Name: VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Öğrenin, B hücreli lenfoma örneklerinde klonal evrim desenlerini ortaya çıkarmak için immünglobulin ağır zincir VDJ bölgelerinin derin dizileme analizini. Bu yöntem, tekrarlayan tümörlerin kökenini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, düşünceli tartışmalar için Dr. Rita Shaknovich'e ve Elemento laboratuvarı, Melnick laboratuvarı ve Tam laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. VDJ dizilemesini gerçekleştirdiği için Weill Cornell Medical College'daki Genomik Kaynaklar Çekirdek Tesisine de teşekkür ederiz. YJ, ASH Scholar Award tarafından desteklendi. WT ve OE, Weill Cornell Kanser Merkezi Pilot Hibesi tarafından desteklenmektedir. OE, NSF KARİYER ödülü, Starr Kanser Konsorsiyumu ve Hirschl Vakfı tarafından desteklenmektedir. Bu projeye verdiği cömert destek için JD, MPH'den Katherine Benesch'e de teşekkür ederiz.

1. VDJ Büyütme Tümör Örneklerinden 1.1) DNA Ekstraksiyon <ol><li> Donmuş Ekim gömülü normal veya malign dokuların ince kesitlerinin (10-20 mikron) DNA ayıklayın. <ol><li> Proteinaz K ile (0.5 mg / ml, son konsantrasyon elde 4 mi Nükleik Lizis Tamponu (; 0.3 M NaCl 0.002 M Na2EDTA 0,0075 M Tris HCI, pH 8.2) bir kriyostat mikrotom ile kesilmiş gömülü doku 10-30 ince kesitler Digest ) ve gece boyunca bir 37 ° C su banyosu içinde, 15 ml santrifüj tüpü içinde 0,625% SDS. </li><li> Sindirim karışımı, doymuş NaCl (5 M) 1 ml ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne süpernatant aktarın ve 100% etanolden iki hacmin ilave edin. </li><li> Tüpü 6-8 kez tersine çevirerek karıştın. 4 ° C&#39;de 60 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüjleyin Çökelen DNA toplamak. </li><li> % 70 etanol ile iki kez DNA pelet yıkayın. Centr15 dakika pelet toplamak için her zaman için 5.000 xg&#39;de ifuge. </li><li> Bir çalkalama gece boyunca oda sıcaklığında 100-400 ul TE tampon maddesi içinde DNA içinde çözülür. DNA verimi doku boyutuna bağlı olarak 5 ila 200 ug (50-500 ng / ul arasında nihai konsantrasyon) </li></ol></li><li> Formalinle sabitlenmiş, parafin gömülü (FFPE), normal veya habis doku ince bölümler (10-20 um) DNA ekstrakte edin. <ol><li> Iki kez 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 10 dakika, her seferinde, oda sıcaklığında de-paraffinize ksilen 1 ml parafin kesitleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de iplik doku bölümleri toplayın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika tortu, ksilenler çıkarmak için her iki kez 1 ml% 100 etanol içinde bölümleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de iplik doku bölümleri toplayın. Parafin tamamen bu noktada çözülür ve sadece doku bölümü ayakta durmaktadır. </li><li> Oda te de bölümleri Hava kuruması10-15 dakika boyunca mperature. </li><li> (Nükleaz içermeyen su ile 10x PCR tamponu seyreltilmiş), 1x PCR tampon maddesi ile bir 0.5 mg / ml Proteinaz K solüsyonu sağlayın. 50-100 ul&#39;lik bir nihai hacim içinde örnekleri Proteinaz K solüsyonu ilave edin ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir. </li><li> Proteinaz K. inaktive etmek için 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de ısıtınız örnekleri Not: Bu adımda, örnek DNA, PCR tampon maddesi içinde çözülmüş ve direkt Adım 1.2 ve 1.3 &#39;de kullanılabilir. DNA verimi doku boyutuna bağlı olarak 0.5 ila 20 ug (10-200 ng / ul arasında nihai konsantrasyon). </li></ol></li></ol> 1.2) DNA Kalite Değerlendirmesi <ol><li> PCR tüpünde ticari merdiven kiti ana karışımı 45 ul 0,25 ul Taq DNA polimeraz karıştırın. </li><li> PCR tüpüne 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir 5 ul DNA ekleyin ve en az 5 kez pipetleme aşağı iyice karıştırın. </li><li> 95 ° C için: DNA&#39;yı büyütmek için