Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Prosedürün genel amacı, spesifik antikorlara veya transgenik suşlara ihtiyaç duymadan bir dizi düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon kullanarak, yapısal bütünlüğünü korurken fare beyninin vasküler bölmesini saflaştırmaktır. Kan beyin bariyerinin hücresel, moleküler ve farmakolojik araştırmalarına izin veren teknikler geliştirmek için birçok çaba sarf edilmiştir. Ayırma, gradyanlar, kolonlar veya yüksek hızlı santrifüjleme adımlarının olmaması, bu prosedürle beyin damarlarının saflaştırılmasını çok kolay, hızlı ve ucuz hale getirir.

Beyin damarları, etiket bağlantısı ile kapatılmış ve bazal lanar parazitler, vasküler S çoğu kas hücresi ve perivasküler astro membranlar ile çevrili endot hücreleri ile yapısal olarak sağlam kalacaktır. Bu protokol, CE vasküler kompartmanının işlevi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve prosedürün Martin Coen S ekibinden bir ole a postdoc olacağını gösteren moleküler bileşiminin çalışmasına izin verebilir. Prosedüre başlamadan önce, filtre tutucunun üst vidalama kısmının altını kesin.

Ardından, farenin boynundan burnuna kadar cildi incitmek için bir neşter kullanın ve cildi geri çekin. Kirletici tüyleri temizlemek için kafatasını PBS ile yıkayın ve ardından koku ampullerinin önündeki kafatasına bir makas yerleştirin. Kafatasını parçalara ayırmak için makası açın ve spatula ile beyni çıkarın.

Daha sonra, koroid pleksusu lateral ventriküllerden ayırın ve beyni, buz üzerinde 20 mililitre B bir çözelti içeren 150 mililitrelik bir behere aktarın. Daha sonra beyni iki milimetrelik doku parçalarına kuvvetlice doğramak için iki neşter kullanın ve dokuyu buz üzerinde 400 RPM'de 20 vuruş boyunca homojenize etmek için otomatik bir aşağı homojenizatör kullanın. Kapları saflaştırmak için homojenatı 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve doku bulamacını aşağı doğru döndürün.

Sallanan bir rotor santrifüjünde, kap peletinin üstünde çoğunlukla miyelden oluşan büyük beyaz bir arayüz oluşacaktır. Süpernatanı 20 mililitre buz gibi soğuk B iki solüsyonunda atın ve tüpü bir dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. İkinci bir santrifüjlemeden sonra, miyelin süpernatantın yüzeyinde yoğun beyaz bir tabaka oluşturacaktır.

B two çözeltisinin dökülürken duvar boyunca ilerlemesine izin vermek için tüpü yavaşça döndürün ve miyelini süpernatan ile birlikte atın. Ardından, tüpün duvarlarından kalan sıvıyı çıkarmak için emici kağıda sarılmış plastik bir pipet kullanın. Kap peletine dokunmamaya ve tüpü buz üzerinde ters çevirmemeye dikkat edin.

Daha sonra, peleti bir mililitre buz gibi soğuk B üç çözeltisinde askıya alın, ardından damarların agrega oluşturmamasına dikkat ederek beş mililitre B üç çözeltisi daha eklenir. Şimdi bir Becker şişesinin üzerine 20 mikronluk bir naylon ağ filtre yerleştirin ve filtreyi 10 mililitre buz gibi soğuk B üç solüsyonu ile dengeleyin. Kap hazırlığını filtrenin üzerine dökün ve kapları 40 mililitre buz gibi soğuk B üç solüsyonu ile dikkatlice durulayın.

Ardından, filtreyi hemen 30 mililitre taze B üç çözeltisi içeren bir behere aktarmak için temiz forseps kullanın ve kapları filtreden hafifçe çalkalayarak takın. Beher içeriğini 50 mililitrelik plastik bir tüpe dökün. Daha sonra bir santrifüjlemeden sonra, immüno-boyamadan önce peleti bir mililitre buz gibi B üç solüsyonunda yeniden askıya alın.

Damarları 0.2 mililitrelik PCR tüplerine aktarın ve tüplerin dibindeki doku tortusu oluşana kadar tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Ardından sıvının çoğunu aspire etmek için jel yükleme uçlarını kullanın. Daha sonra, bir P 200 pipet ucuna Silikonize 40 mikrometre cam kılcal bir yerleştirin ve kılcalları, kaplar yerleştiğinde bir cam slayta aktarmak için kullanın, sıvıyı bir parça emici kağıtla dikkatlice çıkarın.

Daha sonra kaplara tek bir damla montaj ortamı yükleyin ve 45 derecelik bir açıyla bir kapak kızağı uygulayın, böylece montaj ortamının kapak kızağı yerine oturana kadar camın kenarı boyunca yayılmasına izin verin. Bu görüntüde, nöral endotel hücrelerinin etrafındaki sürekli RIN etiketlemesi, bazal laminanın saflaştırılmış damarlar üzerinde tutulduğunu doğrular. Endotelyal sıkı bağlantıların ZO gibi bileşenleri de saflaştırılmış damarlarda tespit edilir.

Ayrıca, NG iki ve düz kas aktin etiketlemesi, sırasıyla sağlam parazitlerin ve vasküler düz kas hücrelerinin tutulmasını gösterir. Perivasküler astro glial membran proteinleri bağlantısı 43 ve Aquaporin dört, saflaştırılmış damarların yüzeyinde de tespit edilir, bu da saflaştırma işlemi sırasında perivasküler astrosit zarlarının ek tutulmasını gösterir, ancak izole edilmiş damarlarda sadece dağılmış ve kısa GFAP pozitif lifler gözlenir, bu da astrosit hücre gövdelerinin birlikte saflaştırılmadığını ortaya çıkarır. Damarlara bağlı sadece birkaç nöronal lif kalır.

Benzer şekilde, IBA bir ve oli iki pozitif hücreler de tespit edilmez, bu da mikroglia ve oligodendrositlerin birlikte saflaştırılmadığını doğrular. Olası bir kontaminasyon kaynağı olarak deneyimlediğimiz için beynin homojenizasyonundan önce mevcut pleksusun çıkarılmasını şiddetle tavsiye ediyoruz, temiz bir alanda çalışın ve saç ve toz kontaminasyonundan kaçının. Antikorlar, bu malzemeler için yüksek bir spesifik olmayan afiniteye sahip olduğundan.

Her zaman nükleer boyama yapmak da önemlidir. Damar ekstraksiyonundan önce PBS ile intrakardiyak perfüzyon yapılarak saflaştırılmış damarlardan kan hücrelerinin çıkarılması mümkündür. Bu prosedürle saflaştırılan kaptan hem taze hazırlanmış hem de donmuş kap paletlerinden başarılı bir şekilde hava ve protein ekstrakte ettik.

Ayrıca damarların ex vivo endotel taşıma fonksiyonunu incelemek için floresan problar ve konfokal mikroskopi kullandık. Deneylerinizde başarılar dileriz.