Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Prosedürün genel amacı, spesifik antikorlara veya transgenik suşlara ihtiyaç duymadan, bir dizi düşük hızlı santrifüj ve filtrasyon işlemi kullanarak, yapısal bütünlüğünü koruyarak fare beyninin vasküler kompartmanını saflaştırmaktır. Kan-beyin bariyerinin hücresel, moleküler ve farmakolojik incelemelerine olanak tanıyan teknikler geliştirmek için birçok çalışma yapılmıştır. Ayırma, gradyanlar, kolonlar veya yüksek hızlı santrifüj adımlarının olmaması, bu prosedürle beyin damarlarının saflaştırılmasını oldukça kolay, hızlı ve ucuz hale getirmektedir.

Beyin damarları, endotel hücreleri sıkı bağlantılarla mühürlenmiş haldeyken; bazal laminar yapılar, vasküler düz kas hücreleri ve perivasküler astrosit membranları ile çevrelenmiş şekilde yapısal olarak bozulmadan kalacaktır. Bu protokol, kan-beyin bariyeri vasküler kompartmanının fonksiyonuna ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve prosedürün uygulanışını gösteren Martin Coen S ekibinden bir doktora sonrası araştırmacı aracılığıyla moleküler kompozisyonunun incelenmesine olanak tanır. İşleme başlamadan önce, filtre tutucunun üstten vidalı kısmının altını kesin.

Ardından, bir bistüri kullanarak farenin boynundan burnuna kadar deriyi kesin ve deriyi geriye doğru çekin. Kontamine olmuş kılları temizlemek için kafatasını PBS ile yıkayın ve ardından olfaktör bulbların ön kısmından kafatasına bir makas yerleştirin. Kafatasını parçalara ayırmak için makası açın ve beyni spatula ile çıkarın.

Ardından, koroid pleksusu lateral ventriküllerden çıkarın ve beyni, buz üzerinde 20 mililitre B one çözeltisi içeren 150 mililitrelik bir behere aktarın. Daha sonra, beyni iki skalpel kullanarak 2 milimetre boyutunda doku parçaları haline gelecek şekilde kuvvetlice doğrayın ve dokuyu buz üzerinde 400 RPM hızında 20 darbe boyunca otomatik bir homojenizatör ile homojenize edin. Damarları saflaştırmak için homojenatı 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve doku süspansiyonunu santrifüjleyin.

Sallanan rotorlu bir santrifüjde, kabın pelletinin üst kısmında çoğunlukla miyelinden oluşan büyük beyaz bir ara yüzey oluşacaktır. Süpernatantı 20 milliliters buz gibi soğuk B iki çözeltisi ile uzaklaştırın ve tüpü bir dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. İkinci bir santrifüjleme işleminden sonra miyelin, süpernatantın yüzeyinde yoğun beyaz bir tabaka oluşturacaktır.

B iki çözeltisinin dökülürken tüp çeperi boyunca akmasını sağlamak için tüpü yavaşça döndürün ve myelini süpernatantla birlikte uzaklaştırın. Ardından, tüp çeperindeki kalıntı sıvıları temizlemek için emici kağıda sarılmış plastik bir pipet kullanın. Çökelmeye dokunmamaya dikkat ederek tüpü buz üzerinde ters çevirin.

Ardından, pellet'i bir mililitre buz gibi soğuk B üç solüsyonu içinde resüspande edin ve veziküllerin agregat oluşturmamasına dikkat ederek beş mililitre daha B üç solüsyonu ekleyin. Şimdi bir Beher flaskonun üzerine 20 mikronluk bir naylon ağ filtre yerleştirin ve filtreyi 10 mililitre buz gibi soğuk B üç solüsyonu ile dengeleyin. Vezikül preparatını filtrenin üzerine dökün ve vezikülleri 40 mililitre daha buz gibi soğuk B üç solüsyonu ile dikkatlice durulayın.

Ardından, temiz bir pens kullanarak filtreyi derhal 30 mililitre taze B three çözeltisi içeren bir behere aktarın ve kapları hafifçe çalkalayarak filtreden ayırın. Beher içeriğini 50 mililitrelik plastik bir tüpe boşaltın. Daha sonra santrifüjlemeden sonra, immün boyama öncesinde peleti bir mililitre buz gibi B three çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

Kapları 0,2 mililitrelik PCR tüplerine aktarın ve tüplerin dibinde doku sedimenti oluşana kadar tüpleri buz üzerinde bekletin. Ardından, sıvının çoğunu aspire etmek için jel yükleme uçları kullanın. Sonra, P 200 pipet ucuna silikonize 40 mikrometre cam kılcal boru yerleştirin ve kaplar çöktüğünde bunları bir lam üzerine aktarmak için kılcal boruyu kullanın; kaplar yerleştiğinde sıvıyı emici bir kâğıt parçasıyla dikkatlice temizleyin.

Ardından, kapların üzerine tek bir damla kapatma medyumu ekleyin ve kapatma medyumunun lam üzerindeki kenarlara yayılmasına izin vererek lamelini 45 derecelik bir açıyla kapatın. Bu görüntüde, nöral endotel hücreleri çevresindeki sürekli RIN etiketlemesi gözlemlenebilir ve bu durum, bazal laminanın saflaştırılmış damarlarda korunduğunu doğrulamaktadır. ZO one gibi endotel sıkı bağlantı bileşenleri de saflaştırılmış damarlarda tespit edilmiştir.

Ayrıca, NG iki ve düz kas aktin markalamaları sırasıyla sağlam parazitlerin ve vasküler düz kas hücrelerinin korunduğunu göstermektedir. Perivasküler astroglial membran proteinleri olan konneksin 43 ve Aquaporin dört de saflaştırılmış damarların yüzeyinde tespit edilmiştir; bu durum, saflaştırma işlemi sırasında perivasküler astrosit membranlarının da korunduğunu kanıtlamaktadır, ancak izole edilen damarlar üzerinde yalnızca dağılmış ve kısa GFAP pozitif lifler gözlemlenmiştir, bu da astrosit hücre gövdelerinin birlikte saflaştırılmadığını ortaya koymaktadır. Damarlara yalnızca birkaç nöronal lif yapışık kalmıştır.

Benzer şekilde, IBA1 ve oli2 pozitif hücreler de tespit edilmemiştir; bu durum, mikroglia ve oligodendrositlerin birlikte saflaştırılmadığını doğrulamaktadır. Beynin homojenizasyonundan önce mevcut pleksusun çıkarılmasını şiddetle öneririz, çünkü bunun olası bir kontaminasyon kaynağı olduğunu deneyimledik; temiz bir alanda çalışın, saç ve toz kontaminasyonundan kaçının. Antikorların bu materyallere karşı yüksek spesifik olmayan afiniteleri vardır.

Ayrıca her zaman bir nükleer boyama yapılması da önemlidir. Damar ekstraksiyonundan önce PBS ile intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirilerek saflaştırılmış damarlardan kan hücrelerinin uzaklaştırılması mümkündür. Hem taze hazırlanmış hem de dondurulmuş damar paletlerinden, bu prosedürle saflaştırılmış damarlardan hava ve proteinleri başarıyla ekstre ettik.

Damarların ex vivo endotel taşıma fonksiyonunu incelemek için floresan problar ve konfokal mikroskopi de kullandık. Deneylerinizde başarılar dileriz.