aşağıdaki şartları kullanın7 dakika; 95 ° C, 60 ° C &#39;de 45 saniye ve 72 ° C&#39;de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C &#39;de sabit. </li><li> TBE (Tris / borat / EDTA) ve% 2 agaroz jeli hazırlayın. </li><li> 4 ul 6x yükleme boyası ile 20 ul PCR reaksiyon karışımı, bir% 2 agaroz jeli üzerine yüklenir. </li><li> 0.5 ug / ml etidyum bromür solüsyonu ile agaroz jel leke ve bir jel hayal sistemi ile PCR ürünleri algılar. Not: 100, 200, 300, 400 ve 600 bp ebatlarda 5 PCR ürünleri elde edildi örnekleri VDJ amplikonları oluşturmak için devam edilecektir. DİKKAT: Etidyum bromür güçlü bir mutajen olduğunu. Koruyucu dişliler, yani eldiven giyerek son derece dikkatli ele ve kurumun kurallarına göre belirli kaplara atın. </li></ol> 1,3) VDJ PCR 1.3.1) Çerçeve Bölgesinde 1 Amplify recombined IgH VDJ Segmenti (IgVHFR1) <ol><li> Tüp etiketi 45 ul ana karışımı karıştırıned ticari bir somatik IGH Hipermutasyon Deneyi Jel Tespiti için kitin &quot;karışımı 2&quot;, Taq DNA polimeraz ul 0.25, ve bir PCR tüpü içinde 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir 5 ul numune DNA kullanılabilir. </li><li> DNA&#39;yı büyütmek için aşağıdaki koşullar kullanın: 7 dakika boyunca 95 ° C; 95 ° C, 60 ° C &#39;de 45 saniye ve 72 ° C&#39;de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C &#39;de sabit. </li><li> Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde bütün PCR ürünü giderin. </li><li> 0.5 ug / ml etidyum bromür solüsyonu ile agaroz jel leke ve bir jel görüntüleme sistemi ile PCR ürünleri algılar. Bir monoklonal amplikon 310-380 bp boyut aralığı ile tahmin edilmektedir. </li><li> 310-380 bp arasındaki monoklonal amplikonu içeren jel bölümü tüketim. </li><li> Üreticinin protokolüne göre, standart bir Gel Extraction Kit, çıkarılan jel DNA saflaştınlır. Not: FR1 fragmanları elde edilebilir örnekleri için, iGV bol miktarda olan gerek yokturHFR2 ve IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Çerçeve Bölgesinde 2 Amplify recombined IgH VDJ Segmenti (IgVHFR2) <ol><li> PCR tüpü içinde 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir jel Tespit kiti ticari bir IGH Gen Klonalite Testinin &quot;Tüp B&quot;, Taq DNA polimeraz ul 0,25 ve 5 ul örnek DNA olarak adlandırılan tüp 45 ul ana karışımı karıştırın . </li><li> DNA&#39;yı büyütmek için aşağıdaki koşullar kullanın: 7 dakika boyunca 95 ° C; 95 ° C, 60 ° C &#39;de 45 saniye ve 72 ° C&#39;de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C &#39;de bırakın. </li><li> Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde bütün PCR ürünü giderin. </li><li> 0,5 ug / ml etidyum bromür boyama PCR ürün (ler) görselleştirme. Bir monoklonal amplikon 250-295 bp büyüklüğünde bir aralık içinde görülebilir. </li><li> 250-295 bp arasındaki monoklonal amplikonu içeren jel bölümü tüketim. </li><li> Standart Jel Özü kullanılarak eksize jelden DNA arındırmaküreticinin protokolüne uygun iyon Kit. </li></ol> 1.4) Optimize VDJ PCR <ol><li> 7 dakika, 60 saniye, 60 saniye boyunca 60 ° C, 95 ° C 40 döngü, 90 saniye için 72 ° C sıcaklıkta son uzatma, 95 ° C: IgVHFR1 ve IgVHFR2 optimal DNA kullanılarak amplifiye etmek için, aşağıdaki tadil edilmiş PCR koşulları kullanarak 10 dakika boyunca 72 ° C. </li></ol> 2. VDJ Amplikon Kütüphane hazırlanması ve Sekanslanması 2,1) Kütüphane hazırlanması 2.1.1) End-onarım <ol><li> PCR tüp içine 1.3 VDJ PCR ürünü aktarın ve 60 ul hacim getirmek için DNA Numune Hazırlama Seti Tekrar Süspansiyonu Buffer ekleyin. </li><li> DNA Numune Hazırlama Seti sonu Onarım Mix 40 ul ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 100 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir kapak ile önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (30 ° C) &#39;de 30 dakika süre ile 