Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Bu prosedürün genel amacı, miyokard enfarktüsü sonrası sıçan amigdalasındaki caspase-3 aktivitesini spektroflorometre kullanarak ölçmektir. Bu yöntem; miyokard enfarktüsünün bilişsel performans, ruh sağlığı, yaşlanma süreci ve uyku üzerindeki etkileri gibi davranışsal sinirbilim alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı basit, hızlı ve güvenilir olmasıdır.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, cerrahi işlem ve doku örneklemesi için gereken el becerisi nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Prosedürü, laboratuvarımızdaki araştırma görevlisi Kim Gilbert gerçekleştirecektir. Onaylanmış kurumsal protokollere göre anestezi uyguladıktan sonra, pati sıkıştırma refleksinin yokluğu aracılığıyla uygun anestezi seviyesini doğrulayın.

Sırtüstü yatış pozisyonundaki (ventral decubitus) hayvanın vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için bir ısıtıcı ped üzerine yerleştirin ve endotracheal tüp ile entübe edin. Endotracheal tüpü, %2 isofluorane veren bir anestezi cihazına bağlayın. Ardından, cerrahi bölgeyi klorheksidin glukonat ve izopropil alkol ile hazırlayın.

Kuruluğu önlemek için her iki göze oftalmik pomad uygulayın. Cerrahi bölge çevresinde steril bir alan oluşturmak için hayvanın üzerine steril bir örtü yerleştirin. Gerekli steril cerrahi aletleri, hayvanın yanındaki başka bir steril alana yerleştirin.

Ardından, 10 numara bistüri ucu veya makasla cildi kesin. Kas dokusunu soyup ayırmak için makas veya hemostatik klemps kullanın. Daha sonra, torasik duvarı açmak ve göğüs ekartörünü yerleştirmek için makas veya hemostatik klemps kullanın ve perikardiyumu hemostatik klemps ile açın.

Koroner oklüzyonu indüklemek için, önce 360 milimetre uzunluğundaki dört sıfır ipek sütürü descending koroner arterin etrafından ve bitişik miyokard dokusunun içinden geçirin. İpek sütürün her iki ucunu 14 gauge 1,25 santimetre uzunluğundaki plastik bir tüpe yerleştirin. İpek sütürün her iki ucunu çekin ve arteri tıkamak için tüpü arterin üzerine doğru bastırın.

Hemostatik klemple plastik tüpü sıkarak oklüzyonu sağlayın ve oklüzyonu 40 dakika boyunca sürdürün. 40 dakika sonra, hemostatik klempi, ardından esnek tüpü ve ipek süturu çıkararak oklüzyonu serbest bırakın. Toraksı iki sıfır sütur ile kapatın, toraks boşluğundan esnek bir kateter yerleştirin ve pnömotoraksı önlemek için 10 mililitrelik bir şırınga ile torakstan havayı çekin.

Kası 4-0 ipek sütürle, cildi ise 3-0 ipek sütürle dikin. Son cilt sütürünü kapatmadan önce, 10 mL şırınga ve kateter kullanarak torakstaki havayı tekrar dışarı çekin. Cilt kapatma işlemini tamamlayın ve ardından izofluranı durdurun.

Sıçanı temiz bir kafese yerleştirin ve anesteziden uyanma sürecini izleyin. Her sekiz saatte bir tekrarlanan dozlarla analjezik uygulayın. Hayvanı onaylanmış prosedürlere uygun olarak insancıl yöntemlerle gıyotinle kestikten sonra, sıçanın başını kırık buz üzerine yerleştirilmiş bir çanağa koyun.

Kafatasını açmak için makas kullanın. Ardından, alttaki dokuyu zedelemeden kemik kılıfları yukarı doğru çekerek ayırmak için kemik penseleri (rongeur) kullanın. Daha sonra, bir spatulanın düz ucunu kafatasının tabanı ile beynin posterior ventral yüzeyi arasına yerleştirin ve spatulayı nazikçe ileri doğru iterek beyni kafatasından ayırıp dışarı çıkarın.

