FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant veya biyolojik kaynaklardan protio patik tohumlama aktivitesini tespit etmek ve protein, agregalar ve bir numunenin hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, nörodejenerasyon alanındaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Örneğin, hayvan hastalık modellerine terapötik müdahaleyi takiben tohumlama aktivitesindeki değişiklikleri nicel olarak nasıl değerlendirebiliriz?

Bu tekniğin avantajları, düşük protein agregat seviyelerine karşı yüksek özgüllüğünü içerir. Enfes özgüllüğü, kullanım kolaylığı ve yüksek verimi. Bugün bu prosedürü gösteren, ortak yazar Brandon Holmes ile birlikte ben olacağım.

Biyolojik tohum materyalini hazırlamak için, donmuş beyin dokusunu tek kullanımlık bir peynir altı suyu teknesinde tartarak başlayın. Daha sonra dokuyu konik bir tüpe aktarın, buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin, böylece nihai çözelti% 10 hacim beklemek ve numuneleri buz üzerinde soğuk bir odaya aktarmak için. Ardından, bir prob bu şekilde göstergeyi uygun ayarlara ayarlayın ve probun altını bir kenara ve durulayın.

Bu nedenle, gösterge ucu belirtildiği gibi üç kez, her çözelti arasında probu silin. Prob hazır olduğunda, ucu bir numunenin homojenizasyon tamponuna daldırın ve toplam 25 darbe veren sonikatı başlatın. Doku tamamen süspansiyon halinde olduğunda, homojenatı döndürün ve supinatı temiz bir tüpe aktarın.

Damağı rahatsız etmemeye özen göstermek. Çok sayıda başka homojenizasyon tekniği mevcut olsa da, biyolojik örneklerden küçük miktarlarda protio patik tohumları izole etmek için deneme üstünlüğü vardır. Mekanik ayrışma, dokunun tutarlı ve verimli bir şekilde parçalanmasını ve ardından tohum ekstraksiyonunu sağlar.

Daha sonra sırtüstü kesilin ve lizatları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Biyosensör hücrelerini steril koşullar altında tekrarlamak için, her hücre hattını ılık PBS ile durulayın ve ardından tripsin EDTA ile üç dakikalık bir inkübasyon yapın. Hücreler ayrıldığında, ılık kültür ortamı ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri hemen konik bir tüpe aktarın.

Hücreleri tekrar santrifüjleyin, peleti taze ortamda süspanse edin. Daha sonra hücreleri sayın ve 13 mililitre ortam başına 3.500.000 hücrelik bir ana karışım hücresi seyreltmesi yapın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 130 mikrolitre hücreyi, plakanın dibine dokunmadan pipet uçlarını kuyucukların ortasına yerleştirmeye özen göstererek, 96 oyuklu düz tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın her bir oyuğuna yavaşça aktarın.

Hücreler kaplandıktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden yerleşmelerine izin verin ve ardından plakayı gece boyunca 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %80'e eşit veya daha yüksek bağıl nemde inkübe edin. Ertesi gün, biyosensör hücreleri% 60 ila 65 birleştiğinde, transdüksiyon kompleksleri yapmak için indirgenmiş serum ortamı lipozom reaktifi ve biyolojik tohum kaynağını birleştirin. Daha sonra, her bir biyosensör kuyusunun yan tarafına 20 mikrolitre transdüksiyon kompleksi pipetleyin ve muamele edilen hücreleri, hasattan önce 24 ila 48 saat daha inkübatöre geri koyun.

İşlenmemiş hücreler sadece yaygın floresan gösterecektir. Bununla birlikte, tau tohumu materyali ile muamele edilen hücreler, hücreleri hasat etmek için bir ila iki gün sonra, hücre kültürü ortamını 50 mikrolitre tryin EDTA ile değiştirerek reaksiyonu durduracaktır. 150 mikrolitre soğutulmuş kültür, orta ile beş dakika sonra, hücreleri hemen 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakaya aktarın ve hücreleri peletleyin, peletleri bozmadan S süpernatantlarını aspire edin ve ardından nazikçe ama iyice yeniden canlandırın, hücreleri 50 mikrolitre% 2 paraldehit içinde 10 dakika boyunca askıya alın.

Daha sonra hücreleri tekrar döndürün ve peletleri mümkün olan en kısa sürede 200 mikrolitre soğutulmuş akış sitometri tamponunda yeniden süspanse edin. Sabitlemeden sonra, plakayı perde uyumlu bir akış sitometresine yükleyin ve varyant grafiğine göre ileri saçılma alanına karşı bir yan saçılma alanı oluşturun. Ardından, birinci hücre hattı çalışırken, hücre popülasyonu sol alt kadranda olana kadar bir yan saçılma ayarlayın ve saçılma voltajlarını ileri alın.

Ardından çokgen aracını kullanarak hücre popülasyonunu şu şekilde tanımlayın: yürüyüş P bir. Şimdi, değişken çizime göre ileri dağılım alanına karşı bir ileri dağılım yüksekliği yapın ve P'yi bir kapı uygulayın. Ardından, tek hücreleri yürüyüş P iki olarak tanımlayın ve her biri bir histogram oluşturun.

C-F-P-Y-F-P ve perde filtreleri için, telafi için C-F-P-Y-F-P ve perde filtreleri için birer tane olmak üzere P kapısı iki ila üç farklı histogram uygulayın. Hücre hattı bir süspansiyonunun 30 mikrolitresini hücre hattı iki süspansiyonunun 200 mikrolitresine dökün. Ardından enstrüman ayarları simgesine ve ardından kompanzasyon sekmesine tıklayın ve kompanzasyon tablosunu açmak için matrisi kontrol edin.

Değişken çizim ile CFP alanına karşı bir perde alanı oluşturun ve P iki kapısını uygulayın. Ardından, birinci hücre satırı ve ikinci hücre satırı çalışırken, kadran simgesini tıklayın ve floresan negatif ve pozitif popülasyonlar alt iki kadranla ayrılacak şekilde kadranlar çizin. Şimdi, LL üç ve LR üç kapısı için perdenin medyan floresan yoğunluğunu veya MFI'sini gösteren bir istatistik tablosu oluşturun ve perde sinyalinin MFI'si LL üç ile LR üç arasında yaklaşık olarak eşit olana kadar kompanzasyon matrisindeki perde parametresini ayarlayın.

Ardından, kadranlarla değişken arsaya göre CFP alanına karşı bir YFP alanı yapın. YFP sinyalinin MFI'si kadranlar arasında yaklaşık olarak eşit olana kadar kompanzasyon matrisindeki YFP parametresini ayarlayın. Daha önce gösterilene benzer Perde akış sitometrisi için.

Birincil floresan yayılması, tüm kapılar ayarlandığında ve CFP sinyali telafi edildiğinde, tek renkli pozitif kontrol hücreleri kullanılarak floresan kompanzasyonu yoluyla düzeltilebilen perde algılama kanalına yayılan CFP'den meydana gelir. İlgilenilen kuyuları vurgulayın ve verileri analiz etmek için plakanın geri kalanını çalıştırın. İlk olarak, akış analizini ayarlarken aynı parametreleri kullanarak hücreleri ve tek hücreleri tanımlayın.

Ardından, üçüncü hücre satırını kullanarak, YFP tek pozitif hücrelerini, varyant grafiğine göre YFP'ye karşı bir perdeye çizin. Yanlış bir perde yürüyüşü tanımlamak için fret pozitif hücre popülasyonunun eğimi boyunca ve ondan uzağa uzanan çokgen bir kapı çizin, bu da fret filtresine YFP yayılmasını hariç tutar. Yanlış perde yürüyüşünü tüm örneklere uyguladıktan sonra, boş lipozom ile muamele edilen C-F-P-Y-F-P hücrelerini, değişken çizime göre CFP'ye karşı bir perde üzerine çizin ve popülasyonun eğimi boyunca yukarı ve sola doğru uzanan poligonal bir ga sokun.

Bu kapıya kayan herhangi bir olay fret pozitif olarak kabul edilir ve hücrelerin yüzdesi, tedavi sırasında kullanılan tohum titresi ile ilişkilendirilir. Son olarak, fret pozitif hücrelerin fret pozitifliği yüzdesi ve medyan floresan yoğunluğu dahil olmak üzere ilgilenilen analiz parametrelerini kaydedin. Ardından, entegre perde yoğunluğunu manuel olarak hesaplamak için pozitiflik yüzdesi ve MFI'nin çarpımını ölçün.

Tau agregalarının veya tohumlarının yokluğunda, tau, tutarlı bir dağınık ve fret negatif floresan sinyali ile temsil edildiği gibi çözünür bir monomerik durumda tutulur. Tau tohumlarının biyosensör hücrelerine eklenmesini takiben, endojen tau, agrega ve fret pozitif durum fret nicelemesine dönüştürülür. Aşağıdaki akış sitometrisi analizi, rekombinant tau'nun femto molar konsantrasyonlarının tespit için yeterli olduğunu doğrulamaktadır. Burada.

Farklı yaşlarda safida edilen tauopati farelerinden alınan beyin sapı dokusu, 1,5 aylıktan itibaren hayvanlar arasında tohumlama aktivitesinin tutarlı bir şekilde tespit edildiğini gösteren temsili bir beyin bölgesi görevi görür. Bu deneyde, Alzheimer hastalığı deneklerinden homojen beyin, güçlü tohumlama aktivitesi sergilerken, yaş uyumlu kontrol ve Huntington hastalığı denekleri, tau, CFP ve tau ile transdüksiyona tabi tutulmamış primer nöronal kültürleri tau agregatlarına test özgüllüğünü göstermedi. YFP lentiviral yapıları, rekombinant tau tohumları ile muamele üzerine yaygın floresan sinyali sergiledi.

Bununla birlikte, endojen tau, lipozom aracılı transdüksiyonun yokluğunda bile fret akış sitometrisi ile tespit edilebilen büyük agregatlar oluşturur. Tohum kaynakları, heparin gibi tau alımını inhibe eden ilaçlarla önceden inkübe edildiğinde ve lipozomların yokluğunda tedavi edildiğinde, hem rekombinant fis hem de tauopati fare beyin örneklerinde bulunan tohumlama aktivitesi bloke edilebilir. Bir kez ustalaştı.

Bu teknik, her gün sadece bir ila iki saatlik tezgah çalışması ile üç günde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, belirli adımlar için şirket içi optimizasyonun gerekli olacağını unutmamak önemlidir. Örneğin, çeşitli biyolojik kaynaklardan elde edilen protio patik tohumlardan etkili titreler belirlenirken.

Bu videoyu izledikten sonra, rekombinant ve biyolojik kaynaklardan protio patik tohumlama aktivitesini tespit etmek amacıyla fret flow sitometri deneylerinin nasıl kurulacağı, çalıştırılacağı ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.