30 ° C&#39; de reaksiyon inkübe edin. </li><li> 136 ul manyetik boncuk ve 24 ul PCR g MixRade Suyun ilk olarak 1.5 ml bir tüp içinde, daha sonra 1,5 ml tüp içine 2.1.1.3&#39;de tamamını sonu tamir reaksiyonunu aktarmak ve boncuk çözeltisi ile iyice karıştırılır. </li><li> 2 dakika için bir manyetik stand üzerine yerleştirin borular çözeltiden boncuk ayrılmasını sağlamak için. Süpernatantı aspire ve tüp manyetik standında açıkken iki kez% 80 taze hazırlanmış EtOH ile boncuk yıkayın. </li><li> Tamamen etanol çözeltisi aspire ve 15 dakika için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca havada kurumaya boncuklar verir. </li><li> 17.5 ul Tekrar Süspansiyonu Tampon manyetik standı ve tekrar süspansiyon boncuk kapalı tüp atın. </li><li> Geri Tekrar Süspansiyonu Tampon ayrı boncuk 2 dakika süreyle manyetik stand üzerine yerleştirin tüpleri. Temiz bir PCR tüpüne Tekrar Süspansiyonu Buffer (Son onarım ürünü şimdi Tekrar Süspansiyonu tamponunda yeniden süspanse) çıkarın. </li></ol> 2.1.2) A-atık <ol><li> Son onarım ürünü ihtiva eden PCR tüpüne 12.5 ul A-atık karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. </li&gt; <li> 100 ° C &#39;de bir ön-ısıtılmış kapak ile, bir önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (37 ° C)&#39; de 30 dakika süre ile 37 ° C &#39;de, PCR tüpü inkübe edin. </li></ol> 2.1.3) Adaptör ligasyonu <ol><li> A-atık reaksiyona 2.5 ul Tekrar Süspansiyonu Buffer, 2.5 ul ligasyon Mix ve 2.5 ul DNA Adaptör Endeksi ekleyin. </li><li> 100 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir kapak ile önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (30 ° C) &#39;de 30 minl 30 ° C&#39; de reaksiyon inkübe edin. </li><li> Her reaksiyon içine 5 ul Dur ligasyon Buffer ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 2.1.1.5 2.1.1.8 adımları aşağıdaki reaksiyonu temizlemek için 42.5 ul iyi karıştırılmış manyetik boncuk karıştırın. &#39;Adaptörü bağlı ürünü elüte etmek için 50 ul Tekrar süspansiyona, Tamponu ekleyin. </li><li> 50 ul iyi karıştırılmış AMPure XP boncuklar kullanılarak ikinci bir defa &#39;adaptörü bağlı ürün temizleme ve temiz bir PCR tüpüne 25 ul Tekrar süspansiyona, Tamponu içinde, ürünü yıkamak. </li></ol> 2.1.4) Genişletme DNA Fragments <ol><li> Adaptör bağlandı ürünü içeren PCR tüp 5 ul PCR Primer Kokteyl ve 25 ul PCR Master Mix ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Aşağıdaki koşullar ile önceden programlanmış bir PCR amplifikasyon yapın: 30 saniye için 98 ° C; 10 sn için 98 ° C 10 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 30 sn için 72 ° C; Daha sonra 5 dakika boyunca 72 ° C ve 10 ° C&#39;de tutun. </li><li> 50 ul iyi karıştırılmış manyetik boncuklar kullanarak tepkisini temizleyin ve 30 ul Tekrar Süspansiyonu Tampon nihai ürün Zehir. </li></ol> 2.1.5) Kütüphane Doğrulama <ol><li> Üreticinin protokolü kullanılarak bir florometre ile nihai ürünü ölçmek. Nihai kütüphanesi konsantrasyonu 2,5 ila 20 ng / ul arasındadır. </li><li> Üreticinin protokolüne göre Yüksek Hassasiyet DNA çip ile bir analitik araç kullanılarak nihai ürünün kalitesini değerlendirmek. IGVHFR1, IGVHFR2 ya IGVHFR3 biri için umulan boyutta tek bir bant bekliyoruz. SanaKütüphane ürünün xpected boyutu orijinal VDJ amplikonun boyutunu artı adaptörleri (~ 125 bp) boyutunu eşittir. </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Kütüphane havuzu ve Sıralama <ol><li> Aşağıdaki formül kullanılarak her bir kütüphane fraksiyonu molaritesini hesaplayın: nM = [(ng / 1000) / bp * 660] ng adımda 2.1.5.1 ölçülen VDJ-PCR kütüphane konsantrasyonu 10 9 x ve bp doruğudur VDJ-PCR kütüphanenin ebadı adım 2.1.5.2 kaydedilmiştir. </li><li> DNaz içermeyen su ile 2 nM (10 ul toplam) kütüphaneyi seyreltin. </li><li> Birlikte bir 1,5 ml tüp içine seyreltildi 2 nM kütüphanelerinin 10 ul birleştirin. </li><li> 1,5 ml tüp içine phix başak kontrol eşit hacim. </li><li> Bir akış hücresi üzerine 07:00 konsantrasyonda havuz yükleyin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre eşleştirilmiş uç 150 çevrim sequencer kullanarak kütüphaneleri sırası. </li></ol> 3. Veri Analizi Not: SummBu bölümde kullanılan biyoinformatik Dizelerin li bir Ek kod dosyası olarak bulunabilir. 