Name: FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Öğrenin, FRET akım sitometrisi ile proteopatik tohumlama aktivitesini yüksek duyarlılıkta nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklardaki protein agregatlarını değerlendirmek için araştırmacılara yüksek verimli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Tau Konsorsiyumu (M.I.D) tarafından desteklenmiştir; Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibesi 1R01NS071835 (MID), Savunma Bakanlığı Hibe PT110816 (MID'ye), 1F32NS087805 (JLF'ye) ve 1F31NS079039 (BBH'ye).

NOT: Bu protokol FRET kullanımı fare biyolojik örneklerden tohumlama aktivitesini tespit etmek için flow sitometri vurguluyor. Aynı zamanda, rekombinant fibriller ve insan biyolojik numuneler ile uyumludur. Fare ötanazi ve beyin hasat IACUC onaylı prosedürlere uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Beyin Ekstraksiyon <ol><li> Izofluran (% 2), derin anesthetization sonra, buz soğukluğunda PBS% 0.03 heparin ihtiva eden bir fare serpmek ve Gage ve ark bilgi aşağıdaki beyin ekstrakte edin. 18 </li><li> Bir kriyo-şişe içinde ekstre doku yerleştirin ve sıvı azot içinde dondurularak ek yerleştirilmesi. Alternatif olarak, kuru buz üzerinde doku dondurma. Bir kez gerekli ise, uzun bir süre için -80 ° C ve saklamak için doku transfer dondurulmuş. NOT: Bu protokol, tüm beyin homojenatlarının veya mikro kesilir beyin bölgelerinde ile uyumludur. Hagihara et al. Detaylı mikrodiseksiyon protokol 19. </li></ol&gt; Biyolojik Tohum Materyali 2. Hazırlık <ol><li> 1 x TBS (10 ml için 1 tablet) halinde proteaz inhibitörleri (serbest EDTA) içinde çözerek homojenizasyon tamponu hazırlayın. Buz üzerinde şiddetle Vortex, ve mağaza. Proteaz inhibitörleri biyosensör hücre canlılığını korumak için EDTA arındırılmalıdır. </li><li> Tek kullanımlık tartmak tekne dondurulmuş beyin dokusu tartılır ve 5 ml konik tüp transfer. Nihai çözelti,% 10 ağırlık / hacim olduğu şekilde buz soğukluğunda homojenizasyon tamponu ekleyin. Geçici buz üzerinde saklayın. Doku kitlesi ve daha sonra homojenizasyon tampon maddesi hacmi kullanılan beyin boyut ve / veya bölgeye bağlı olarak değişecektir. Burada, 0,2 g ağırlığındaki bir yetişkin farenin hemibrain% 10 ağırlık / hacim solüsyonu 2 ml içinde süspanse edilir. </li><li> Transferi soğuk odaya örnekler ve uygun ayarları bir prob sonikatör ayarlayın. (Burada gösterilen) bir Omni Ruptor ile prob sonication için numuneler ov değil emin olmak için yaklaşık 75 W. kullanın darbe modu karşılık% 20, gücü ayarlayınsonication sırasında er-ısıtmalı. Yaklaşık 500 ms tekabül eden,% 30 Pulser ayarlayın. </li><li> Yine, su, izopropanol ve su ile durulanır, her çözeltisi arasında probu silinmesi ile prob sonikatör ucu temizleyin. Durulama ve taraf ve laboratuar mendil ile prob alt hem de silmek için emin olun. </li><li> Bir seferde bir numune ile çalışma, homojenizasyon tamponu içine prob ucu daldırın ve sonikatör başlatın. Yukarıda açıklanan güç ve üreteci ayarlarını kullanma, 25 toplam bakliyat teslim. Doku süspansiyon tamamen olduğundan emin olun. Bu adımı sırasında numunenin köpüklenmesini önlemek için dikkatli olun. NOT: a) toplam hacim düşük olduğu veya b) Homojenat ısıtır eğer numuneler köpüklenme duyarlıdır. Bu özel cihaz sayesinde, 250 ul daha az hacimli ses dalgalarına maruz yoktur. Numuneler, soğutulmuş durmalarını sağlamak için, borular bu aşama esnasında buz üzerinde depolanabilir. </li><li> Artık lizat uzakta silerek temizleyin prob, daha sonra bir bardak o içine 10 bakliyat teslimf temiz su. Her bir adım arasında silinerek kurutulmuş (adım 2.4 gibi) yan kenarlarına ve tekrar su, izopropanol ve su ile prob alt durulayın. Kontaminasyonu önlemek için, iyice örnekler arasında probu durulayın. NOT: tau agrega ile, daha sıkı temizleme yöntemleri örnek-örnek kirlenmesini önlemek için gerekli olduğunu bulamadı. Diğer amiloid Bununla birlikte, literatürde geniş 20,21 tarif edilmiştir, ek bakım gerektirir. </li><li> Tüm numuneler işlendikten kadar mağaza buz üzerinde homojenatlarında. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 21.300 x g&#39;de homojenatları dönerler. </li><li> Pelet rahatsız etmemek için özen, temiz bir tüpe süpernatant aktarın. Pelet atın. Daha fazla kullanım için -80 ° C&#39;de süpernatan ve mağaza lizatları alikotu. Bu tohumlama verimini azaltır, ancak homojenatlarının donma / çözülme döngüleri kaçının. </li></ol> 3. şarjı Biyosensör Hücreler NOT:Bu deney için, dört hücre çizgileri kullanın: HEK 293T (hücre çizgisi # 1), RD-P301S-CFP (hücre çizgisi # 2), RD-P301S-YFP (3 hücre çizgisi #) ve RD-P301S-CFP / YFP ( hücre çizgisi # 4). Tahlile her hücre hattının katkılarından dolayı Tablo 1 başvurun. <ol><li> Steril bir ortamda, aspirat kültür ortamı. Sıcak PBS ve aspirat ile hücreleri durulayın. Hücreleri tripsinize edin 3 dakika boyunca (tripsin-EDTA (% 0.05), 3 ml), sıcak bir kültür ortamında (DMEM 9 ml,% 10 FBS,% 1 pen / strep,% 1 glutamax) ile söndürün ve hemen hücreleri aktarmak konik tüp. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Orta aspire ve sıcak kültür ortamında tekrar süspansiyon hücre pelet. </li><li> Hemasitometre kullanılarak, her hücre hattı için hücre yoğunluğu belirlemek. Hücre yoğunluğu, toplama ve yeniden süspansiye etme hacminin zamanda konfluansa bağlı olarak değişecektir. Hücre yoğunluğu, 10 mi ortam içinde% 90 konfluent bir 10 cm&#39;lik bir tabak hasat hücreleri tekrar yaklaşık 1.000.000 hücre / ml olarak. </li><li> Makehücrelerin bir ana karışımı + ortam bir 96 çukurlu bir levhanın her bir oyuğa 130 ul ortam içinde 35,000 hücre içerecek (100 kuyu için bir ana karışımı yapmak için, örneğin, 13 mi ortam içinde 3.500.000 hücreleri tekrar süspansiyon). Bireysel deneysel tasarımlar ve zaman çizelgeleri sığdırmak için hücre numarasını değiştirin. Hücre tedavisi için ~ sonra kaplama 18 saat, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 35.000 hücre ekleyin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, yavaş yavaş düz taban kısmının her bir kuyunun içine ana karışım hücre süspansiyonu 130 ul pipet doku 96 plaka kültür işlemden geçirildi. Kaplama birlikte, plakanın alt temas etmeyen, kuyunun merkezinde pipet ucu yerleştirin. Not: kaplama biçimi değiştirilebilir olmasına rağmen, hücre çizgileri plaka başına 1-3 her biri için n = 4 kuyu yapımında tavsiye edilir. Plaka (n = 84), geri kalan hücre çizgisi # 4 (biyosensör hücreleri) için ayrılmıştır. </li><li> Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden plaka bırakarak oturmasına izin verin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve ve O / N inkübe# 8805;% 80 bağıl nem. </li></ol> 4. tedavi edilmesi Hücreler NOT: ertesi gün, tau biyosensör hücreleri aşağıdaki gibi tohum iletim kompleksleri hazırlamak,% 60-65 konfluent: <ol><li> Bir tüp içinde, bir ana karışımı yapmak için, örneğin Opti-MEM olarak indirgenmiş serum ortamı ile, örneğin Lipofectamine gibi transfeksiyon reaktifi birleştirir. Başına iyi 1.25 ul transfeksiyon reaktif ve 8.75 ul indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Flick tüpü hafifçe kısaca karıştırın aşağı doğru döndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe. </li><li> Başka bir tüp içinde, indirgenmiş serum medya ile tohum malzemesi (adım 2.9 den lizatın kısım) birleştirir. Not: Çekirdek malzemenin hacmi, bireysel deneye bağlı olarak değişir. Tohum hacmi seçerken, dikkate almak: bir numune ve potansiyel toksisite tohum bolluğu. Ham homojenatları hücrelerine toksik olabilir. Bunun gibi, istediğiniz etkiyi izlemek için mümkün olan en düşük hacim kullanın. Lizat / kuyu aralık fr Önceden test hacimleri5-20 ug toplam proteine ​​karşılık gelen om 1-5 ul. Gözenek başına toplam hacim (tohum + indirgenmiş serum ortamı) 10 ul olduğundan emin olun. </li><li> En az 20 dakika süreyle ve 2 saat kadar oda sıcaklığında kısaca hafifçe karıştırın 4.1 ve 4.2, fiske açıklanan iki tüp içeriğini birleştirin (1000 xg, 5 sn) aşağı spin ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Yavaşça bireysel biyosensör kuyularının yanında transdüksiyon kompleksinin 20 ul pipetle. Üç teknik çoğaltır, mümkünse kullanın. 24-48 saat boyunca inkübatör tedavi hücreleri dönün. Aşama 3.6 de tarif edildiği gibi aynı şartlar altında inkübe edilir. Not: fosfolipidlerin uygulanmasının lipozom reaktifi maruz kalmayan hücrelerin Biosensor için floresan profili nispeten hafif bir kayma getirmektedir, çünkü bu yerleşim için uygun negatif kontrol koşulu boş lipozomlar (örneğin, lipozom reaktifi + indirgenmiş serum ortamı) ile muamele biyosensör hücreleridir. </li></ol> FRET Akım Sitometrisi 5. Hasat Hücreleri <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOT: hücrelerini-genel hasat önce 24-48 saat tedavi sonrası-standart bir ters floresan mikroskop GFP filtresi kullanılarak tohumlama faaliyetinin ön okuma almak mümkündür. Tohum malzeme ile tedavi edilen hücreler yoğun noktasal ve retiküler hücre içi kapanımlar (- B Şekil 1A) gösterecektir oysa tohum malzemesi (yani, boş lipozomlar) olmadan tedavi hücreler, yaygın floresan gösterecektir. <ol><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm hücre ortamı (150 ul) aspire. Tripsinize (50 ul), 5 dakika boyunca hücreler ve 150 ul soğuk kültür ortamı ile söndürün. Hücre kaldırma ve sonraki hücre kaybına neden olabilir, bu aşamada trypsinization öncesinde PBS durulama dahil etmeyin. Yolluk stratejileri yoluyla akım sitometri sırasında herhangi kirlenmesine ölü hücreleri ve enkaz dışlamak. </li><li> Hemen 5 ml 1000 xg&#39;de, transferi 96 gözenekli yuvarlak tabanlı plakanın hücreleri, ve santrifüj söndürme işleminden sonraoda sıcaklığında n. </li><li> Aspire hücre pelet rahatsız etmemek için özen, orta atmak ve. </li><li> Yavaşça fakat iyice 50 ul% 2 paraformaldehid hücre pelletini ve 10 dakika inkübe edilir. Sabitleme daha temiz ve tutarlı sonuçlar sağlar rağmen Alternatif olarak, koşmak hücreler, canlı. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüje hücreleri. Aspire hücre pelet rahatsız etmemek için özen, paraformaldehid atmak ve. </li><li> Yavaşça, ama iyice, 200 ul tamponla sitometri soğutulmuş akışı hücre pelletini tekrar süspansiyon (HBSS,% 1 FBS, 1 mM EDTA) ve hücre topaklanma önlemek için en kısa sürede plaka çalıştırın. </li></ol> 6. FRET Akım Sitometri Not: Lazer hattı ve filtre setleri (Tablo 2) ile uyumlu bir FRET donatılmıştır MACSQuant VYB, gibi bir akış sitometrisi kullanın. Bu bölümde her adım için, yazılımın 96 kuyu şablonu kullanarak ilgi kuyusunu tıklatın ve tıklatın&quot;Play&quot; örnek alımı ve akışını başlatmak için. &#39;Yeni analiz pencere&#39; simgesini tıklayarak araziler ya da istatistik tabloları yapın. X veya Y ekseni ya da üzerinde başlığını tıklayarak ve uygun filtreyi seçerek bireysel değişkenli araziler üzerinde eksen parametrelerini değiştirin. Hücre popülasyonlarının veya floresan sinyalleri kaydırmaya artırmak veya uygun filtreler ile ilgili gerilimleri azaltmak. Bu alet sayesinde, doğru tek hücreli izlenmesini sağlamak için &lt;1,000 olay / sn