonra bir pipet kullanarak bir mikrofüj tüpü içine koryonik villi yer; aşağı yukarı pipetleme ve 500 ul PBS ile numuneler yıkayın ve 3 dakika boyunca 120 xg için tüpler santrifüj. Önceden ısıtılmış kültür ortamında 500 ul iki kez dokuları yıkayın. </li><li> 37 ° C &#39;de, jelatin-kaplanmış plakalar üzerinde ortam içinde kültür hücreleri,% 5 CO2 içinde </sub&gt; ve% 95 altında nem. Ön kaplama, 37 ° C&#39;de 1 saat süre ile,% 0.1 jelatin ile, tüm plakalar. Fibroblast-benzeri hücrelerin koloniler oluşturur ve yaklaşık 5-7 gün, aynı ortam içinde kültür başladıktan sonra yapışkan bir büyüme olur. </li><li> Üçüncü pasaj kadar her 2-3 günde bir orta değiştirin. Kültür sırasında, kültür ortamı içinde yüzen hücre birikintilerinin ayrılmasıyla; büyüyen plasental fibroblastlar plaka eklenecektir. Kültür daha sonra 10. geçide HPC kadar elde edilen ve fibroblast-benzeri hücreler tripsinizasyon ve mitomisin-C (10 ug / ml) tedavi sonrası HESC kültürleri için hasat. </li><li> Hisse senedi örnekleri olarak HPC dondurmadan önce, HPC genellikle (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginin, M mikoplazma dahil plasentayı, enfekte patojenler ile kontamine olmadığını teyit etmek için ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanımı . Orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,ve M. capricolum) ve bakteriyel türler, Ureaplasma urealyticum, bir mikoplazma belirleme kiti kullanılarak. <ol><li> RT-PCR gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun kitte sağlanan tüm primerler ve karışımları kullanmak. Mycoplasma tespiti için 36 gün süre ile kültive edilmiştir hücre süpernatantlar kullanın. PCR karışımı, bu örneklerin 3 ul ekleyin ve 30 saniye, 2 dakika için 55 ° C ve 1 dakika süre ile 72 ° C&#39;de her biri 94 ° C kapsayan 35 çevrim için 1 st PCR prosedürü uygulayın. </li><li> Dikkatle PCR karışımı 1 st PCR ürünü, 0.5 ul ve daha önce olduğu gibi aynı şartlar kullanılarak 30 çevrim için 2. PCR prosedürü uygulayın. % 1 agaroz jel elektroforez işlemi aracılığı ile amplifiye ürünlerin analiz; jeller 1 ve 2. PCR ürünlerinin her birinin 10 ul geçerlidir. </li></ol></li><li> HPC patojenler ile kontamine olduğu tespit edilmiştir, bu ortadan kaldırmaküreticinin talimatlarına göre, bir antibiyotik kombinasyonu (BM-siklin) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 3 gün BM-siklin 1 10 ug / ml ihtiva eden yeni ortam ekleyin ve daha sonra başka bir 4 gün için 5 | ig / ml BM-siklin 2 ile hücreleri tedavi. Iki kez bu döngüyü tekrarlayın ve sonra tekrar Mycoplasma kirlenme kontrol edin. </li></ol> 3. Hasat İnsan Plasenta türetilmiş hücreler Orta (hPCCM) Klima <ol><li> Kirlenme hariç sonra, bağlanmış hücreler (85-90% konfluansa tedavi (1.5 x 10 7 hücre / 2 saat ve 30 dakika boyunca mitomisin-C (10 ug / mi) ile bir şişe) ve 10 ml hücreler üç kez yıkandı PBS ile yıkandı. 24 saat, mitomisin-C olmayan önceden ısıtılmış ortam ile inkübe hücreleri. </li><li> Bir gün tedaviden sonra, 10 mi ortam içinde hücrelerin inkübe (DMEM-F12,% 20 nakavt serum Değiştirilmesi [KOSR] ile takviye edilmiş, 0.1 mM β-merkaptoetanol,% 1 NEAA ve% 1 penisilin-streptomisin). 15 ml konik bir tüp içinde 24 saat inkübasyon, hasat CM sonra ve0.22 um şırınga filtresi kullanılarak cm filtre. </li><li> Yeni orta ve inkübasyon bir 10 ml ekleyin. 