3.1) Uyum ve QC <ol><li> Harita paired-end dizileme, bir insan IGH V karşı okur 2 aralık açık cezası, 1 aralık uzatma cezası ile NCBI temin &#39;BLASTN&#39; dayalı bir uyarlanmış nükleotid blast algoritmasını kullanarak IMGT web sitesinden 11 indirilen Ge ve J bölge veritabanı, 7 sözcük uzunluğu ve 10 -4 e-değeri eşik. Bir IGH V ve J bölge hem eşleşmiyor okuma-çifti atın. </li><li> Tüm örnek üzerinde sıralama çalışmadan elde edilen çiftleri okumak karşısında VJ kombinasyonları eşleşen frekanslarını elde etmek için IGH V ve J eşlemeleri var kalan okuma-çiftleri sayın. Bir IGH V ve J geninin hem eşleştirilmiş ise salt çifti sayın ve sonra belirli VJ kombinasyonu gelen saymak onun alel ekleyin. </li><li> Yüksekten 3.1.2 elde edilen her bir rekombine VDJ bölge için sayıları Ranken est. VDJ bölgesi en yüksek sayısı önemli bir yeniden düzenleme kombinasyonu olarak tanımlanır okur vardır. </li><li> 3.1.3 tanımlanan etki büyük düzenlenmesi az% 35 kapsayacak hizalanmış dizileri atın. </li></ol> 3.2) SHM Profili Kimlik <ol><li> Adım 3.1.3 okur genelinde tüm SHM desenleri güvenin. Bir alt klon olarak her SHM desen tanımlayın. </li><li> Farklı benzersiz SHM desenleri karşılık olan alt grupların sayısını ve bireysel altklonları eşlenen okur sayısını. </li></ol> Sonuçların 3.3) Grafik Temsil <ol><li> Üreticinin protokolüne göre R paketi &quot;maymun&quot; dan yöntemini birleştiren bir mahalle kullanarak gelen SHM kalıplarını kullanarak altklonları üzerinde filogenetik analizi yapın. V tohum çizgisi dizisine köklü altklonüs soyoluşu yeniden bireysel farklı hizalamaları bir mesafe matrisi hesaplayınHer paired sample seti için söz konusu J kombinasyonu. </li><li> Karakter vektör olarak, her alt klonun nükleotit sıklığı kullanımı ve iki eşleştirmede arasındaki mesafe d, x, y ile verilir matematiksel tanı ve Levenshtein mesafe ölçüsünü kullanılarak ilgili nüks numuneler için önemli bir yeniden düzenleme VJ tüm alt-klonları arasındaki yaklaşık dize mesafenin hesaplanması (i, j) d x, y (i, j) = 1 i j ≠ 0, aksi takdirde, ardından dizileri i ve j nükleotid karşılık gelen dize uzunluğu boyunca bu işlevi toplamı ise nerede. </li><li> Grafiksel aşağıdaki iki yolla altklonüs mesafeler ve bunlara karşılık gelen altklonüs sayıları çıkan matris görüntüler: <ol><li> R paketi kullanın &quot;MASS&quot; üreticinin protokolüne göre altklonüs mesafe matris boyutlu ölçekleme uygulamak ve iki boyutlu bir ilke oluşturmak için daha sonra logaritma ile birlikte çizilmiştir harita, koordinatlardairenin yarıçapı olarak subclonal sayar. </li><li> Köşeleri büyük VJ düzenlenmesi kaynaklanan her farklı alt klon karşılık Levenshtein mesafe dayalı bir yönsüz grafik oluşturun. Not: Bir, daha sonra bu iki köşe arasındaki bir kenar bulunduğunu iki ayrı klonlar arasındaki mesafe eşit ise. Uzaktan bir daha büyük ise, daha sonra bunları bağlayan herhangi bir kenarı vardır. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak Kamada Kawai düzeni &quot;iGRAPH&quot; R paketinde tkplot fonksiyonunu kullanarak 3.3.3.2 grafiği çizilir. Köşe yarıçapı kendisine eşlenen klonların toplam sayısının küp kökü ile orantılıdır ve gölgeleme ya Tanı (mavi) veya nüks (kırmızı) örneklere ait klonların oranını belirtmek için kırmızı ve mavi aralığını kullanır . </li></ol></li></ol> 3.4) Heterojenite (Entropi) Ölçüm <ol><li> Numaralarını ve altklonüs sayıları inceleyinHer biri için en önemli VJ düzenlenmesi meydana gelen somatik hipermutasyon bireysel desenler numunelerin set eşleştirilmiş. </li><li> Standart histogram tabanlı entropi tahmin kullanarak her numunedeki farklı klonların sayısı için ayarlanmış ampirik entropi ve artık ampirik entropi hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Nowell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+evolution+of+tumor+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The clonal evolution of tumor cell populations.</a> Science. 194 (4260), 23-28 (1976).</li>
<li>Greaves, M., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in cancer.</a> Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).</li>
<li>Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+clonal+evolution+of+tumors+from+single+nucleotide+somatic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations.</a> BMC bioinformatics. 15, 35(2014).</li>
<li>Schatz, D. G., Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+centres+and+the+orchestration+of+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+immunology%22%5BJournal%5D)">Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination.</a> Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).</li>
<li>Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraclonal+generation+of+antibody+mutants+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres.</a> Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).</li>
<li>Coiffier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOP+chemotherapy+plus+rituximab+compared+with+CHOP+alone+in+elderly+patients+with+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).</li>
<li>Larouche, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+recurrence+5+years+or+later+following+diffuse+large+B-cell+lymphoma%3A+clinical+characteristics+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome.</a> J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).</li>
<li>Friedberg, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsed%2Frefractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).</li>
<li>Gisselbrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salvage+regimens+with+autologous+transplantation+for+relapsed+large+B-cell+lymphoma+in+the+rituximab+era%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era.</a> J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).</li>
<li>Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2C+the+International+ImMunoGeneTics+Information+System+for+Immunoinformatics+%3A+methods+for+querying+IMGT+databases%2C+tools%2C+and+web+resources+in+the+context+of+immunoinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics.</a> Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+reveals+clonal+evolution+patterns+and+mutation+events+associated+with+relapse+in+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas.</a> Genome biology. 15 (8), 432(2014).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+terminally+differentiated+mature+B+lymphocytes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency.</a> Cell. 133 (2), 250-264 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Çünkü insan B hücrelerinin IGH loküsündeki VDJ düzenlenmesi ve SHM tarafından kodlanmış dizi bilgi iterasyon neredeyse sınırsız sayıda, yüksek hacimli derin dizileme ile tüm IGH repertuarının inceleme klonal çizmek için etkin ve kapsamlı bir yol olduğunu kanıtladı ve alt klonal B hücre popülasyonları. Bundan başka, bu strateji hastalığın çeşitli evrelerinde boyunca alınmış hasta örneklerinin klonal ve alt klonal mimarileri karşılaştırarak B hücre tümör gelişiminin remisyon ve nüksetme klonal evrimi yolu incelemek için k...