çalıştırın. <ol><li> Hücre popülasyonu sol alt kadranda kadar bir Side Scatter-Alan Forward Scatter-Alan (FSC-A) iki değişkenli arsa vs (SSC-A) ve hücre hattı 1. çalışırken, SSC ve FSC voltajlarını ayarlamak emin olun. Çokgen aracını tıklatın ve hücre popülasyonu (Gate P1) tanımlar. Tüm yolluk parametreleri için bakınız Şekil 2. </li><li> Bir FSC-H (yükseklik) FSC-A değişkenli arsa vs yapın ve arsa üzerinde &quot;canlı&quot; tıklayarak, ve P1 seçerek bu arsa Gate P1 uygulanır. Hücre hattı # 1çalışan, çokgen aracını tıklatın ve tek hücreleri (Gate P2) tanımlar. </li><li> CFP, YFP ve FRET: 3 histogram araziler, ilgi filtrelerin her biri için biri yapmak. Araziler üzerinde &quot;canlı&quot; tıklayarak, ve P2 seçerek bu araziler tüm Kapısı P2 uygulayın. Hücre hattı 1. çalışırken, gerilimleri ayarlamak şekilde CFP, YFP medyan hücre popülasyonu ve histogramlar 405 nm lazer ile hücreleri uyarmak, CFP ve FRET ölçmek ve birlikte yakalama floresan için her 0 ile 1. olan FRET sırasıyla, 450/50 nm ve 525/50 nm filtre. YFP ölçmek için, bir 525/50 nm filtreli 488 nm lazer ve yakalama floresan ile hücreler heyecanlandırmak. Lazer ve filtre ayarları daha Tablo 2&#39;de açıklanmıştır. </li><li> FRET ve YFP kanal içine CFP yayılma için tazminat gerçekleştirin. NOT: Tazminat floresan dağıtma düzeltme işlemidir. Tek florokrom floresan emisyonu bir filtre desi içinde algılandığında floresan yayılma oluşurBaşka bir florokrom sinyali ölçmek için yapması- nın doğrudan. Uygun tazminat ile CFP yayılma floresans FRET ve YFP kanallarından çıkarılabilir. NOT: Tazminat hem floresan pozitif ve negatif hücrelerin varlığını gerektirir. Bu nedenle, CFP-pozitif hücreleri üzerindeki (hücre çizgisi # 2), çalışma öncesinde numuneye eklenmesi gerekir negatif hücreler (1 hücre çizgisi #) telafi etmek için. <ol><li> De hücre çizgisi # 2 süspansiyon 200 ul içine tek bir hücre hattı 1. süspansiyonu 30 ul başak telafi hemen önce. </li><li> &quot;Çalgı Settings&quot; simgesine, daha sonra &#39;tazminat&#39; sekmesini tıklayın ve tazminat tablosunu açmak için &#39;matris&#39; kontrol edin. </li><li> Aşama 6.3 açıklandığı gibi, CFP-A değişkenli arsa vs FRET-A yapın ve kapı P2 uygulayın. Hücre hatları 1 + 2 çalışırken, &#39;Quadrant&#39; simgesini tıklayın ve floresan -negatif ve pozitif popülasyonlar düşük iki kadran ayrılır ki (Gates, LL3 a kadran çizmeknd LR3 sırasıyla). </li><li> LL3 ve LR3 kapıları için FRET medyan floresan yoğunluğu (MFI) görüntüleyen bir istatistik tablo oluşturun. FRET sinyal MFI LL3 ve LR3 arasında eşit olana kadar tazminat matris içinde FRET parametresini ayarlayın. Bu etaptan sonra, FRET sinyali MFI FRET kanalının içine CFP yayılma yokluğunu gösteren, boyanmamış hücreler ve CFP-pozitif hücreleri arasında eşittir. </li><li> Aşama 6.3 açıklandığı gibi, CFP-A değişkenli arsa vs YFP-A yapın ve kapı P2 uygulayın. Adım 6.4.3 yapılan benzer kadranlar (LL4 ve LR4) çizin. </li><li> LL4 ve LR4 için YFP MFI görüntüleyen bir istatistik tablo oluşturun. YFP sinyal MFI LL4 ve LR4 arasında eşit olana kadar tazminat matris içinde YFP parametresini ayarlayın. Bu etaptan sonra, bir YFP sinyal MFI YFP kanal içine CFP yayılma yokluğunu gösteren, boyanmamış hücreler ve CFP-pozitif hücreleri arasında eşittir. </li></ol></li><li> FollKapı kurulum ve tazminat nedeniyle, faiz kuyu vurgulamak ve plaka kalanını çalıştırın. </li><li> Tüm numuneler &#39;dosyası&#39;, ardından &#39;kopya&#39; tıklayarak, ihracat verileri dosyaları çalıştırmak edildikten sonra. &#39;Veri dosyaları&#39; sekmesini seçin deneme klasörünü vurgulayın ve &#39;kopya&#39; tıklayın. </li></ol> 7. Veri analizi NOT: X veya Y ekseni ya da üzerinde başlığını tıklayarak ve uygun filtreyi seçerek bireysel değişkenli araziler üzerinde değiştirme eksen parametreleri. <ol><li> Analiz programı flow sitometri Open FCS dosyaları. </li><li> Dağıtma özelliklerine göre, benzer şekilde, Bölüm 6&#39;da tarif edilene boş lipozomlar ile muamele edilen hücrelerden alınan (FSC-A v FSC H) hücre popülasyonu (FSC vs SSC) ve tekli popülasyonu tanımlamak için çok köşeli bir kapı kullanın. </li><li> OBP kompanzasyon kurulumu sırasında yapıldı, daha fazla CFP ayarlamak yok. </li><li> YFP değişkenli arsa vs FRET oluşturun. Hücre hattı 3. Kullanılması, FRET-pozitif hücre popülasyonu yamaç boyunca uzanan bir çokgen kapısı çizerek yanlış FRET kapısı tanımlayın. Bu kapı, FRET filtre içinde bir sinyal yayar YFP tek pozitif hücreler hariç, daha önce ve arkadaşları yasaklayarak gösterilene benzer çekilmektedir. 22 </li><li> OBP değişkenli arsa vs FRET boş lipozom-tedavi OBP / YFP hücrelerini çizerek bir FRET kapısı tanımlayın. Yukarı doğru uzanan ve uzak nüfus sola nüfusun yamaç boyunca bir çokgen kapısı tanıtın. Bu kapı arka plan hücrelerinin ≥1% olduğu FRET gibi çoğu hücreleri (~% 99), dışarıda olmalıdır. Bu kapının vitese herhangi bir olay FRET-pozitif kabul edilir. Not: Yukarıdaki tarif Her bir kapak daha sonra kapıları oluşturmak önce tüm örneklere uygulanır. Analizi takiben, dört ayrı kapıları tanımlanır (Hücre popülasyonu, tekli; yanlış FRET, FRET). </li><li> Yüzde FRET pozitifliği ve MFI: dahil olmak üzere ilgi Tutanak analiz parametreleri,FRET-pozitif hücre. El ile yüzde pozitifliği ve MFI ürünü ölçerek entegre FRET yoğunluğunu hesaplamak. Not: entegre FRET yoğunluğu sonuç ölçüsü, iki bireysel faktörler daha az olan bir ürün hesaplama önlemek için 1 &#39;den büyük ya da eşit ve MFI (adım 7.5&#39; de tanımlandığı gibi) ayarlanmış arka FRET olarak kullanılırsa. </li></ol>