1 hafta boyunca her gün kültürlerden tüm süpernatantlar toplayın ve -80 ° C&#39;de hasat aracı madde dondurularak. Tekrarlanan donma-erime döngülerinden kaçınmak. </li></ol> 4. Kültür İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) ve Pluripotent Kök Hücre İndüksiyon (iPSCs) <ol><li> İnsan embriyonik kök hücre hatları elde etmek, (sırasıyla, isim WA01 ve WA09 altında NIH HESC kayıt defterinde listelenen) H1 ve H9 hücreleri ve uyarılmış pluripotent kök hücre-iPSC-1: iPS (sünnet derisi) -1 ve iPSC-2 (IISH1i- WiCell Araştırma Enstitüsü (Madison, WI, ABD) BM). Hücreler, üreticinin talimatları izlenerek çözündürüldükten ve kültüre olmalıdır. </li><li> Kontrol grubu için, 37 ° C &#39;de yaygın olarak kullanılan besleyici içermeyen ve serum içermeyen tanımlanmış bir kültür ortamı içinde Bazal Membran Matrisi-kaplı kaplar üzerinde ve% 5 CO2 kültür hücreleri. Başlangıçta, hPSCs 80-100 kümeleri tohum in 35 mm yemekleri. 70-80% izdiham ve rutin geçiş hücreleri kadar bu yemekleri hücreleri büyümek alt kültüre, her 5-6 günde bir, mekanik veya enzimatik yöntemler (Dispase) kullanarak. Ortam ile hücreler iki kez yıkanır ve 1 arasında bir oranda bunların plaka: 4 arasındadır. Her gün taze ortam ile orta değiştirin. </li><li> Deney grupları için, yemekler hPCCM kültür hücreleri ya mekanik ya da enzimatik olarak,% 0.1 jelatin ile ön-kaplanmış ve bir kez 5 günde, rutin ile gerçekleşen pasajlanmasını da yerine getirir. 6-1: 10: 1 aralığı içinde oranlarında plakası hücreleri. hPSCs transferden sonra 2 gün içinde jelatin ekleyin. Günlük taze ortam ile orta değiştirin. </li></ol> İnsan Pluripotent Kök Hücre 5. Karakterizasyonu Not: alkalin fosfataz boyama, İmmünositokimya, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve western blotting gibi çeşitli yöntemler kullanılarak hPSCs karakterize eder. <ol><li> İmmünfloresan boyama <ol><li> Immunofluorescenc içinE boyama, kültür hPSCs% 4, 10 dakika boyunca (ağırlık / hacim) paraformaldehid ile 8 oyuklu kayıcı odaları hücreleri gidermek; Daha sonra, (v / v) Triton-X100, 15 dakika boyunca, ve% 0.1 içeren PBS içinde% 3 (h / h), normal at serumu ile 1 saat boyunca bloke edilir (h / h),% 0.1 ile hücrelerin geçirgen Tween 20. Her adım arasında 5 dakika boyunca iki kez PBS yıkayın. </li><li> 4 ° C &#39;de ve sekonder antikor ile O / N: Primer antikor (1000 1 Ekim-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 seyreltme) ile inkübe hücreleri. </li><li> Montaj önce, karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile hücrelerin inkübe edin. Yıkama hücresi sıkı karanlıkta her kuru hücrelerin tamamen 5 dakika için üç kez. Floresan montaj ortamına hücreleri korumak ve flöresanlı bir mikroskop altında gözleyin. </li></ol></li><li> Mah-PCR <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir RNeasy Mini kiti kullanılarak hücrelerden toplam RNA izole ve Nano Bırak Spektrofotometre kullanılarak ekstre RNA ölçmek. </li&gt; <li> 20 ul reaksiyon karışımı ihtiva eden oligo toplam RNA 2 ug ekleyerek cDNA sentez (dT) primerleri ve Superscript II ters transkriptaz; Bu prosedürde üreticinin talimatlarına uyun. </li><li> IQ SYBR Green qPCR Master Mix ve Ek Tablo S1 tarif edilen primer sekanslar kullanılarak, bir Bio-Rad iCycler iQ sistemi ile sentezlenen cDNA yı çoğaltmak. Gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) kişilerce ilgi genlerinin döngüsü eşik değerlerini normalize. </li></ol></li><li> Alkalen fosfataz (AP) boyama <ol><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak, ES hücre Karakterizasyonu Kiti kullanılarak AP aktivitesi algılar. </li><li> 5. günde, ortam aspire ve 12 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile hPSCs düzeltin. Overfix etmeyin; daha uzun bir süre, 2 dakika için hücrelerin sabitlenmesi alkalin fosfataz inaktivasyonu ile sonuçlanacaktır. Fiksatif aspire ve 1x Durulama Tampon ile durulayın. Yapamazkuyu adımları arasında kurumasını bekleyin. </li><li> Her çukurun (35 mm çanak oyuk başına 1 mi) karşılamak için yeterli boyama solüsyonu ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, 1x Durulama Tamponu ile bulaşıkları yıkama. 1x PBS ile Kapak hücreleri kurumasını önlemek ve Olympus mikroskop kullanılarak boyanan hücrelerin incelenmesi ve görüntü için. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Daha önce 9&#39;da tarif edildiği gibi Western blot analizi yapın. Kısaca, hücre lizatları içindeki protein yoğunluklarının belirlenmesi. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel ile ilgili protein eşit miktarlarda gidermek ve poliviniliden flüorür (PVDF) membran üzerine proteinleri aktarın. </li><li> Leke Blok ve 4 ° C&#39;de farklı primer antikorlar ile G / Ç N o prob; Daha sonra 1 saat HRP-konjuge sekonder antikor ile leke inkübe edin. 10 dakika inkubasyon arasındaki her zaman için membranı üç kez yıkayın. Bir ECL reaktifi kullanılarak sinyalleri algılar. </li&gt; </ol></li><li> Kısa tekrar dizisi (STR) analizi <ol><li> hPSCs aynı pasajda de deney ve kontrol grupları toplandı. Genomik DNA üreticinin talimatlarına göre, bir DNA Mikro kiti kullanılarak ekstre edilmiştir. </li><li> Üreticinin talimatlarına ve kapiler elektroforez göre AmpF / STR PCR Amplifikasyonu kiti kullanılarak 16 farklı genetik lokus için genomik DNA&#39;yı büyütmek Genetik Analiz cihazı kullanılarak gerçekleştirildi. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).</li>
<li>Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itskovitz-Eldor+Feeder+layer+and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60(2010).</li>
<li>Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic%2C+xeno-free+peptide+surface+for+expansion+and+directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (11), e50880(2012).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+supports+undifferentiated+human+embryonic+stem+cell+growth+without+conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium.</a> Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).</li>
<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cells+can+support+the+undifferentiated+growth+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+their+own+basic+fibroblast+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors.</a> Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+human+placenta+as+a+source+of+the+universal+feeder+in+human+and+mouse+pluripotent+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undifferentiated+propagation+of+the+human+embryonic+stem+cell+lines%2C+H1+and+HSF6%2C+on+human+placenta-derived+feeder+cells+without+basic+fibroblast+growth+factor+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation.</a> Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).</li>
<li>Seok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+placenta-derived+feeders+support+prolonged+undifferentiated+propagation+of+a+human+embryonic+stem+cell+line%2C+SNUhES3%3A+comparison+with+human+bone+marrow-derived+feeders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders.</a> Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).</li>
<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li>
<li>Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+differentiation+of+stem+cells+mesenchymal+progenitors+by+inhibition+of+TGF-beta%2Factivin%2Fnodal+using+SB-431542%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları gösterir.

Bu model, örneğin bFGF veya insülin gibi eksojen rekombinant büyüme faktörlerinin ilavesi olmadan insanlaştınlmış besleyici içermeyen kültür koşullarında özelliklerini muhafaza eden bir insanlaştırılmış mikroçevresinin hPSCs manipülasyonu sağlarken başarıyla hPSCs yaymak için geliştirilmiştir. Ekzojen bFGF takviyesi yaygındır ve Matrigel veya laminin gibi alt tabakalarının uygulanması hPSCs 14 besleyici içermeyen kültür için gereklidir. Bu protokol, basit ve uygulanması kolaydır. ...

Bu protokolün amacı, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) tamamen insancıllaştırılmış ex vivo besleyici içermeyen koşullarda, ek eksojen takviye ve sentetik substratlar gerektirmeden çoğaltılmasıdır. Bugüne kadar, kültür ürünlerinin kliniğe sunulmasını sağlayan ex vivo hPSC kültür modellerinin geliştirilmesi, kök hücre araştırmalarında önemli bir endişe kaynağı olmuştur. Özellikle, iki kritik sorunun ele alınması gerekir. İlk olarak, hayvan hücresi ürünleri tarafından kontaminasyon riskini ortadan kaldıran hPSC'lerin çoğaltılması için insanlaştırılmış bir ex vivo kültür sistemine ihtiyaç vardır. İkinci olarak, hPSC'lerin kolay ve ekonomik seri üretimini kolaylaştırmak için besleyici içermeyen bir kültür modeline ihtiyaç vardır. hPSC'lerin terapötik uygulamaları için, kendilerini yenilemelerini ve farklılaşmalarını düzenleyen faktörlerin belirlenmesi gerekir.
Xu ve ark. başlangıçta Matrigel1'de hESC'leri büyütmek için fare embriyonik fibroblastlarından (MEF) türetilen şartlandırılmış besiyerlerinin (CM) kullanılmasının fizibilitesini bildirdiğinden beri, birçok çalışma hPSC2-4 için optimal ex vivo yayılma yöntemlerini incelemiştir. Bununla birlikte, ideal bir insanlaştırılmış ex vivo besleyici içermeyen hPSC yayılma sistemi geliştirilmemiştir, çünkü mevcut yöntemler kültür ortamında5-7 iyi bilinen hPSC sürdürücü faktörler olan bFGF ve insülin dahil olmak üzere ek eksojen substratlar gerektirir. Ayrıca, besleyici içermeyen tüm kültürlerde Matrigel veya laminin gibi sentetik substratlar kullanılır.
Bu protokolün geliştirilmesi ve kullanılmasının ardındaki mantık, insan plasenta koryon hücrelerinin bFGF takviyesi8-11 olmadan hPSC'lerin yayılmasını mükemmel bir şekilde desteklediğini gösteren önceki çalışmalarımıza dayanmaktadır. Bu protokolün, kullanım açısından basitliği ve maliyet etkinliği de dahil olmak üzere bir dizi avantajı vardır ve eksojen sentetik substratlar olmadan hPSC yayılımını sağlayan mükemmele yakın insancıllaştırılmış bir kültürdür. hPSC'ler için insan plasentasından türetilmiş CM (hPCCM) uygulaması 3 adımdan oluşur. İlk olarak, koryon hücreleri insan plasentasından izole edilir ve kültürlenir. İkincisi, hPCCM kültürlenmiş hücrelerden üretilir. Üçüncüsü, hPSC'ler hPCCM kullanılarak kültürlenir ve özellikleri doğrulanır. 
Bu protokol, hPSC'lerin klinik uygulamalarını ve hPSC proliferasyonu ve bağlanma mekanizmalarının çalışmalarını kolaylaştıracaktır. Bu yazıda, hPSC'lerin hPCCM'de jelatin kaplı bir tabak üzerinde başarılı bir şekilde yayılması için protokol sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Mitomisin-C</td><td>Sigma-Aldrich Şirketi</td><td>M4287</td><td>10 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>Mikoplazma tespit kiti</td><td>TaKaRa Bio Inc.</td><td># 6601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td> <td># 354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri A.Ş.</td><td># 05850</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>LS02100 1 mg / ml</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>G2500</td>% <td>0.10</td></tr> <tr><td>BM-Siklin</td><td>Roche</td><td>799 050</td><td>10 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>RNeasy mini kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nano Damla Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Yeşil qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td> <td># 170-8882AP</td><td></td></tr><tr><td>ES Hücre Karakterizasyon kiti</td><td>Chemicon International, Inc.,</td> <td>SCR001</td><td></td></tr><tr><td>Güç cDNA Sentez Kiti ve nbsp;</td><td>iNtRON Biyoteknoloji</td><td>25011</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&reg; DNA Mikro kiti</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>AmpF/STR&reg; Tanımlayıcı&reg; PCR Amplifikasyon kiti</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td></td><td></td>4322288</tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler&reg; 3130xl Genetik Analiz Cihazı&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler A.Ş.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel kültür modeli İnsan pluripotent için plasenta klimalı medyada jelatin üzerinde hücre çoğalma kök