Kanser klonal bir hastalıktır. Otuz yıl önce Peter C. Nowell kanseri klonal evrim modeli 1 teklif Ne zamandan beri birçok çalışma tümör örnekleri içinde klonal popülasyonları incelemek ve tumorigenezden sürecini 2 altında yatan klonal genişleme ve evrim modellerini yeniden denedim. Son zamanlarda, bütün genom dizileme klonal heterojenite ve evrim 3,4 derin bir bakmak araştırmacıları sağladı. Ancak, pek çok hücre tipinde izlenebilir belirteçlerin eksikliği nedeniyle, kesin klonal mimari ve evrimsel yolu sonucuna zordur. Neyse DLBCL dahil olmak üzere birçok lenfoid maligniteler, kaynaklandığı olgun B hücrelerinde doğal bir klonalite işareti vardır. Antijen uyarılmasına tepki olarak bu segmentlerin büyük bir havuzdan bir araya segmenti, her bir B-hücresi V H (değişken), D (çeşitlilik) katılarak tek bir üretim IgH VDJ sekansı meydana getirebilir, ve J, H (birleştirme). Bu pr sırasındakapsayabilecektir orijinal dizisinin küçük porsiyonlarda silinebilir ve ek olmayan şablonu nükleotidleri benzersiz VDJ yeniden düzenlenmesini oluşturmak için ilave edilebilir. Bu özel VDJ yeniden düzenlenmesi, bu nedenle bireysel olgun B-hücresi ve yavrular 5 etiketleme, bu B-hücre tüm yavrularında kalıtsal olabilir. Bundan başka, antikor, SHM havuz genişlemesi ve antikor afinite 6 arttırılması için ek mutasyonlar dahil etmek için daha sonra germinal merkez (GC) reaksiyonunda rekombine VDJ sekanslarda ortaya çıkar. Bu nedenle, karşılaştırma ve bu işlemleri geçirmiş lenfoma örnekleri VDJ ve SHM desen karşılaştırarak, tümör içi heterojenlik tarif edilebilir ve hastalığın gelişimi klonal yolu saptanabilecektir. Daha önce, VDJ yeniden düzenlenme ve SHM sekans bilgilerini elde etmek için PCR ürünleri, ve daha sonra Sanger sıklıklaştırıcı klonlama, rekombine bölgeleri amplifiye PCR ile tespit edilebilir. Bu yaklaşım, iTüm rekombine VDJ repertuarının, sadece çok küçük bir bölümünü almak ve belirli bir örnek içinde klonal nüfusun genel temsil karakterizasyonu engelleyen, düşük verimlilik ve düşük bir verim s. Modifiye yaklaşım VDJ PCR ürünlerinden NGS endeksli sıralama kütüphaneleri üreten ve numune başına daha yarım milyondan fazla rekombine VDJ dizileri elde etmek için PE 2x150 bp sıralama yapılarak oluşturuldu. Buna ek olarak, özel bir boru hattı filtre VDJ dizileme her okuma düzenlenmeleri ve SHMS belirlemek ve her numunenin klonal mimarisi üzerine filogenetik analizi gerçekleştirmek için okur, kalite kontrol (QC) gerçekleştirmek hizalamak için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, yeni bir yaklaşım daha çeşitli hastalık evrelerinde toplanan örneklerin klonal evrim modellerini karakterize etmek kurulmuştur. Biz DBBHL hasta numunelerinin için bu tekniği uyguladık. DBBHL kadar bir inci sık nüks ile non-Hodgkin lenfoma saldırgan formudurHastaların 7 ird. Yaklaşık 5 yıl 8 sonra meydana rağmen DLBCL nüksler normalde ilk tanı 2 ila 3 yıl içinde erken ortaya çıkar. Nüksetmiş hastalarda prognoz sadece% 10 nedeni tedavi seçenekleri kısıtlı 3 yıllık progresyonsuz sağkalım elde kötüdür. Bu DBBHL nüks 9,10 tedavisinde yeni yaklaşımlar için acil ihtiyaç için temeldir. Ancak, DBBHL nüks ile ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, DBBHL nüks gelişimi sırasında tanı ve klonal evrim de klonal heterojenite rolü, halen uncharacterized olan zor nüks tahmin etmek doğru ve yararlı bir biyobelirteci tanımlamak için yapım. Bu soruları gidermek için, biz eşleşti primer tanı nüks DBBHL örnek çiftlerinden birden çiftleri bizim VDJ-sıralama yaklaşımı uygulandı. Nüks İki farklı klonal evrim senaryoları tanı ve nüks samp arasındaki klonal mimarileri karşılaştırıldığında ortaya çıkanBirden moleküler mekanizmaları öneriyor les DLBCL nüks tutulabilir.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 kanıt, moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>TE tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris ve middot; Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Proteinaz K&nbsp;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Deoksinükleotid trifosfat (dNTP) Çözelti Karışımı</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>her nükleotid 10x</td></tr><tr><td>PCR Tamponu 10 mM;</td><td>Altın</td> Tamponlu <td>MgCl2</td><td></td></tr><tr><td>AmpliTaq Altın DNA Polimeraz içermeyen Roche 11699105001 ve MgCl2</td><td>Life Technonojiler</td><td>4311806</td><td>50 & mikro; l 5 U/&mikro'da; l</td></tr><tr><td>Numune Kontrol Boyutu Merdiveni</td><td>Invivoscribe Teknolojileri&nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33 