Beyni dorsal yüzeyi üzerine yerleştirin. Serebellumun ön kısmındaki hipotalamusu belirleyin ve beyni, hipotalamusun posterior ucunun önünden ve anterior ucunun arkasından koronal olarak kesin. Hipotalamusun hemen yanındaki temporal lobların altında bulunan iki küçük küre şeklinde bilateral amigdalayı tanımlayın.

Ardından beyni, dorsal yüzey deneyciden uzak kalacak şekilde frontal ucundan üzerine gelecek şekilde çevirin. Sonra hemisferleri ayırın ve korteksi sürekli amigdaladan çıkarın. Amigdala ortaya çıktığında, bir bistüri ile amigdalayı kesin.

Bazolateral ve merkezi medial kısımları ayırmak için amigdalayı boydan boya geçen koyu renkli dikiş hattı boyunca kesin ve ardından iki kısmı buz üzerinde ayrı etiketli tüplere yerleştirin. Enzimlerin bozulmasını önlemek için bu adım mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilmelidir. Diseksiyon prosedürü diğer hemisfer için de tekrarlandıktan sonra, dört tüpün tamamını bir dakika boyunca sıvı azota daldırın ve ardından -80 °C dondurucuda saklayın.

Buz üzerinde, her 5 ila 10 miligram örneğe 150 µL lizis tamponu ekleyerek başlayın. Her örneği buz üzerinde, maksimum şiddette beş saniye boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, örneği her beş dakikada bir beş saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, örnekleri sırasıyla sıvı azota ve 37 °C'ye ayarlanmış termostatik kontrollü bir ısıtma plakasına yerleştirerek üç dondurma-çözme döngüsü gerçekleştirin. Son dondurma-çözme döngüsünden sonra, doku örneklerini 4 °C'de 10 dakika boyunca 1300 Gs hızında santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantı dikkatlice aspire edin ve buz üzerinde taze bir tüpe aktarın. Yazılı protokoldeki talimatlara göre protein miktarı belirlendikten sonra, 0,8 microliter 10 millimolar Ac-DEVD-AMC ve reaksiyon tamponu içeren bir reaksiyon tüpüne, toplam hacim 200 microliters olacak şekilde 25 micrograms protein ekleyin. Negatif reaksiyon örnekleri için, 25 micrograms proteini bir microliter 800 micromolar Ac-DEVD-CHO ve 0,8 microliters 10 millimolar Ac-DEVD-AMC ile birleştirin.

Tüm örnekleri ve kontrolleri karanlıkta, 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, her bir örnek ve kontrole 600 µL pH 10'da 0,4 M glisin ve 0,4 M sodyum hidroksit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Cam bir küvetteki her bir reaksiyona iki mL distile su ekleyin.

Spektroflorometre ile floresansı miktarlandırın. Kontrolleri ve örnekleri, her saniye bir okuma yapacak şekilde 10 saniye boyunca okuyun. Son olarak, ekranda gösterilen formüle göre her örnekteki spesifik aktiviteyi miktarlandırın.

Bu histogram, miyokard enfarktüsü geçirmiş sıçanların amigdalasındaki caspase-3 aktivitesini göstermektedir. Veriler, %100 olarak belirlenen sham kontrol grubundaki ortalama aktivitenin yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Her grup sekiz sıçandan oluşmuştur. Yıldız işareti, p değerinin 0,05'ten küçük olduğu, gruplar arası anlamlı bir farkı belirtir.

Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, miyokard enfarktüsü cerrahisi ile doku örneklemesi arasındaki süre hariç olmak üzere yedi saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir sıçanda miyokard enfarktüsü nasıl indükleneceği ve spektroflorometri kullanılarak sıçan amigdalasında caspase-3 aktivitesinin nasıl ölçüleceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.