<ol><li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li>
<li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+Alzheimer%27s+disease-related+neurofibrillary+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li>
<li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+properties+of+Tau+protein%3A+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li>
<li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li>
<li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li>
<li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302(2012).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.</li>
<li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li>
<li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires%3A+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li>
<li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning%2C+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hosp+Infect%22%5BJournal%5D)">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li>
<li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344(2010).</li>
<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer%27s+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537(2015).</li>
</ol>

Bu tahlil Janssen Pharmaceuticals'a lisanslanmıştır.

Burada anlatılan FRET akım sitometri sistemi hızlı ve kantitatif tau tohumlama aktivitesini değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Sadece orta hücre kültürü deneyim ve FRET çalışan bir bilgi ve akım sitometri gerektirir. Beta bilanço yapısı bağlandığı zaman floresan gelişmiş sergileyen - - örneğin Thioflavin T gibi diğer ekim deneyleri, zahmetli ve saf, rekombinant protein alt tabakayı gerektirir. Ayrıca, tau için in vitro tohumlama deneyleri sadece semi-kantitatif ve tohum malzemesi 23,24 arasında s...

Hücre içi tau amiloid birikimi, Alzheimer hastalığı gibi tauopatıler tanımlar. Hastalığın erken evrelerinde, patoloji genellikle beynin farklı bölgelerinde lokalize, ancak hastalığın ilerlemesi ile, patoloji kaçınılmaz farklı sinir ağları 1-5 boyunca yayılır. Biriken deliller toksik protein agrega transselüler yayılımı (6-10 gözden) Bu patoloji altında yatan göstermektedir. Bu modelde, proteopathic tohumları (örneğin, tau) verici hücrelerden salınan ve şablonu konformasyonal değişiklik 11-15 ile yanlış katlanmış formda doğal tau proteini dönüşürken, komşu hücreleri girin. Burada açıklanan tahlil hassas tür tohum aktivitesini tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu rekombinant proteinin ve biyolojik numuneler ile uyumlu ve proteopathic tohumlama aktivitesi 16 dakikalık seviyelerinin ölçümü sağlar. Stabil tau tekrar d ifade HEK 293T hücreleriCFP ya YFP da kaynaşmış hastalıkla ilişkili P301S mutasyonu içeren OMain (RD) tohumlama aktivitesi stabil biyosensör olarak hizmet (bundan sonra tau-RD-CFP / YFP hücreleri olarak da adlandırılır). Proteopathic tohum yokluğunda, hücreler, bir çözünür bir monomer olarak tau korumak ve kayda değer bir plan FRET sahiptir. Hücrelerin içine spontan alma ya da tau tohumların lipozom-aracılı iletim Bununla birlikte, akış sitometrisi ile, tek hücreler içinde ölçüldüğü bir FRET sinyali üretir RD-CFP ve RD-YFP agregasyonu ile sonuçlanır. Bu testte çok sayıda bileşenleri duyarlılığını artırmak ve değişkenliği azaltmak için geliştirilmişti. Bir 1 monoklonal hücre çizgisi: en uygun sinyal sağlar olarak 1 RD-CFP / YFP sentezleme oranı seçildi: gürültü. Hassasiyetini artırmak için, fosfolipidler, doğrudan hücre içine tohum tanıtmak için kullanılan (uptake biyolojik mekanizmaları incelemek için, ancak bu ihmal edilebilir). Son olarak, nüfus düzeyi ve tek bir hücre de izler FRET akım sitometri<html> seviye, diğer protein kümeleme deneyleri aksine. Nihai sonuç ölçüsü, entegre FRET yoğunluğu, yüksek kantitatif ve agregasyonu ile hücrelerin sayısında ve kümeleme her hücrede meydana geldi hangi derecede hem hesapları. Bu optimize tüm parametreler duyarlılığını artırmak ve tekrarlanabilirlik sağlamak. Bu sistem son zamanlarda yaygın olarak kullanılan diğer tau patolojik belirteçleri temporal başlamasını ve tau tohumlama faaliyetleri göreli ilerlemesini (örneğin, MC1, AT8, PG5 ve ThioflavinS) değerlendirildi transgenik P301S tauopathy farelerde 17 kapsamlı bir çalışmada kullanılmıştır. Tohum etkinlik bugüne kadar en az 6 hafta histolojik algılama önceki değerlendirilen tau patolojisi en eski ve en güçlü işaret vardır. Tohum aktivite başlangıcı ve / veya nörodejenerasyonda 16 ilerlemesinde proteopathic tohumların nedensel rolünü düşündürmektedir 1.5 ay ve ilerleyen yaşla birlikte artar görünür. e_content &quot;&gt; biyolojik örneklerden tohum malzemesi dakika seviyelerinin hassas kantitatif. Erken hastalığın ilerlemesini izlemek çalışmaları kolaylaştırabilir deneme süresinin kısaltılması ve genç hayvanların kullanılmasını sağlayarak, bu klinik öncesi hayvan deneylerinde verimliliği ve doğruluğunu artırabilir. Örneğin, P301S fare daha önce tarif edilen, kurşun bileşikleri erken 4-6 hafta kadar teslim edilebilir, ve 2-4 hafta sonra etki için izlenir. deney doğru tohumlama herhangi bir azalma ölçmek gerekir (ya da ekim aktivitesi başlangıcında hemen önce) faaliyet. sitometrisi in vitro tarama uygulamaları da. Örneğin, anti-tau reaktifler (örneğin, antikorlar, küçük moleküller, vs.) ya da rekombinant tau kullanılarak yapılmış, kültür doğrudan indüksiyon tohumlama bloke etme kapasitesi hızlı bir şekilde test edilebilir olan akış FRET bir tohum kaynağı (Şekil 5). Bu düzenleme ile, tohum malzemesi hazırlandıktan sonra, eski olarak agrega ya da beyin türevli lisatlarperiment veri analizi de dahil olmak üzere, tamamlamak için sadece üç gün sürer. Proteopathic tohumlama faaliyetinin hızla kantitatif böylece nörodejenerasyon birçok çalışma kolaylaştırabilir.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaz İnhibitörleri (EDTA içermez)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Kriyo-şişeler</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Tartı Tekneleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüp</td><td>ABD Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor Ultrasonik Homojenizatör</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik Homojenizatör Omni International için Mikro Uç</td><td></td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Gürültü Önleyici Kulaklık</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tüpler</td><td>USA Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>mikrosantrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüpler</td><td>Phoenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml reaktif resevoirs</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu düz tabanlı plakalar</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu yuvarlak alt plakalar</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Sallanan Kova Rotoru</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemasitometre</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Akış Sitomörü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Raf</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo analiz yazılımı</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 & l pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipet uçları</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 & l pipet uçları</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serolojik pipet</td><td>Phoenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serolojik pipet</td><td>Phoenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serolojik pipet</td><td>Phoenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