reaksiyon</td></tr><tr><td>IGH Somatik Hipermutasyon Testi v2.0 - Jel Tespiti</td><td>Invivoscribe Teknolojileri&nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33 reaksiyon, IGVHFR1 tespiti için Karışım 2</td></tr><tr><td>IGH Gen Klonalite Testi - Jel Tespiti</td><td>Invivoscribe Teknolojileri&nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33 reaksiyon, IGVHFR2 tespiti için Tüp B</td></tr><tr>,<td>GoTaq Flexi DNA Polimeraz</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 ve mikro; l 5 U/&mikro'da; l</td></tr><tr><td>10X Tris-Borat-EDTA (TBE) tamponu</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50x TAE TAMPONU&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Etidyum bromür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg / ml</td></tr><tr><td>25 bp DNA Merdiven</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10597011</td><td>1 & mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>100 bp DNA Merdiven</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15628-019</td><td>1 &mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>%40 Akrilamid/Bis</td><td>Solüsyonu Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1610144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50 sütun</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Yüksek Hassasiyetli Test Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Florometre</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Yeniden süspansiyon tamponu (Illumina TruSeq DNA Örnek Hazırlama Kiti v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Son onarım karışımı (Illumina TruSeq DNA Örnek Hazırlama Kiti v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>A-kuyruk karışımı (Illumina TruSeq DNA Örnek Hazırlama Kiti v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ligasyon karışımı (Illumina TruSeq DNA Örnek Hazırlama Kiti v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>DNA adaptör indeksi (Illumina TruSeq DNA Örnek Hazırlama Kiti v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ligasyon tamponunu durdur (Illumina TruSeq DNA Örnek Hazırlama Kiti v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR primer kokteyli (Illumina TruSeq DNA Örnek Hazırlama Kiti v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR ana karışımı (Illumina TruSeq DNA Örnek Hazırlama Kiti v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Jel görüntüleme sistemi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-seq: b hücreli lenfoma klonal evrim patterns reveal rearranged İmmünglobulin ağır zincir gen derin sıralama analizi

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Anlama tümör klonalite tumorigenezden ve hastalığın ilerlemesi yer alan mekanizmaların anlaşılması için önemlidir. Buna ek olarak, belirli bir mikro-ortam veya uygulamaya yanıt olarak bir tümör içinde meydana klonal bir bileşim değişiklikleri anlama tümör hücrelerini yok etmek için daha gelişmiş ve etkili yöntem tasarımına yol açabilir. Ancak, izleme tümör klonal alt popülasyonları nedeniyle ayırt belirteçlerin eksikliği zor olmuştur. Bu sorunu çözmek için, bir VDJ seq protokol VDJ rekombinasyonu ve somatik hipermutasyona (SHM), B hücreli lenfomalarda iki benzersiz özellikleri istismar ederek diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) nüks klonal evrim modellerini izlemek için oluşturuldu. Bu protokolde, indeksleme potansiyeli ile Yeni Nesil sıralama (NGS) kütüphaneler birincil tanı ve nüks DLBCL samp çiftleri amplifiye yeniden düzenlenmiş immünoglobulin ağır zincir (IgH) VDJ bölgesinden inşa edildiles. Numune başına ortalama milyondan fazla yarısı VDJ dizileri VDJ yeniden düzenleme ve SHM bilgilerini bir arada bulunduran sıralama, sonra elde edildi On. Buna ek olarak, özel biyoinformatik boru hatları tamamen bu örneklerin içinde IgH-VDJ repertuar karakterizasyonu için sırası bilgilerini kullanmak için geliştirilmiştir. Ayrıca, boru hattı yeniden yapılanma ve tanı tümörlerinin tanı ve nüks tümör çiftleri arasındaki klonal evrim kalıpları düşüldükten içinde klonal heterojenite incelenmesini sağlayan bireysel tümörlerin klonal mimarisi, karşılaştırılmasına olanak sağlar. Birkaç tanı nüks çiftleri bu analizi uygularken, birden fazla ayırt edici tümör evrimsel modeller DLBCL nüks yol açabilecek önemli kanıtlar ortaya çıkardı. Ayrıca, bu yaklaşım, minimal rezidüel hastalığın tanımlanması, nüks ilerleme ve tedaviye yanıtı izlemek ve bağışıklık repertuarıyla soruşturma gibi diğer klinik yönlerini içine genişletilebilirolmayan lenfoma bağlamlarda es.

