Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kontrollü deneysel koşullar altında sıçan mezenterindeki ular mikrodamarlarının duvarlarının hidrolik iletkenliğinin veya su geçirgenliğinin tekrarlı ölçümlerini yapabilmektir. Bu, lümendeki onkotik ve hidrostatik basınçların ayarlanabilmesini ve perfüzyon sıvısının kimyasal bileşiminin hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlamak amacıyla bir ular mikrodamarının kanülasyonu ile gerçekleştirilir. Ardından, damar tıkanır ve perfüzyon sıvısı içinde süspansiyon halindeki, akış belirteçleri olarak görev yapan alyuvarların, transvasküler sıvı değişiminin göstergeleri olarak lümende hareketleri gözlemlenebilir.

Ardından, işaretleyici kırmızı hücrelerin konumu ve hızı, ya tıkanıklık bölgesine doğru ya da tıkanıklık bölgesinden uzağa doğru kaydedilir. Son olarak, tıkanıklık giderilir ve ek ölçümler için işlem tekrarlanır veya damar yeniden kanüle edilerek ölçümler değiştirilmiş koşullar altında tekrarlanır.

Nihayetinde, mikrodamarların geçirgenliğini düzenleyen faktörlerin en doğrudan şekilde araştırılabilmesi için kontrol ve test koşulları altında eşleştirilmiş hidrolik iletkenlik ölçümleri yapılabilir. Kılcal damar geçirgenliğinin düzenlenmesini incelemek için modifiye Landis tekniğinin bir avantajı, perfüzyon adımıdır. Mikroperfüzyon; perfüzyon sıvısı bileşiminin, değişim yüzey alanının ve mikrodamar basıncının tamamının doğrudan kontrol edildiği koşullar altında, mikrodamar duvarının geçirgenliğinin ölçülmesine olanak tanır.

Bu yöntem, sağlam organları temsil eden mikrodamlarlarda geçirgenlik düzenlemesinin hücresel ve moleküler mekanizmalarına ilişkin soruları yanıtlayabilir ve genellikle moleküler mekanizmaların detaylarını araştırmak için kullanılan kültürlenmiş endotelyal monokatmanlardan elde edilen sonuçlarla karşılaştırma imkanı sağlayabilir. Protokolümüzü laboratuvar yöneticimiz Joyce Clark uygulamaktadır. Joyce, buradaki laboratuvar yöneticiliği görevi süresince bu protokole getirilen birçok geliştirmenin sorumlusu olmuştur.

Başlamak için, hava tahrikli bir taşlama tekerleği, su ile ıslatılmış 0,5 mikronluk bir aşındırıcı kağıt ve yatay pah açısına göre 30 derecelik bir açıyla ayarlanmış bir mikro pipet tutucu kullanarak, elektronik bir çekici ile birkaç temiz borosilikat cam kapiler tüpü, her birinin uç uzunluğu yaklaşık bir santimetre olacak şekilde konik yarımlara dönüştürerek mikro pipetleri oluşturun. Mikro pipetleri metin protokolüne göre yıkayıp kuruttuktan sonra, açıklığı yaklaşık 50 mikron uzunluğunda ve pah uzunluğunun genişliğine oranı 3,1 ile 3,5 arasında olan mikro pipetleri seçin. Ayrıca, mezenterdeki sert kolajen liflere nüfuz etmeye yardımcı olacak keskin konik bir uca sahip olmalıdırlar.

Sınırlayıcıları hazırlamak için, ucu eğimsiz çekilmiş cam bir kılcal boruyu, küt bir uç oluşturacak şekilde kısa bir süre mikro alevin yanında tutun. Birkaç sınırlayıcı yapmak için işlemi tekrarlayın ve bunları tozsuz bir kutuda saklayın. Ardından, ucu eğimsiz çekilmiş bir kılcal boruyu mikro alevin altında belirli bir açıyla tutarak mikro oklüzyonlar oluşturun ve bir boru adaptörü veya kırık bir mikro pipet kullanarak boruyu uçtan yaklaşık dört milimetre uzaklıkta, 120 dereceye yakın bir açıyla nazikçe bükün.

Mil ile ilgili olarak, ucun ne alevde mühürlenmiş ne de kırılmış olması önemlidir. Bir sıçanı anestezi altına alıp mezenter dokusunu ve bağırsağı metin protokolüne göre düzenledikten sonra, mezenter okülerler aracılığıyla görülecek şekilde hayvan tepsisini mikroskop tablasına yerleştirin. Sürekli perfüzyon sağlamak için memeli ringer çözeltisi içeren yerçekimi destekli bir damla hattı konumlandırın.

Ardından mezenter için, bağırsağı sabit tutmak, nemi korumaya yardımcı olmak ve yüzeydeki fazla Ringer çözeltisini emdirmek amacıyla gazlı bez pedler kullanın; sabit bir Ringer tabakası sağlamak için akışı ayarlayın ve efllüenti aspire edin; yakınsak akışın aşağısındaki dallanmamış segmentler olan ve gerçek kılcal damarların distalinde bir veya iki dal bulunan hedef mikrodamarları belirleyin. Kan akışının hızlı olduğu ve damar duvarına yapışmış beyaz hücrelerin bulunmadığı dallanmamış bir damar bulun. Test mikrodamarlarını mikroskop alanının merkezine konumlandırın ve tutucuyu seçilen kanülasyon bölgesinin yakınına getirin.

Mikropipeti doldurmak için, metin protokolüne göre hazırlanan bir şırıngaya perfuse eight ve yıkanmış eritrositleri çekin; tüplerde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Tüpü, konik bölgeye dayanana kadar mikropipetin geniş ucuna doğru ilerletin. Mikropipet ucunu doldurmak için şırınga pistonuna nazik ve hızlıca bastırın.

Dolduğunda, ucunda küçük bir akıntı veya damla belirecektir. Tüpü geri çekerken, mikro pipet şaftını doldurmak için pistonu nazikçe itin. Ardından, şafttaki küçük hava kabarcıklarını şafta hafifçe vurarak giderin.

Ardından mikropipeti, bir su manometresine sürekli sıvı bağlantısı sağlayan yan portlu bir pipet tutucuya yerleştirin. Hidrolik sürücüye ve mikromanipülatöre bağlı olan tutucunun, mikropipet konisinin kenarının bağırsağa veya tepsiye çarpmaması için hafif bir yatay açıda ayarlandığından emin olun. Bir şırınga veya suyla doldurulmuş kauçuk pompa kullanarak, manometrenin su sütunundaki sıvı yüksekliğini mezenterin yaklaşık 40 santimetre üzerine çıkarıp indirerek mikropipetteki sıvıya uygulanan hidrostatik basıncı ayarlayın.

Dolu mikro pipeti mikroskobun altına yerleştirmeden önce, dokuyu kavrayacak yeterli kuvvet uygulayarak sabitleyiciyi mikro damarların yakınındaki dokunun üzerine nazikçe bastırın, ardından dokuyu mikro damarlarla aynı hizaya gelecek şekilde hafifçe geriye çekerek gerin; böylece mezenterik kolajen liflerindeki gerilmeler damarla hizalanmış olur. Mikro pipeti damarla hizalayın ve okülerler aracılığıyla görüş alanına indirin. Pipet ucunu seçilen kanülasyon bölgesinin hemen yukarısına yerleştirin ve damar içindeki akışı tamamen engellemeyecek ancak kısmen kısıtlayacak şekilde dokunun üzerine indirin.

Hidrolik sürücüyü kullanarak, pipet ucunu damar lümenine yavaşça iterek damarı kanüle edin; bu sırada ucun damarın karşı duvarını delip geçmemesine dikkat edin. Mikro pipet lümene girdiğinde, perfüzyon sıvısı kanı damar lümeninden hızla yıkayacak ve dolaşıma girecektir. Kırmızı hücreler damar lümeni içinde hafifçe salınana kadar manometreyi ayarlayarak perfüzyon basıncını düşürün.

Bu işlem, mikrodamarlar segmentinin distal ucundaki hidrostatik mikrodamarlar basıncını veya PC'yi ölçen denge basıncını belirler. Mikro oklüzyonu gerçekleştirmek için damar perfüzyonunu bu denge basıncının üzerinde tutun. Video ve ses yardımıyla, tıkayıcıyı mikroskop alanının alt kenarına yakın, perfüze edilen damarın üzerine yerleştirin.

Bloklama bölgesinin konumunu, I parçasındaki kırmızı renkte görüldüğü şekilde sözlü olarak kaydedin. Bloklama bölgesi 57'dir; bloklayıcının ucu mikro damarın hemen üzerine yerleştirilir. Damardaki akış tıkanana kadar bloklayıcıyı nazikçe aşağı indirmek için mikromanipülatörün hassas Z kontrolünü kullanın.

Manometre basıncını kaydetmek için ses kaydı kullanın. Basınç 50'dir. Ardından, üç ila 10 saniye boyunca oklüzyon uygulayın ve serbest bırakın.

Serbest perfüzyonu geri sağlamak için, blok bölgesini damar boyunca pipet ucuna doğru beş ila 10 mikronluk adımlarla ilerletin; blok bölgesindeki damar duvarı hasarını önlemek için her konumda üçten beşe kadar daha fazla tıkanma gerçekleştirmeyin. Verileri metin protokolüne göre analiz edin. Bu zaman seyri, dört perfüze kollarla başarıyla kanüle edilmiş sıçan ular mikrodamarlarındaki hidrolik iletkenlik veya LP değişikliklerini ölçer.

Mikro damarlardaki değişimleri ölçmek için sabit basınçtaki LP büyüklüğü kullanılmıştır. Kontrol grubu olarak %1BSA ile perfüzyon yapıldığında duvar geçirgenliği ile 10 molar inflamatuar ajan Bradikinin veya bk ile perfüzyon yapıldığındaki geçirgenlik karşılaştırılmıştır. Burada gösterildiği gibi, BK, 10 ila 15 dakika içinde kontrol seviyelerine dönen geçici bir LP artışına neden olmuştur.

%1BSA 10 nanomolar ile bazal seviyeler yeniden oluşturulduktan sonra, BK, bir mikromolar pH scene one phosphate veya S one P ile birlikte yeniden perfüze edildi. Sonuçlar, S one P'nin bk'ya verilen yanıtı önemli ölçüde azalttığını göstermektedir. Bazı deneysel tasarımlarda, hem bir makromolekül için solut yansıma katsayısının hem de lp'nin tahmin edilmesi önemlidir.

Bu işlem, her bir mikro damarda birden fazla basınçta JV ölçülerek en iyi şekilde gerçekleştirilir. Bu deney, mikro damarları çevreleyen dokuda albümin bulunmadığı durumda, PERFUSE sekizinde hem LP'yi hem de %5 albüminin etkili onkotik basıncını tahmin etmiştir. S üzerinden JV üç farklı basınçta ölçülmüş ve burada grafiğe dökülmüştür.

LP, JV/S ile basınç arasındaki ilişkinin eğimidir ve basınç eksenindeki kesişim noktası, damar duvarı boyunca oluşan efektif onkotik basınç farkını temsil eder. İmmünofloresan işaretleme ve konfokal mikroskopi, hatta transmisyon elektron mikroskopisi gibi diğer tekniklerle birleştirildiğinde, mikroperfüzyon, geçirgenliği bilinen damarlar kullanılarak mikrovasküler endotel ve fonksiyonun güçlü bir analizini sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, kontrollü deneysel koşullar altında sıçan mezenterindeki kılcal damarların hidrolik iletkenliğinin veya su geçirgenliğinin tekrarlı ölçümlerinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu yaklaşımı şu an mevcut olan sıçan modellerinde kullanabilirsiniz, ancak özellikle CRISPR Cas nine teknolojisi ile erişilebilir hale gelecek yeni genetiği değiştirilmiş sıçanlarda kullanılabilme olasılığıyla ilgileniyorum ve bu şekilde genişletilmesini umuyorum.