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) besleyici içermeyen kültür koşullarında insan hücrelerinden türetilen şartlandırılmış ortamda çoğaltılması ilgi çekici olmuştur. Bununla birlikte, hPSC'ler için ideal bir insanlaştırılmış ex vivo besleyicisiz yayılma yöntemi geliştirilmemiştir; şu anda, bir ana hPSC sürdürücü faktör olan bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) dahil olmak üzere ek eksojen substratlar tüm kültür ortamlarına eklenmekte ve tüm besleyici içermeyen kültürlerde Matrigel veya laminin gibi sentetik substratlar kullanılmaktadır. Son zamanlarda, grubumuz, hPSC'lere özgü ek eksojen takviye veya sentetik substrat olmaksızın, jelatin kaplı bir tabak üzerinde yalnızca insan plasentasından türetilen şartlandırılmış ortamı kullanarak hPSC'lerin yayılması için basit ve verimli bir protokol geliştirdi. Bu protokol daha önce rapor edilmemiştir ve araştırmacıların hPSC'leri insanlaştırılmış kültür koşullarında verimli bir şekilde yaymalarını sağlayabilir. Ek olarak, bu model virüsler veya bilinmeyen proteinler gibi hayvansal ürünlerden kaynaklanan hPSC kontaminasyon risklerini ortadan kaldırır. Ayrıca, bu sistem, kullanımı kolay olan jelatin kaplamayı kullanarak hPSC'lerin kolay seri üretimini kolaylaştırır ve ex vivo hPSC bakımının genel maliyetlerini önemli ölçüde azaltır.

Bu hPSC yayılım yöntemin bir avantajı insan hücrelerinden salgılanan bileşenleri kullanmasıdır. Protokolde en çok ciritical aşama insan plasentası türetilen hücrelerin izolasyonu ve kültürü. Bu gerektirir ve HPC plaka villus kesin bir kısmından doğru diseksiyon. 1 insan plasenta kaynaklı hücre izolasyonu için prosedürü göstermektedir. Bu işlem, basit ve hücrelerin izolasyonu için uygun olan ve kolay 1 saat içerisinde gerçekleştirilebilir. Şekil 2&#39;de tarif edildiği g...

Bu protokol, ek eksojen takviye veya hPSC'ye özgü sentetik substrat olmaksızın jelatin kaplı bir tabakta yalnızca insan plasentasından türetilen şartlandırılmış ortamı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini (hPSC'ler) çoğaltmak için basit ve etkili bir yol sağlar.

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, basit ve düşük maliyetli bir jelatin kaplama kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinin nasıl seri üretileceğini açıklamaktır. Bu işlem, öncelikle insan plasenta dokularından koriyonik villusların izole edilmesi ve ikinci adım olarak villusların küçük doku parçaları halinde kıyılmasıyla gerçekleştirilir. Doku parçaları, beş ila yedi gün içinde adherent fibroblast benzeri hücre kolonileri oluşturdukları jelatin kaplı plaklarda kültüre edilir ve ardından insan pluripotent kök hücre kültürü için kondisyonlu besiyeri hazırlamak amacıyla kullanılırlar.Ardından, 80 ila 100 insan pluripotent kök hücre kümesi, insan plasentasından türetilmiş hücre kondisyonlu besiyeri ile kaplanarak ekilir ve her dört ila beş günde bir pasajlanır. Sonuçlar, altın standart koşullar kullanılarak büyütülen hücreler ile burada açıklanan, insan plasentası kondisyonlu besiyerinde jelatin kaplı plaklarda büyütülen hücrelerin benzer diferansiyasyon ve tutunma sergilediğini göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ek eksojen takviye ve sentetik substrat gerektirmeden insan hücrelerinden salgılanan bileşenleri kullanmasıdır.Başlamak için T 25 kültür kapları

a-novel-culture-model-for-human-pluripotent-stem-cell-propagation-on

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Geleneksel iki boyutlu hücre kültür teknikleri genellikle farklılaşma belirteçleri, sitokinler ve büyüme faktörleri açısından değişmiş özellikleri. Extravillous trofoblast hücre hattı ile burada gösterildiği gibi dönen hücre kültür sistemi Üç boyutlu hücre kültürü (RCC), bu faktörlerin çoğunun ifade yeniden kurar.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Birincil insan plasental (villöz) ve plasental organ kültürleri oluşturmak için basit bir yöntem tarif edilmektedir. Villus ve desidual organ kültürleri, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezinde eğitim için çok değerli araçlardır. Fakültatif hücre içi bakteri Listeria monocytogenes ile enfeksiyon gösterilmiştir.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Bir protokol olan ve olmayan oligopeptides, biyomalzemeler farklılaşması üzerine sertliği etkisini ve yayılması araştırmak için aşılı değişen sertlik ile polivinil alkol-co-İtakonik asit hydrogels hazırlamak için sunulan kök hücreler. Hydrogels sertliği crosslinking zaman tarafından kontrol ediliyordu.

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Burada, otomatik bir hücre kültürü sistemi için bir protokol sunuyoruz. Bu otomatik kültür sistemi, işçiliği azaltır ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin bakımından, çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaya kadar, indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin işlenmesine aşina olmayan araştırmacılar da dahil olmak üzere kullanıcılara fayda sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

Organoidler, hastalık modellemesi için değerli araçlar haline geldi. Hücre dışı matris (ECM), organoid üretimi sırasında hücre kaderini yönlendirir ve doğal dokuya benzeyen bir sistem kullanmak model doğruluğunu artırabilir. Bu çalışma, hayvan kaynaklı ECM ve kseno içermeyen hidrojellerde indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş insan bağırsak organoidlerinin üretimini karşılaştırmaktadır.

İnsan Kök Hücre Bakımı ve Bağırsak Organoid Üretimi için Bazal Membran Matrislerinin Karşılaştırmalı Çalışması

Protokol, üç boyutlu (3D) baskılı bir iskele ile iki tür yapışık hücre hattının biyolojisini özetleyebilen yeni bir in vitro deneysel modeli göstermektedir. Bu modelin inşası ve hücre hazırlığı ve hücre kültüründen analiz ve değerlendirmeye kadar işletme prosedürleri açıklanmaktadır.

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

Pluripotent kök hücreleri (PS hücreleri) bir koaksiyel nozul kullanarak aljinat hidrojel kapsüllerine kapsüllemek için bir yöntem oluşturduk.  Bu, hücrelerin aşırı toplanmasını önler ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin yaşadığı kesme stresini sınırlar.  Teknik, PS hücrelerinin seri üretiminin yanı sıra kök hücre nişi üzerine yapılan araştırmalara da uygulanabilir.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Keşfedin, insan plasentasından elde edilen koşullandırılmış ortam ve jelatin kaplama kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC) kitlesel üretimi için basit ve uygun maliyetli bir yöntemi. Bu teknik, eksojen takviye veya sentetik substrat gerektirmeden hücre çoğalmasını destekler.

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

Daha fazla video keşfet