Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Miyokard enfarktüsü (MI) sadece bozulmuş kardiyak fonksiyon tarafından değil, aynı zamanda MI'nın davranışsal sonuçlarında yer alan bir beyin bölgesi olan amigdalada apoptoz ile de takip edilir. Bu protokol, MI'nın nasıl indükleneceğini, amigdala dokusunun nasıl toplanacağını ve burada bir apoptoz belirteci olan kaspaz-3 aktivitesinin nasıl ölçüleceğini açıklar.

Bu prosedürün genel amacı, spektroflorometri kullanılarak bir miyokard enfarktüsünden sonra sıçan amigdalasındaki kaspaz-3 aktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, miyokard enfarktüsünün bilişsel performans, zihinsel sağlık, yaşlanma süreci ve uyku üzerindeki sonuçları gibi davranışsal sinir bilimi alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı basit, hızlı ve güvenilir olmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, cerrahi ve doku örneklemesi için el becerisi gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızda araştırma görevlisi olan Kim Gilbert olacaktır. Onaylanmış kurumsal protokollere göre anestezi indükledikten sonra, pençe kıstırma refleksinin yokluğunda uygun anesteziyi onaylayın.

Sıçanı endotrakeal boru ile entübe edin ve vücut ısısını 37 santigrat derecede tutmak için hayvanı bir ısıtma yastığı üzerinde ventral dekübit pozisyonuna yerleştirin. Endotrakeal tüpü %2 izofloran veren bir anestezi makinesine bağlayın. Daha sonra, cerrahi bölgeyi klorheksidin glukonat ve izopropil alkol ile hazırlayın.

Ve kuruluğu önlemek için her iki göze de oftalmik merhem sürün. Ameliyat bölgesinin etrafında steril bir alan oluşturmak için hayvanın üzerine steril bir örtü yerleştirin. Ve gerekli steril cerrahi aletleri hayvanın yanındaki başka bir steril alana yerleştirin.

Ardından, cildi 10 numara neşter bıçağı veya makasla kesin. Kas dokusunu soymak için makas veya hemostatik bir kelepçe kullanın. Daha sonra göğüs duvarını açmak için makas veya hemostatik bir kelepçe kullanın ve göğüs ekartörünü yerleştirin ve hemostatik kelepçe ile perikardımı açın.

Koroner tıkanıklığı indüklemek için, önce 360 milimetre uzunluğunda dört sıfır ipek sütürü inen koroner arterin etrafına ve bitişik miyokard dokusuna geçirin. İpek sütürün her iki ucunu da 14 gauge 1,25 santimetre uzunluğunda plastik bir tüpe yerleştirin. İpek sütürün her iki ucunu da çekin ve tüpü tıkamak için artere doğru itin.

Plastik tüpü hemostatik bir kelepçe ile sıkıştırarak tıkanıklığı sabitleyin ve tıkanıklığı 40 dakika boyunca koruyun. 40 dakika sonra, hemostatik kelepçeyi ve ardından esnek boruyu ve ipek ipliği çıkararak tıkanıklığı serbest bırakın. Pnömotoraksı önlemek için göğüs kafesini iki sıfır dikişle kapatın ve göğüs boşluğuna esnek bir kateter yerleştirin ve 10 mililitrelik bir şırınga ile göğüs kafesinden hava çekin.

Kası dört adet sıfır ipek sütürle ve cildi üç adet sıfır ipek sütürle dikin. Son cilt dikişini kapatmadan önce, 10 mililitrelik şırınga ve kateter kullanarak torakstan tekrar hava çekin. Cildi kapatmayı bitirin ve ardından izofloranı durdurun.

Fareyi temiz bir kafese yerleştirin ve anesteziden iyileşme sırasında izleyin. Her sekiz saatte bir tekrar dozlama ile analjezi uygulayın. Hayvanı onaylanmış prosedürlere göre insancıl bir şekilde kestikten sonra, farenin başını kırılmış buz üzerine yerleştirilmiş bir tabağa yerleştirin.