DNA izolasyonu da dahil olmak üzere VDJ sekanslama (VDJ seq), genel prosedür, işleme ve filogenetik analizi okur VDJ bölgesi amplifikasyon ve saflaştırma, sıralama belge konstrüksiyon rekombine, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Rutin 5-200 ug DNA alınabilir dondurulmuş katı doku bölümleri veya formalin ile fikse parafine gömülü doku bölümleri 0,5-20 mg DNA. Kalite, yeniden düzenleme desen, ve tek tek numunelerin SHM derecesine bağlı olarak, farklı örneklerden VDJ PCR ürünlerinin çeşitli elde edilebilir <...

Bu protokol, lenfomaların rekombine immünoglobulin ağır zincirli VDJ bölgelerini derin dizileme ile sorgulamak ve tek tek tümörün klonal mimarisini tanımlamak için VDJ yeniden düzenlemesini ve somatik hipermutasyon durumunu geri almak için bir yaklaşımı tanımlar. Eşleştirilmiş tanı ve nüks örnekleri arasındaki klonal mimarinin karşılaştırılması, lenfoma nüks klonal evrim modlarını ortaya çıkarır.

VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Bu prosedürün genel amacı, lenfoma nüksünün klonal evrim modellerini belirlemek için lenfoma örneklerinin klonal kompozisyonunu karakterize etmektir. Bu yöntem, nüks eden tümörlerin orijinal tümörlerden nasıl köken aldığı gibi lenfoma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajı, lenfoma ortaklıklarının daha kapsamlı bir şekilde haritalanmasına olanak tanımak için en güncel yüksek throughput sekanslama teknolojisini uyarlamasıdır.Bu protokolde, dondurulmuş OCT gömülü dokuların yanı sıra formalinle sabitlenmiş parafin gömülü normal veya malign dokuların ince kesitlerinden DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilecektir. İlk olarak, 10 ila 30 ince kesiti, protase K ve %0,625 SDS içeren 4 mL nükleik lizis tamponu içerisinde, 37 °C su banyosunda gece boyunca sindirin. Ertesi gün, sindirim karışımına 1 mL doygun 5 M sodyum klorür ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın, ardından 1.100 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Oda sıcaklığında, süpernatantı yeni bir 15 milliliter santrifüj tüpüne aktarın. İki hacim %100 etanol ekleyin, tüpü altı ila sekiz kez ters çevirerek karıştırın ve 4 °C'de 60 dakika boyunca 5,000 ×g'de santrifüjleyin. Çökelmiş DNA'yı toplamak için, DNA peletini iki kez %70 etanol ile yıkayın ve her seferinde 15 dakika boyunca 5,000 ×g'de santrifüjleyin.Formin ile fikse edilmiş parafin gömülü dokunun ince kesitlerinden DNA ekstraksiyonu yapmak için, DNA peletini 100 ila 400 microliters TE tamponu içerisinde oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca çözdürerek peleti toplayın. Öncelikle, parafin kesitlerini oda sıcaklığında, her seferinde 10 dakika süreyle iki kez bir milliliter ksilen içerisinde inkübe ederek deparafinize edin. Doku kesitlerini oda sıcaklığında 13, 000 times G hızda beş dakika santrifüjleyerek toplayın.Ardından, kesitleri oda sıcaklığında her seferinde 10 dakika boyunca bir mililitre %100 Ethanol içinde iki kez inkübe ederek kalıntı xylenleri uzaklaştırın. Doku kesitlerini 13.000 ×g hızında beş dakika santrifüj ederek toplayın. Kesitleri oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca havada kurutun.Taze hazırlanmış proteaz çözeltisini, numunelere 50 ila 100 microliters nihai hacme ulaşacak şekilde ekleyin ve 37 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin. Proteinazı inaktive etmek için numuneleri 95 degrees Celsius'de 10 dakika boyunca ısıtın. Önceki bölümde gösterilen ekstraksiyonlardan elde edilen DNA verimi, dokunun boyutuna bağlı olarak beş ila 200 micrograms arasındadır.Bir sonraki adım, bir PCR tüpü karışımı içindeki her bir DNA örneğinin kalitesini değerlendirmektir. