Name: Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin, miyokard infarktüsü sonrası sıçan amigdalasında kaspaz-3 aktivitesini spektroflorometri ile ölçme yöntemini. Bu teknik davranışsal nörobilimde kardiyak olayların beyin üzerindeki etkilerini araştırmak için güvenilir bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

. Santé - Bu iş Doğa Bilimleri ve Kanada Kim Gilbert Mühendislik Araştırma Konseyi bir hibe ile desteklenen Fonds de la recherche du Québec bir öğrencilik tutar.

Hayvanlar Hayvan Bakımı Kanada Konseyi İlkelerine uygun olarak, yerel Hayvan Bakım Komitesi yönetmeliğine uygun olarak ele alınır. Sıçanlar, (21-22 ºC sıcaklık ve% 40-50 nem) ayrı ayrı sabit koşullarda muhafaza edilir 08:00 am başlayan, 12 saat karanlık-aydınlık döngüsünün dahil. Chow pelet ve musluk suyu çalışma boyunca ad libitum. Tedarikçi tarafından doğum sonrası 3 günlük bir alışma dönemi deney öncesi izin verilir. 300-800 g arasında olan erkek Sprague-Dawley sıçanları rutin olarak bu protokol ile kullanılmıştır. 1. MI Cerrahisi <ol><li> Ketamin 60 mg / kg ve ksilazin 10 mg / kg karın içinden enjeksiyonu ile anestezi neden. Pençeleri sıkışmak zaman refleksinin yokluğu ile doğru anesthetization onaylayın. </li><li> Cerrahi siteyi Tıraş. (16G 1.77 inç) kateter ve lateral dekübit pozisyonunda hayvan yerleştirin: endotrakeal tüp ile entübe sıçan. Sıcaklık yaklaşık 37 ° C tutmak için bir ısıtma pedi üzerine hayvanlar koyun. % 2 izofluran endotrakeal tüp bağlayın. </li><li> Klorheksidin glukonat ve izopropil alkol ile cerrahi siteyi hazırlayın. Ameliyat sırasında steril eldiven ve steril aletler kullanın. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için her iki göze oftalmik merhem sürün. Hayvan ve hayvan yanındaki başka bir steril alanında araçlara steril alan yerleştirin. </li><li> Neşter bıçak # 10 ile cildi İnsizyon. Hemostatik kelepçe ile kas dokusu soyulabilir. Ventral dekübit pozisyonunda hayvan yerleştirin. Hemostatik kelepçe ve pozisyon göğüs Retraktörü Açık göğüs duvarı. Hemostatik kelepçe ile Açık perikard. </li><li> Bitişik miyokard dokusu geçerek, koroner oklüzyon, döngü inen koroner arterin etrafında 360 mm uzunluğunda 4-0 ipek sütür üretmek. Bir 14G, 1,25 cm uzunluğunda plastik tüp içine ipek sütür her iki ucunu yerleştirin. </li><li> Ipek sütür ve irin iki ucunu çekinh aşağı arterin karşı tüp 40 dakika, bunu tıkanması için. Bir hemostatik kelepçe ile plastik tüp sıkma ile Güvenli tıkanıklığı. </li><li> 40 dakika sonra, esnek boru ve ipek dikiş çıkarılarak hazırlanabilir hemostatik kelepçe, serbest tarafından oklüzyonu bırakın. Not: Sham kontrol fareler aynı cerrahi prosedür eksi koroner arter tıkanıklığı uğrarlar. </li><li> Torasik duvar kapatmadan önce, pnömotoraks önlemek için 5 ml şırınga ile toraks havayı dışarı çekmek için göğüs boşluğundan esnek bir kateter (18G, 4.5 cm) yerleştirin. </li><li> Kapat toraks boşluğu 2-0 sütür ile, 4-0 ipek sütür ile kas ve 3-0 ipek sütür ile cilt dikiş. </li><li> Geçen cilt noktasını kapatmadan önce, yine göğüs boşluğuna önce yerleştirilmiş kateter ile 5 ml şırınga ile toraks havayı çizin. </li><li> Geçen cilt noktasını dikin. Izofluran havalandırma durdurun. </li><li> Sıçan uyanış izleyin. O Regaine olana kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınd yeterli bilinç sternum yatma korumak için. </li><li> Bir antibiyotik ile bir analjezik (buprenorfin, 0,05 mg / kg ip) ile 24 saat (duplocillin tek bir dozu, 0.2 mg / kg ip) için sıçana her 8 saat tedavi edin. </li><li> Ameliyattan sonra, ev fareleri tek tek, yani kurban zamanına kadar, 3 gün sonrası MI. </li><li> Enfarktüs büyüklüğü, özellikle nekroz sol ventrikülün risk altındaki alanlarda bulunan enfarktlı doku oranı olarak ifade edilir. Bu trifeniltetrazolyum renklenme 11 kullanılarak ölçülür olabilir. </li></ol> 2. Amygdala İzolasyon <ol><li> Onun burnu dar olan uç açıklığı dışarı çıkıntılı, bir koni şeklinde çanta içinde ilk hayvan kafası yerleştirin. Güvenli sıçan herhangi bir hareketi önlemek için. Makas bıçakları arasında, giyotin üzerinde uygun başını yerleştirin. Hayvan başını kesmek. </li><li> Bir tabak sıçan Yeri başkanı ezilmiş buz tuttu. Ezilmiş buz (4 ° C) doku olarak ayırma işlemleri gerçekleştirir. </li><li> Cut açık skull makasla dikkatlice yukarı çekerek ve altındaki dokuyu yaralama kaçınarak kemik rongeurs kemik kılıfları ayırmak. </li><li> Kafatasının alt ve beynin posterior ventral yüzeyi arasında bir spatula düz bıçağı yerleştirin ve dikkatlice beyin yavaşça dışarı kaldırdı olabilir kadar yavaşça kafatasının alt kısmı boyunca ileriye doğru bıçağı iterek kafatası beyin ayırmak kafatası. Kafatası atın. </li><li> Dorsal yüzeyinde beyin yerleştirin. Hipotalamus (beyincik önünde yapısını) tanımlamak ve ön ucu ve arka ucu önünde ve arkasında koronale beyin kesmek; diğer kullanımlar için gerekli değilse beynin ön ve arka bölümlerini atmak. </li><li> Hemen yanında hipotalamus, bilateral, temporal lob altında küçük küreler olarak amygdalas gözünüzde canlandırın. </li><li> Uzakta deneyci gelen, onun ön ucundaki dorsal yüzeyini beyin düz çevirin. </li><li> Beynin sol veya sağ tarafı ile başlayın. Hemi ayırınDaha sonra küreler ve mücavir amigdala gelen korteks. Amigdala izolasyonunu sağlamak için bu gevşek korteksin yolu yaklaşık 8 mm kesin. Neşter ile amigdala kesip. </li><li> Karşıya çalışan karanlık sütür, neredeyse yarı yarıya boyunca keserek kendi centromedial kısmından amigdala bazolateral kısmını ayırın. Bu yapı her zaman kolayca tanımlanabilir değildir. </li><li> Ayrı tespit şişelerde amigdala alt parçalarının koyun ve ezilmiş buz üzerinde tutmak. </li><li> Diğer yarımkürede ile tekrarlayın diseksiyon prosedürü. </li><li> 1 dakika süre ile sıvı azot içinde şişeleri bırakın. Ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C dondurucu içinde flakonu tutun. </li></ol> 3. Kaspaz-3 Aktivite <ol><li> Sukroz 0.32 M,% 1 Triton-X-100, Tris-HCI, pH 8, etilendiamintetraasetik asit 5 mM, ditiyotreitol 2 mM, fenilmetilsülfonil fluorür, 1 mM, leupeptin, 10 ug / ul 10 mM liziz tamponu , pepstatin A 10 mg / ml aprotinin, 10 ug / ml. </li><li>Her numune (5-10 mg), lizis tamponu 150 ul ekle. Buz üzerinde tutun. Maksimal şiddette (40 W) 5 saniye boyunca buz üzerinde her örnek sonikasyon. 30 dakika boyunca buz üzerinde liziz tamponunda doku inkübe edin. Vorteks 5 dakika boyunca her bir numune. </li><li> Alternatif olarak sıvı azot içinde ve 37 ° C&#39;de ayarlanmış bir termostatik olarak kontrol edilen ısıtma plakası üzerinde numuneler yerleştirilerek 3 donma / çözülme devrelerine gerçekleştirin. 13.000 g Santrifüj doku (4 10 dakika boyunca ° C). Dikkatle süpernatant kaldırmak ve buz üzerinde tüp içinde tutmak. </li><li> Büyükbaş hayvan serum albümini ile 0 ve 10 ug / ml arasında, standart protein konsantrasyonları hazırlayın. Sadece tampon maddesi ile boşlukları hazırlayın. </li><li> Her standart Bradford reaktifi 200 ul ekle. 595 nm standart okuyun. Protein seviyeleri için, damıtılmış su içinde 795 | il Bradford reaktifi 200 ul numune süpernatan 5 ul ekleyin. 595 nm&#39;de her bir örnek okuma ve standart eğri ile protein miktarı belirlenir. </li><li> 5 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCI, pH 7, &lt;reaksiyon tamponu hazırlayın/ sub&gt;, etilen glikol tetraasetik asit, 1 mM, 3-kolamidopropil% 0.1) dimetilamonyo] -1-propansülfonat ve ditiotreitol, 1 mM. </li><li> Pozitif ve negatif reaktif örnekleri elde etmek reaksiyon tamponu ve kaspaz-3 yüzeylerde proteinin 25 ug ekleyin. Negatif numuneler için, proteinin 25 ug, Ac-DEVD-CHO 800 uM 0.4 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM 0,8 ul reaksiyon tamponu ilave edin. Pozitif örnekler için, reaksiyon tamponu proteinin 25 ug ve Ac-DEVD-AMC 10 mM 0,8 ul ekle. Üç nüsha halinde tüm negatif ve pozitif örnekleri işleyin. Reaksiyon tamponu ilave edilerek 200 ul kadar Her numunenin son hacim tamamlanması. </li><li> Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0.5 ul, 0.8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM liziz tamponu 10 ul reaksiyon tampon maddesi 188,7 ul ekleyerek negatif kontrolleri üretir. Pozitif kontroller için, reaksiyon tamponu 189.2 ul, Ac-DEVD-AMC 10 mM, 0.8 ul lizis tamponu 10 ul ekle. </li><li> Örnekleri inkübe ve37 O ° C&#39;de 3 saat süreyle karanlıkta kontroller </li><li> Her bir numune ve kontrol 600 ul 0.4 M glisin ve NaOH 0.4 M (pH 10) ile reaksiyonu durdurun. </li><li> 465 nm, 365 nm ve emisyon dalga uyarma dalga boyunda spectrofluorometry ile floresan ölçmek. Bir cam küvet içinde reaksiyona damıtık su 2 ml ilave edilir. Her saniyede 1 puan 10 saniye boyunca kontrolleri ve numuneleri okuyun. </li><li> Her bir örnekte spesifik aktivitesi niceliğini: ((negatif numuneler eksi pozitif örneklerin floresan) 2,8 ml x hacim floresan) (Protein 25 mg inkübasyon 3 saat x miktarı zaman) bölünmesidir. </li></ol>

<ol><li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+keys+in+the+ignition+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li>
<li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors%3A+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li>
<li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRousseau%2C+G+%22Novel+Strategies+in+Ischemic+Heart+Disease+%22">Novel Strategies in Ischemic Heart Disease </a>. Lakshmanadoss, U. , 333-362 (2012).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li>
<li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li>
<li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li>
<li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li>
<li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li>
<li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D1%2C+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid%2C+decreases+post-myocardial+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction%3A+effects+of+sertraline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, Oxford, England. 451-459 (2009).</li>
<li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+re-visited%3A+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%3A+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li>
<li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Killing+the+blues%27%3A+a+role+for+cellular+suicide+%28apoptosis%29+in+depression+and+the+antidepressant+response%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+paper+wraps+stone+blunts+scissors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Son 10 yılda bu protokol ile Deneyimlerimiz kritik metodolojik konular belirlenmesine yol açmıştır. İlk olarak, kırılmış buz üzerine bir petri çanağına hızlı beyin diseksiyon hazırlanması kalitesini muhafaza etmek önemlidir. İkinci olarak, doku sonication, diğer kalp (10 saniye) ve dokuların türleri veya böbreklerin (20 saniye) ile karşılaştırıldığında, serebral amigdala daha kısa olduğunu fark edilmelidir. Üçüncü olarak, büyük bir özenle dikkatle örnekleri eklemeden önce alt tabakayı karıştırmak için alınmalıdır. Karıştırma dizisi yetersiz Biz ne zaman değişken sinyaller karşılaştık. Örnekleri okurken Dördüncü olarak, kabarcıklar, kuvars hücrede mevcut olması gerekmektedir. Aksi takdirde, bir sinyal değiştirilebilir. 1 ul daha az hacim önlemek için alt tabaka hacminin artırılması: Biz sonuçların tekrarlanabilirliği artırmak için son yıllarda bir değişiklik yaptı. Yine, küçük varyasyonları izleyen tahliller arasında meydana gelebilecek, ve en az 3 kontrol numuneleri için kullanılmalıdırvaryasyonlar için kontrolü. Bu kontrollerin Floresan tedbirleri ortalaması alınır ve ortalama% 100 olarak belirlenmiştir. Deneysel örneklerde Floresan tedbirleri kontrol numunelerinin yüzde dönüşür. Tekniğin bir başka sınırlama, bu nedenle kaspaz-3 aktivitesi göz ardı edilebilir, doku sadece bir kısmı kullanıldığı ve. Nitekim, apoptoz zaman penceresi herhangi bir hücrede kısa ve 1,4,15 örnekleme sırasında komşu bölgelerde oluşuyor olsa bile kaçırmış. Bunun tam tersi de mümkündür: apoptoz kaspaz-3 aktivitesi olduğundan fazla tahmin sonuçlanan doku bölümleri, özellikle yoğun olabilir. Biz böyle TÜNEL deneyleri veya Bax / Bcl2 oranı (bkz) gibi tamamlayıcı teknikler, kalan dokuların (amigdala) kullanmanızı tavsiye ederiz. Spectrofluorometry Western blot üzerinde, en azından iki avantajı vardır. Birincisi, doğrudan nicel veri üretir. İkincisi, bu enzimatik a ölçerctivity kendisi yerine ilgisiz olabilir, ve protein ifadesi enzimatik etkinlikteki herhangi bir değişiklik olmadan arttırılabilir bilinmektedir proteini veya RNA ekspresyon. Ayrıca, spectrofluorometry diğer dokularda veya farklı hayvan türleri ile yapılabilir ve farklı alt-tabakalar ile ve diğer kaspaz alt-tipleri için ayarlanabilir, böylece güvenli bir karşılaştırma yapılabilir. Sonuç olarak, bu belgenin o apoptoz 3 gün MI sonrası limbik sistemin bu bölgede meydana kanıt sağlama, amigdala kaspaz-3 aktivitesini ölçmek için spectrofluorometry kullanımını gösterir.

Kaspazlar ya Sistein bağımlı aspartat yönelik proteazlar çeşitli homeostazı süreçlerini 1 katılan bir enzim ailesidir. Kaspazlar geniş apoptosis veya inflamasyon kendi rollerine göre sınıflandırılabilir. Kaspaz-1, -4, -5 ve -12 apoptosis uğraşanların olabilir oysa inflamasyon katılan alt sınıflandırılmış başlatıcı kaspazlara olarak (kaspaz-8 ve -9) ve cellat kaspazlar (kaspaz-3, -6 -7 ve ). Miyokard enfarktüsü (MI) veya serebral iskeminin ardından gözlemlenen Kaspazlar, esas olarak apoptoz fazla olabilir hastalıklarda çok patolojilerin önemli rol oynar. Bizim laboratuvarda kullanılan post-MI sendromunun sıçan modelinde, bu kaspaz-3 miyokardın 2 değil, aynı zamanda ruh ve duyguların 3-6 kontrolünde karıştığı limbik sistemde sadece etkin olduğunu kurulmuştur. Ayrıca, kaspaz-3, farklı bölgelerde aktif olduğu görülmektedirlimbik sistemin, bu tür amigdala ve hipokampus ve iskemik hakaret 4 sonra 3 gün etrafında bu aktivasyon zirveleri olarak. İlginçtir, kaspaz-3 aktivitesi post-MI davranış bozuklukları ile ilişkilidir ve farmakolojik ve beslenme müdahaleler yoluyla zayıflama kaspaz-3 ve post-MI depresyon 7-12 arasındaki olası bağlantıyı düşündüren, bu yaralanmaları azaltır. Kaspaz-3 aktivasyonu, çeşitli teknikler ile ölçülebilir. Western blotting kaspaz enzimatik özellikleri tespit eder ve aktif enzimler olarak pro-enzim biçimleri algılayabilir. Western lekeleme, ancak yarı-kantitatif ve küçük varyasyonlar, zayıf sinyal-ses oranlarına 13 ile kaybolabilir. Daha iyi bir teknik, bir florojenik bileşiği serbest bırakır ve spectrofluorometry ölçülebilir kaspaz-3, bir alt-tabaka (DEVD-AMC) bölünmesine dayanmaktadır. Kaspaz-3 aktivasyon apoptoz güvenilir bir göstergesidir. Apoptoz ca ölçümün oluşma zaman penceresi kısa olduğu için kararsız ve komşu hücrelerin apoptotik organları veya hücreleri 14 fagosite olabilir. Apoptosis ayrıca, Bax / olarak apoptotik sinyal silsileleri 6, ya da anti-apoptotik / pro protein oranı, elde edilen DNA parçalanmasını algıladığı, örneğin terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç işaretleme analizi (TÜNEL) deneyi gibi diğer teknikler tarafından teyit edilebilir Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spektroflurometre</td><td>Foton teknolojisi Enstrüman (şimdi Horiba)</td><td>DeltaRAM ile Ratiomaster M-40</td><td>&nbsp; Rastgele Erişim Monokromatörü&nbsp;</td></tr><tr><td>Solunum cihazı</td><td>Harvard aparatı</td><td>683</td><td>küçük hayvan havalandırma</td></tr><tr><td>Cam küvet</td><td>NSG hassas hücreler</td><td>3G10</td><td>Optik Cam (340-2.500 nm) 10 mm yol</td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Cole Parmer</td><td>4710 ve nbsp; serisi</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometre</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

miyokard İnfarktüsü sonrası spectrofluorometry tarafından ölçülen sıçan amigdala kaspaz-3 etkinlik

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Miyokard infarktüsü (Mİ) fizyolojik ve davranışsal düzeyde dramatik orta ve uzun vadeli sonuçları vardır, ancak ilgili mekanizmalar hala belirsizdir. Laboratuvarımız bozulmuş kardiyak fonksiyonları, limbik sistemde nöronal kayıp, bilişsel açıkları ve depresyon belirtileri gösterir davranışsal post-MI sendromu sıçan modeli geliştirmiştir. Post-MI 3 gün zirve - nöronal düzeyde, kaspaz-3 aktivasyonu gibi amigdala gibi farklı limbik bölgelerde, post-MI apoptozu aracılık eder. Bilişsel ve davranışsal bozukluklar 2-3 haftalar sonrası MI görünür ve bu kaspaz-3 aktivitesi önlemleri ile istatistiksel korelasyon. Burada açıklanan protokol, MI neden amigdala doku toplamak ve spectrofluorometry kullanarak kaspaz-3 aktivitesini ölçmek için kullanılır. MI teşvik etmek için, inen koroner arter 40 dakika tıkanır. Sıçanlar kurban edilir ve amigdala rapi izole: kaspaz-3 aktivasyonu değerlendirilmesi için protokol 3 gün MI sonra başlarbeyin GEC. Numuneler hızlı bir şekilde sıvı azot içinde donduruldu ve gerçek analiz kadar -80 ° C&#39;de tutulur. Kaspaz-3 aktivasyonunu değerlendirmek için tekniklerin spectrofluorometry ile ölçülebilir bir flüorojenik bileşiği serbest kaspaz-3, bir alt-tabaka (DEVD-AMC) bölünmesine dayanmaktadır. Yöntem niceliksel ve tekrarlanabilir ama gerektiren ekipman pahalıdır ve numune ölçülmesi için prosedür, zaman alıcıdır. Bu teknik, kalp ve böbrek gibi diğer dokuların, tatbik edilebilir. DEVD-AMC için diğer kaspaz aktivitesini ölçmek için diğer substratlar ile ikame edilmiş olabilir.

Amigdala 8 sham (kontrol) ve üç gün iskemi / reperfüzyon protokolü indüksiyonundan sonra 8 MI sıçanlarda izole edildi. Kaspaz-3 aktivitesi, aktif kaspaz-3 ile ayrıldı ve spectrofluorometry ile tespit edilebilir bir florokrom ile bu dokuda ölçülmüştür. Pozitif ve negatif ölçümler (adımları 3.11, 3.12 ve 3.16 bakınız) her saniyede 1 puan, 10 saniye boyunca üç nüsha olarak gerçekleştirilen ve ölçüldü. Pozitif ve negatif kontroller arasındaki fark hesaplanır ve bu deney sırasında gerçekleştirilen tüm sahte doku farkların ortalaması% 100 olarak ayarlandı. MI sıçanlardan sonuçları bu referansa göre ölçeklenmiştir ve Şekil 1 nihai sonuçları göstermektedir: bu sham (p &lt;0.05) ile karşılaştırıldığında MI farelerde önemli ölçüde daha yüksek etkin olduğunu gösterir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Şekil 1. Kaspaz-3MI sıçanların amigdala aktivite,% 100 (grup başına 8 sıçan) olarak ayarlanır, sahte kontrol grubunda ortalama aktivite yüzdesi olarak ifade edilir. * Anlamlı gruplar arası fark (p &lt;0.05) gösterir. Veri, ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir.

Miyokard enfarktüsü (MI) sadece bozulmuş kardiyak fonksiyon tarafından değil, aynı zamanda MI'nın davranışsal sonuçlarında yer alan bir beyin bölgesi olan amigdalada apoptoz ile de takip edilir. Bu protokol, MI'nın nasıl indükleneceğini, amigdala dokusunun nasıl toplanacağını ve burada bir apoptoz belirteci olan kaspaz-3 aktivitesinin nasıl ölçüleceğini açıklar.

Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Bu prosedürün genel amacı, miyokard enfarktüsü sonrası sıçan amigdalasındaki caspase-3 aktivitesini spektroflorometre kullanarak ölçmektir. Bu yöntem; miyokard enfarktüsünün bilişsel performans, ruh sağlığı, yaşlanma süreci ve uyku üzerindeki etkileri gibi davranışsal sinirbilim alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı basit, hızlı ve güvenilir olmasıdır.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, cerrahi işlem ve doku örneklemesi için gereken el becerisi nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Prosedürü, laboratuvarımızdaki araştırma görevlisi Kim Gilbert gerçekleştirecektir. Onaylanmış kurumsal protokollere göre anestezi uyguladıktan sonra, pati sıkıştırma refleksinin yokluğu aracılığıyla uygun anestezi seviyesini doğrulayın.Sırtüstü yatış pozisyonundaki (ventral decubitus) hayvanın vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için bir ısıtıcı ped üzerine yerleştirin ve endotracheal tüp ile entübe edin. Endotracheal tüpü, %2 isofluorane veren bir anestezi cihazına bağlayın. Ardından, cerrahi bölgeyi klorheksidin glukonat ve izopropil alkol ile hazırlayın.Kuruluğu önlemek için her iki göze oftalmik pomad uygulayın. Cerrahi bölge çevresinde steril bir alan oluşturmak için hayvanın üzerine steril bir örtü yerleştirin. Gerekli steril cerrahi aletleri, hayvanın yanındaki başka bir steril alana yerleştirin.Ardından, 10 numara bistüri ucu veya makasla cildi kesin. Kas dokusunu soyup ayırmak için makas veya hemostatik klemps kullanın. Daha sonra, torasik duvarı açmak ve göğüs ekartörünü yerleştirmek için makas veya hemostatik klemps kullanın ve perikardiyumu hemostatik klemps ile açın.Koroner oklüzyonu indüklemek için, önce 360 milimetre uzunluğundaki dört sıfır ipek sütürü descending koroner arterin etrafından ve bitişik miyokard dokusunun içinden geçirin. İpek sütürün her iki ucunu 14 gauge 1,25 santimetre uzunluğundaki plastik bir tüpe yerleştirin. İpek sütürün her iki ucunu çekin ve arteri tıkamak için tüpü arterin üzerine doğru bastırın.Hemostatik klemple plastik tüpü sıkarak oklüzyonu sağlayın ve oklüzyonu 40 dakika boyunca sürdürün. 40 dakika sonra, hemostatik klempi, ardından esnek tüpü ve ipek süturu çıkararak oklüzyonu serbest bırakın. Toraksı iki sıfır sütur ile kapatın, toraks boşluğundan esnek bir kateter yerleştirin ve pnömotoraksı önlemek için 10 mililitrelik bir şırınga ile torakstan havayı çekin.Kası 4-0 ipek sütürle, cildi ise 3-0 ipek sütürle dikin. Son cilt sütürünü kapatmadan önce, 10 mL şırınga ve kateter kullanarak torakstaki havayı tekrar dışarı çekin. Cilt kapatma işlemini tamamlayın ve ardından izofluranı durdurun.Sıçanı temiz bir kafese yerleştirin ve anesteziden uyanma sürecini izleyin. Her sekiz saatte bir tekrarlanan dozlarla analjezik uygulayın. Hayvanı onaylanmış prosedürlere uygun olarak insancıl yöntemlerle gıyotinle kestikten sonra, sıçanın başını kırık buz üzerine yerleştirilmiş bir çanağa koyun.Kafatasını açmak için makas kullanın. Ardından, alttaki dokuyu zedelemeden kemik kılıfları yukarı doğru çekerek ayırmak için kemik penseleri (rongeur) kullanın. Daha sonra, bir spatulanın düz ucunu kafatasının tabanı ile beynin posterior ventral yüzeyi arasına yerleştirin ve spatulayı nazikçe ileri doğru iterek beyni kafatasından ayırıp dışarı çıkarın.Beyni dorsal yüzeyi üzerine yerleştirin. Serebellumun ön kısmındaki hipotalamusu belirleyin ve beyni, hipotalamusun posterior ucunun önünden ve anterior ucunun arkasından koronal olarak kesin. Hipotalamusun hemen yanındaki temporal lobların altında bulunan iki küçük küre şeklinde bilateral amigdalayı tanımlayın.Ardından beyni, dorsal yüzey deneyciden uzak kalacak şekilde frontal ucundan üzerine gelecek şekilde çevirin. Sonra hemisferleri ayırın ve korteksi sürekli amigdaladan çıkarın. Amigdala ortaya çıktığında, bir bistüri ile amigdalayı kesin.Bazolateral ve merkezi medial kısımları ayırmak için amigdalayı boydan boya geçen koyu renkli dikiş hattı boyunca kesin ve ardından iki kısmı buz üzerinde ayrı etiketli tüplere yerleştirin. Enzimlerin bozulmasını önlemek için bu adım mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilmelidir. Diseksiyon prosedürü diğer hemisfer için de tekrarlandıktan sonra, dört tüpün tamamını bir dakika boyunca sıvı azota daldırın ve ardından -80 °C dondurucuda saklayın.Buz üzerinde, her 5 ila 10 miligram örneğe 150 µL lizis tamponu ekleyerek başlayın. Her örneği buz üzerinde, maksimum şiddette beş saniye boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.İnkübasyon sırasında, örneği her beş dakikada bir beş saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, örnekleri sırasıyla sıvı azota ve 37 °C'ye ayarlanmış termostatik kontrollü bir ısıtma plakasına yerleştirerek üç dondurma-çözme döngüsü gerçekleştirin. Son dondurma-çözme döngüsünden sonra, doku örneklerini 4 °C'de 10 dakika boyunca 1300 Gs hızında santrifüjleyin.Ardından, süpernatantı dikkatlice aspire edin ve buz üzerinde taze bir tüpe aktarın. Yazılı protokoldeki talimatlara göre protein miktarı belirlendikten sonra, 0,8 microliter 10 millimolar Ac-DEVD-AMC ve reaksiyon tamponu içeren bir reaksiyon tüpüne, toplam hacim 200 microliters olacak şekilde 25 micrograms protein ekleyin. Negatif reaksiyon örnekleri için, 25 micrograms proteini bir microliter 800 micromolar Ac-DEVD-CHO ve 0,8 microliters 10 millimolar Ac-DEVD-AMC ile birleştirin.Tüm örnekleri ve kontrolleri karanlıkta, 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, her bir örnek ve kontrole 600 µL pH 10'da 0,4 M glisin ve 0,4 M sodyum hidroksit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Cam bir küvetteki her bir reaksiyona iki mL distile su ekleyin.Spektroflorometre ile floresansı miktarlandırın. Kontrolleri ve örnekleri, her saniye bir okuma yapacak şekilde 10 saniye boyunca okuyun. Son olarak, ekranda gösterilen formüle göre her örnekteki spesifik aktiviteyi miktarlandırın.Bu histogram, miyokard enfarktüsü geçirmiş sıçanların amigdalasındaki caspase-3 aktivitesini göstermektedir. Veriler, %100 olarak belirlenen sham kontrol grubundaki ortalama aktivitenin yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Her grup sekiz sıçandan oluşmuştur. Yıldız işareti, p değerinin 0,05'ten küçük olduğu, gruplar arası anlamlı bir farkı belirtir.Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, miyokard enfarktüsü cerrahisi ile doku örneklemesi arasındaki süre hariç olmak üzere yedi saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir sıçanda miyokard enfarktüsü nasıl indükleneceği ve spektroflorometri kullanılarak sıçan amigdalasında caspase-3 aktivitesinin nasıl ölçüleceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Akut miyokard infarktüsü (AMI) sıçan modelinde kalp patofizyolojik ve fizyolojik fonksiyonu MI sonucu incelemek için yararlıdır.

Sıçanlarda Akut Miyokard Enfarktüsü

Bu video, florojenik bir peptit testi kullanılarak korku koşullandırılmış ve kontrol sıçan beyinlerinden lateral amigdalanın farklı hücre altı bölmelerindeki proteazom aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstermektedir. Proteazom, florojenik peptit substratını parçalayarak, nükleer ve sinaptik protein fraksiyonlarındaki proteazom aktivitesini değerlendirmek için bir plaka okuyucu kullanılarak nicelleştirilen floresan molekülleri serbest bırakır. Artan nükleer aktivite, gen ekspresyonundaki...

Sıçan Beyninin Farklı Hücre Altı Bölmelerinde Proteazom Aktivitesinin Ölçülmesi

Sıçan kalbinin miyokard iskemi-reperfüzyon modeli, kendi kendine yapılan bir retraktör, polivinil klorür tüpü ve benzersiz bir düğümleme yöntemi kullanılarak geliştirilmiştir. Elektrokardiyogram, trifeniltetrazolyum klorür ve histolojik boyama ve yüzde sağkalım analizi sonuçları, geliştirilmiş model grubunun mevcut model grubundan daha yüksek başarı ve sağkalım oranlarına sahip olduğunu göstermiştir.

Miyokard İskemisi ve Reperfüzyon Hasarının Geliştirilmiş Kemirgen Modeli

Sıçan in vivo modelleri, iskemik inme için patolojik mekanizmaları ve terapötik hedefleri araştırmak için vazgeçilmez araçlardır. Bu çalışma, sıçanlarda orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) takiben enfarktüslü beyin dilimlerinde immünofloresan boyama gerçekleştirmeyi açıklayacaktır.

İskemik İnmenin Sıçan Modelinde İmmünofloresan ile Hücre Ölümü Sinyalinin Değerlendirilmesi

Reperfüze akut miyokard enfarktüsünde (repAMI) kardiyak hasarın üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu, ilişkili hastalığı etkileyen paternlerin aslına uygun olarak ölçülmesini ve birlikte lokalizasyonunu sağlar. Burada, kardiyak hasarın, risk altındaki alanın ve bağışıklık hücresi tepkisinin eşzamanlı ölçümü için otomatikleştirilebilir bir ışık tabakası kılavuzluğunda görüntüleme yaklaşımı sağlanmıştır.

Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Reperfüze Akut Miyokard Enfarktüsünde Kardiyak Hasar ve İmmün Yanıtın Eşzamanlı 3D Analizi

Sıçan iskemik beyin hasarı Cerrahi indüksiyon inme araştırma için yaygın olarak kullanılan bir model. Burada orta serebral arter oklüzyonu ile fokal serebral iskemi indüksiyon göstermektedir. Histolojik boyama ve manyetik rezonans görüntüleme ile enfarkt Görselleştirme de gösterilir.

Endovasküler Dikiş Rat Orta Serebral Arter Tıkanıklığı Fokal Serebral İskemi Model

Bu protokol ile fare retina eksplant elektroporasyon yaşayan cis-düzenleyici unsurlar (yani artırıcı / rehberleri) aktivitesini ölçmek için basit ve ucuz bir şekilde açıklamaktadır. DNA hazırlığı, retina diseksiyonu, elektroporasyon, retina eksplant kültür ve fiksasyonu sonrası analizi ve ölçülmesi açıklanmıştır.

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme...

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Biz omurgasız koku yolunun ilk üç aşamada koku-uyarılmış yanıtlar karakterize etmek ekstraselüler çoklu ünite kayıt tekniği varyasyonları göstermektedir. Bu teknikler kolayca başka sinir sistemlerinin topluluk etkinliği incelemek için adapte edilebilir.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Derin Beyin Stimülasyonu (DBS) cerrahisinin terapötik etkilerinin altında yatan mekanizmanın araştırılması gerekiyor. Bu yazıda sunulan yöntemler, DBS cerrahisi sonrası nörojenezi kolaylaştırabilecek aday genlerin gen ekspresyon profilini analiz ederek DBS tarafından tetiklenen hücresel olayları incelemek için deneysel bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

Öğrenin, miyokard infarktüsü sonrası sıçan amigdalasında kaspaz-3 aktivitesini spektroflorometri ile ölçme yöntemini. Bu teknik davranışsal nörobilimde kardiyak olayların beyin üzerindeki etkilerini araştırmak için güvenilir bir temel sunar.

Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Daha fazla video keşfet