fret akım sitometrisi ile proteopathic tohumculuk faaliyet duyarlı algılama

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Artan kanıtlar, Alzheimer hastalığı ve ilgili tauopatiler dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda patolojinin başlatılması ve ilerlemesi için bir mekanizma olarak toksik protein agregatlarının veya proteopatik tohumların hücre içi yayılımını desteklemektedir. Tau tohumlarının hastalığın ilerlemesindeki potansiyel olarak kritik rolü, biyolojik örneklerde tohumlama aktivitesini kolayca tespit eden hassas bir tahlil ihtiyacını güçlü bir şekilde desteklemektedir. 
Floresan rezonans enerji transferinin (FRET) özgüllüğünü, akış sitometrisinin duyarlılığını ve bir monoklonal hücre hattının stabilitesini birleştirerek, ultra hassas bir tohumlama testi tasarlanmıştır ve insan ve fare beyni homojenatları dahil olmak üzere rekombinant veya biyolojik örneklerden tohum tespiti ile uyumludur. Test, protein agregasyonu üzerine bir FRET sinyali üreten CFP veya YFP'ye kaynaşmış hastalıkla ilişkili P301S mutasyonunu barındıran tau'nun agregasyona eğilimli tekrar alanını (RD) stabil bir şekilde ifade eden monoklonal HEK 293T hücrelerini kullanır. Proteopatik tau tohumlarının (ancak diğer proteinlerin değil) biyosensör hücrelerine alımı, RD-CFP ve RD-YFP'nin agregasyonunu uyarır ve akış sitometrisi, agregasyonun neden olduğu bu FRET'i hassas ve kantitatif olarak izler. Test, rekombinant tau tohumlarının femtomolar konsantrasyonlarını (monomer eşdeğeri) tespit eder, üç büyüklük sırasını kapsayan dinamik bir aralığa sahiptir ve tauopati transgenik farelerden ve insan tauopati deneklerinden elde edilen beyin homojenatları ile uyumludur. Küçük modifikasyonlarla, tahlil, α-sinüklein gibi diğer proteopatik tohumların tohumlama aktivitesini de tespit edebilir ve ayrıca birincil nöronal kültürlerle uyumludur. FRET akış sitometrisinin kolaylığı, hassasiyeti ve geniş uygulanabilirliği, çok çeşitli protein agregasyon bozukluklarının incelenmesini yararlı kılar.

FRET akım sitometri duyarlı, nicel ve rekombinant veya biyolojik örneklerden tohumlama faaliyetinin hızlı algılama sağlar. Deney ayarları yüzeysel olduğu: Tau-RD-CFP / YFP ifade monoklonal türetilen stabil hücre hatları 24-48 saat için kuluçkalanmıştır, tohum malzemesi ile transduse ve analizi (Şekil 1A) akış sitometrisi tabi tutulur. Tohumların yokluğunda, biyosensör hücreleri çözünür, monomerik formda (Şekil 1B) tau korumak. Tohumların varlığında ise, biyosensör hücreleri akış sitomet...

Protein agregatlarının veya proteopatik tohumların hücreden hücreye transferi, nörodejeneratif hastalıklarda patolojinin ilerlemesinin altında yatıyor olabilir. Burada, rekombinant veya biyolojik numunelerden tohumlama aktivitesinin spesifik ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan yeni bir FRET akış sitometrisi testi açıklanmaktadır.

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant veya biyolojik kaynaklı protio patik ekim aktivitesini tespit ederek proteinlerin, agregatların ve bir örneğin hassas bir şekilde saptanmasını sağlamaktır. Bu yöntem, nörodejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, hastalık hayvan modellerinde terapötik müdahale sonrası ekim aktivitesindeki değişiklikleri nasıl kantitatif olarak değerlendirebiliriz?Bu tekniğin avantajları arasında, düşük seviyeli protein agregatlarına karşı yüksek özgünlüğü yer almaktadır. Ayrıca üstün özgünlüğü, kullanım kolaylığı ve yüksek işlem kapasitesi ile öne çıkar. Bu prosedürü bugün, beraberinde yardımcı yazar Brandon Holmes ile birlikte ben gerçekleştireceğim.Biyolojik tohum materyalini hazırlamak için, önce dondurulmuş beyin dokusunu tek kullanımlık bir tartım kabında tartarak başlayın. Ardından dokuyu konik bir tüpe aktarın, nihai çözeltinin hacme oranla %10 olacağı şekilde buz soğukluğunda homojenizasyon tamponu ekleyin ve numuneleri buz üzerinde soğuk odaya taşıyın. Daha sonra, bir probu uygun ayarlara getirin ve probun yan kısımlarını ve altını durulayın.İşaret edildiği gibi, her bir çözelti arasında probu silerek gösterge ucunu üç kez yıkayın. Prob hazır olduğunda, ucu bir örneğin homojenizasyon tamponuna daldırın ve toplam 25 darbe verecek şekilde sonikasyonu başlatın. Doku tamamen süspansiyon haline geldiğinde, homojenatı santrifüjleyerek çöktürün ve süpernatantı temiz bir tüpe aktarın.Damak kısmını rahatsız etmemeye özen gösterin. Birçok farklı homojenizasyon tekniği mevcut olsa da, probasyon biyolojik örneklerden küçük miktarlarda protio patojenik tohumların izole edilmesi için daha üstündür. Mekanik disosiyasyon, dokunun tutarlı ve etkili bir şekilde parçalanmasını ve ardından tohum ekstraksiyonunu sağlar.Ardından süpernatantı alikotlayın ve lizatları negatif 80 derece Celsius'ta saklayın. Biyosensör hücrelerini steril koşullar altında yeniden ekmek için, her hücre hattını önce ılık PBS ile durulayın ve ardından üç dakika boyunca trypsin EDTA ile inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, reaksiyonu ılık kültür ortamı ile durdurun ve hücreleri derhal konik bir tüpe aktarın.Hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve peleti taze besiyeri içinde süspanse edin. Ardından hücreleri sayın ve 13 mililitre besiyeri başına 3.500.000 hücre olacak şekilde bir ana karışım hücre dilüsyonu hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, pipet uçlarını plağın tabanına değdirmeden kuyucukların merkezine yerleştirmeye dikkat ederek, her bir kuyucuğa 130 mikrolitre hücre aktarın; bunun için düz tabanlı, doku kültürü işleminden geçmiş 96 kuyucuklu plaka kullanın.Hücreler ekildikten sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden çökmeye bırakın ve ardından plağı gece boyunca 37 °C'de, %5 karbondioksit ve ≥%80 bağıl nem altında inkübe edin. Ertesi gün biyosensör hücreleri %60 ila %65 konfluens düzeyine ulaştığında, transduksiyon komplekslerini oluşturmak için serumu azaltılmış besiyeri, lipozom reaktifi ve biyolojik tohum kaynağını birleştirin. Ardından, her bir bireysel biyosensör kuyusunun kenarından 20 µL transduksiyon kompleksi pipetleyin ve hasat etmeden önce işlem görmüş hücreleri tekrar 24 ila 48 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.İşlem görmemiş hücreler sadece yaygın floresan gösterecektir. Ancak, tau tohum materyali ile işlem görmüş hücreler parlak agregatlar gösterecektir. Hücreleri hasat etmek için bir ila iki gün bekledikten sonra, hücre kültürü ortamını 50 microliters trypsin EDTA ile değiştirerek reaksiyonu durdurun. 150 microliters soğutulmuş kültür ortamı ile beş dakika bekledikten sonra, hücreleri derhal 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın ve hücreleri pelletleyin; pelletlere zarar vermeden süpernatanları aspire edin ve ardından hücreleri nazikçe ancak tamamen 50 microliters %2 paraformaldehit içinde 10 dakika boyunca resüspande edin.Ardından hücreleri tekrar santrifüjleyin ve pelletleri mümkün olan en kısa sürede 200 µL soğutulmuş akış sitometrisi tamponu içinde yeniden süspanse edin. Fiksasyondan sonra, plakayı uyumlu bir akış sitometresine yükleyin ve varyant grafiği ile yan saçılma alanı (side scatter area) ile ileri saçılma alanı (forward scatter area) grafiğini oluşturun. Sonrasında, birinci hücre hattı çalışırken, hücre popülasyonu sol alt kadrana gelene kadar yan saçılma ve ileri saçılma voltajlarını ayarlayın.Ardından poligon aracını kullanarak hücre popülasyonunu P1 kapısı (gate) olarak tanımlayın. Şimdi, ileri saçılım yüksekliği ile ileri saçılım alanı arasında bir varyant grafiği oluşturun ve P1 kapısını uygulayın. Sonrasında, tek hücreleri P2 kapısı olarak tanımlayın ve her biri için bir histogram oluşturun.C-F-P-Y-F-P ve fret filtreleri için, kompanzasyon amacıyla C-F-P-Y-F-P ve fret filtrelerinin her biri için birer tane olmak üzere iki ila üç farklı histograma kapı P'yi uygulayın. 200 µL hücre hattı iki süspansiyonunun içine 30 µL hücre hattı bir süspansiyonu ekleyin. Ardından cihaz ayarları simgesine, ardından kompanzasyon sekmesine tıklayın ve kompanzasyon tablosunu açmak için matrisi kontrol edin.Fret alanı ile CFP alanı değerlerini değişkenle gösteren bir grafik oluşturun ve P2 kapısını uygulayın. Ardından, hücre hattı bir ve hücre hattı iki çalışırken, kuadrant simgesine tıklayın ve floresan negatif ve pozitif popülasyonlar alt iki kuadrant ile ayrılacak şekilde kuadrantlar çizin. Şimdi, LL3 ve LR3 kapıları için fret'in medyan floresans yoğunluğunu veya MFI değerini gösteren bir istatistik tablosu oluşturun ve fret sinyalinin MFI değerleri LL3 ile LR3 arasında yaklaşık olarak eşitlenene kadar kompanzasyon matrisindeki fret parametresini ayarlayın.Ardından,lelemanlarla dört bölmeye ayrılmış bir YFP alanı ile CFP alanı varyat grafiği oluşturun. YFP sinyalinin MFI değeri bölmeler arasında yaklaşık olarak eşit olana kadar kompanzasyon matrisindeki YFP parametresini ayarlayın. Bu işlem, daha önce FRET akış sitometrisi için gösterilen işleme benzerdir.Birincil floresan taşması, CFP'den FRET detektör kanalına yayılan sinyalden kaynaklanır ve bu durum, tek renkli pozitif kontrol hücreleri kullanılarak floresan kompanzasyonu yoluyla düzeltilebilir. Tüm kapılar belirlendikten ve CFP sinyali kompanze edildikten sonra, ilgilenilen kuyucukları seçin ve verileri analiz etmek için plağın geri kalanını çalıştırın. Öncelikle, akış analizini kurarken kullandığımız parametrelerin aynısını kullanarak hücreleri ve tekil hücreleri tanımlayın.Ardından, üçüncü hücre hattını kullanarak, YFP tek pozitif hücrelerini bir varyant grafiğinde fret'e karşı YFP şeklinde çizdirin. YFP sızıntısını fret filtresinden hariç tutmak için, fret pozitif hücre popülasyonunun eğimi boyunca ve dışa doğru uzanan bir poligon kapı çizerek bir yalancı fret kapısı tanımlayın. Yalancı fret kapısını tüm örneklere uyguladıktan sonra, boş lipozomla işlem görmüş C-F-P-Y-F-P hücrelerini bir varyant grafiğinde fret'e karşı CFP şeklinde çizdirin ve popülasyonun eğimi boyunca yukarıya ve sola doğru popülasyondan uzaklaşan bir poligon kapı ekleyin.Bu kapıya kayan tüm olaylar fret pozitif olarak kabul edilir ve hücrelerin yüzdesi, işlem sırasında kullanılan tohum titresi ile korelasyon gösterecektir. Son olarak, fret pozitiflik yüzdesi ve fret pozitif hücrelerin medyan floresan yoğunluğu dahil olmak üzere ilgili analiz parametrelerini kaydedin. Ardından, entegre fret yoğunluğunu manuel olarak hesaplamak için pozitiflik yüzdesi ile MFI'nın çarpımını ölçün.Tau agregatlarının veya çekirdeklerinin yokluğunda, tau, tutarlı bir difüz ve FRET negatif floresan sinyali ile temsil edilen çözünür monomerik bir durumda tutulur. Biyosensör hücrelerine tau çekirdeklerinin eklenmesinin ardından, endojen tau, agregatlı ve FRET pozitif bir duruma dönüştürülür (FRET kantifikasyonu). Akış sitometrisi analizi, rekombinant tau'nun femtomolar konsantrasyonlarının tespit için yeterli olduğunu doğrulamaktadır.Farklı yaşlarda sakrifiye edilen tauopati farelerinden alınan beyinsap dokusu, hayvanlar arasında 1,5 aylık yaş kadar erken bir dönemden itibaren tutarlı bir ekim aktivitesi tespitinin gösterildiği temsilci bir beyin bölgesi olarak hizmet eder. Bu deneyde, Alzheimer hastalığı olan deneklerden alınan beyin homojenatları güçlü bir ekim aktivitesi sergilerken, yaş eşleşmeli kontrol ve Huntington hastalığı olan denekler bunu göstermemiştir; bu durum analiz yönteminin tau agregatlarına özgüllüğünü kanıtlamaktadır. Tau, CFP ve tau YFP lentiviral konstrüktlar ile transduksiyon yapılan işlem görmemiş primer nöronal kültürler, rekombinant tau ekimleri ile tedavi edildiğinde yaygın floresan sinyal sergilemiştir.Buna rağmen, endojen tau, lipozom aracılı transdüksiyon olmasa bile fret akış sitometrisi ile tespit edilebilen büyük agregatlar oluşturur. Tohumlama kaynakları, heparin gibi tau alımını inhibe eden ilaçlarla önkuluza tabi tutulduğunda ve lipozomlar yokken işleme alındığında, hem rekombinant fis hem de tauopati fare beyni örneklerinde bulunan tohumlama aktivitesi bloke edilebilmektedir. Uzmanlaşıldığında.Bu teknik, her gün yalnızca bir ila iki saatlik laboratuvar çalışmasıyla üç günde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, belirli adımlar için kurum içi optimizasyonun gerekeceğini hatırlamak önemlidir. Örneğin, çeşitli biyolojik kaynaklardan gelen protio patojenik tohumlardan etkili titrelerin belirlenmesi sırasında.Bu videoyu izledikten sonra, rekombinant ve biyolojik kaynaklardan gelen protio-patik tohumlama aktivitesini tespit etmek amacıyla FRET akış sitometrisi deneylerinin nasıl kurulacağı, yürütüleceği ve analiz edileceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Video, in vivo adjuvan kaynaklı sitotoksik T lenfosit veya CTL üretimini izlemek için immünolojik bir yöntemi göstermektedir. Bir fareye genetik olarak tasarlanmış, proliferatif boya lekeli donör CD8 + T lenfositleri önceden enjekte edilir. Ovalbüminin adjuvanlarla deri altı enjeksiyonu, hasat sonrası immün boyama ve akış sitometrisi yoluyla tanımlanan sitotoksik CD8 + T lenfositleri oluşturur.

Adjuvan Aracılı Sitotoksik T Lenfosit Oluşumunu İzlemek İçin İmmünolojik Bir Teknik

Video, biyolojik örneklerden izole edilen protein agregatlarının tohumlama aktivitesini tespit etmek için bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) akış sitometrisi testini göstermektedir. Tau raportör proteinlerini eksprese eden memeli hücreleri, tau tohumları içeren lipozom transdüksiyon kompleksleri ile inkübe edilir. Bu tohumlar, raportör proteinlerin toplanmasına aracılık ederek akış sitometresinde bir FRET pozitif sinyalinin üretilmesine yol açar.

Tau-Tohum İndüklenen Raportör Protein Agregasyonunu Tespit Etmek için Bir FRET Akış Sitometrisi Tekniği

Burada açıklanan tespit ve akış sitometrisi ile analiz kemirgen doku ve izole mitokondri immün ile mitokondriyal dış membran proteinleri ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, mitokondriyal alt popülasyonlarının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için genişletilebilir.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Pek çok farklı yöntem akış sitometrik (FCM) ile hücre dışı veziküller (EVS) ölçülmesi için vardır. Kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Ölçüm EVs için iki protokoller bireysel algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Burada sunulan bir protokol Proliferasyona CD4+ T hücreleri antijenik proteinler veya peptidler boya seyreltme kullanarak yanıt olarak. Bu tahlil nadir antijen özgü T hücrelere özellikle duyarlıdır ve antijen özgü hücrelerin klonlama kolaylaştırmak için değiştirilebilir.

Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Antikanser aptamer gelişiminde gerekli bir adım, hedefe bağlanmasını test etmektir. Bu bağlanmayı incelemek için akış sitometrik tabanlı bir tahlil gösteriyoruz ve negatif bir kontrol aptamer ve bu belirli protein için pozitif veya negatif olan kanser hücrelerinin dahil edilmesinin önemini vurguluyoruz.

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Burada, farelere ksenogreftlenmiş ve kemik iliği aspiratlarından elde edilen akut insan miyeloid lösemi hücrelerinde mTORC1, JAK/STAT5 ve MAPK yollarının aşağı akışındaki sinyalleri analiz etmek için fosfoflow sitometri tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 ve p-ERK1/2 seviyeleri, yüksek duyarlılığa sahip yeni nesil spektral akış sitometresi kullanılarak eş zamanlı olarak ölçülür.

Akut Miyeloid Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenotransplantların Hücre İçi Fosfoflow Sitometrisi

Öğrenin, FRET akım sitometrisi ile proteopatik tohumlama aktivitesini yüksek duyarlılıkta nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklardaki protein agregatlarını değerlendirmek için araştırmacılara yüksek verimli bir araç sunar.

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Daha fazla video keşfet