Kafatasını açmak için makas kullanın. Ardından, yukarı doğru çekerek alttaki dokuyu parçalamadan kemik demetlerini ayırmak için rongeurs kullanın. Daha sonra, bir spatulanın düz bıçağını kafatasının alt kısmı ile beynin arka ventral yüzeyi arasına yerleştirin ve bıçağı hafifçe ileri doğru iterek beyni kafatasından ayırın ve beyni kafatasından kaldırın.

Beyni sırt yüzeyine yerleştirin. Beyinciğin önündeki hipotalamusu tanımlayın ve beyni hipotalamusun arka ucunun önünde ve ayrıca ön ucun arkasında koronal olarak kesin. Bilateral amigdala'yı, hipotalamusun hemen yanındaki temporal lobların altında iki küçük küre olarak tanımlayın.

Daha sonra beyni, sırt yüzeyi deneyciden uzakta olacak şekilde ön ucunda düz bir şekilde çevirin. Daha sonra, yarım küreleri ayırın ve korteksi sürekli amigdaladan çıkarın. Amigdala ortaya çıktığında, amigdalayı bir neşter ile kesin.

Bazolateral ve merkezi medial kısımları ayırmak için amigdala boyunca uzanan koyu renkli sütür boyunca kesin ve ardından iki parçayı buz üzerinde ayrı etiketli tüplere yerleştirin. Enzimlerin bozulmasını önlemek için bu adımın mümkün olduğunca hızlı yapılması gerekir. Diseksiyon prosedürünü diğer yarım küre ile tekrarladıktan sonra, dört şişeyi de bir dakika boyunca sıvı nitrojene batırın ve ardından negatif 80 derece Santigrat dondurucuda saklayın.

Buz üzerindeki her beş ila 10 miligram numuneye 150 mikrolitre lizis tamponu ekleyerek başlayın. Her numuneyi beş saniye boyunca maksimum yoğunlukta buz üzerinde sonikasyon. Daha sonra 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın.

Kuluçka sırasında, numuneyi her beş dakikada bir beş saniye boyunca girdaplayın. Ardından, numuneleri dönüşümlü olarak sıvı nitrojen içine ve 37 derece Santigrat'a ayarlanmış termostatik olarak kontrol edilen bir ısıtma plakasına yerleştirerek üç donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin. Son dondurma çözülme döngüsünden sonra, doku örneklerini 1300 Gs'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Yazılı protokoldeki talimatlara göre proteini kantitatif ettikten sonra, 0.8 mikrolitre 10 milimolar Ac-DEVD-AMC içeren bir reaksiyon tüpüne 25 mikrogram protein ekleyin ve 200 mikrolitrelik bir son hacim için reaksiyon tamponu ekleyin. Negatif reaksiyon örnekleri için, 25 mikrogram proteini bir mikrolitre 800 mikromolar Ac-DEVD-CHO ve 0.8 mikrolitre 10 milimolar Ac-DEVD-AMC ile birleştirin.

Tüm numuneleri ve kontrolleri karanlıkta 37 santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi geçtikten sonra, her numunede pH 10'da 600 mikrolitre 0.4 molar glisin ve 0.4 molar sodyum hidroksit ile reaksiyonu durdurun ve kontrol edin. Bir cam küvetteki her reaksiyona iki mililitre damıtılmış su ekleyin.

Spektroflorometri ile floresanı ölçün. Her saniye bir okuma ile 10 saniye boyunca kontrolleri ve örnekleri okuyun. Son olarak, şu anda ekranda gösterilen formüle göre her numunedeki belirli aktiviteyi ölçün.

Bu histogram, miyokard enfarktüsü geçirmiş sıçanların amigdalasındaki kaspaz-3 aktivitesini gösterir. Veriler, sahte kontrollerdeki ortalama aktivite yüzdesi olarak ifade edilir% 100'e ayarlanırHer grup sekiz sıçandan oluşuyordu. Yıldız işareti, p değeri 0.05'ten küçük olan gruplar arasında anlamlı bir fark olduğunu gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, miyokard enfarktüsü ameliyatı ile doku örneklemesi arasındaki aralık hariç yedi saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir sıçanda miyokard enfarktüsünün nasıl indükleneceğini ve spektroflorometri kullanarak sıçan amigdalasındaki kaspaz-3 aktivitesini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamalısınız.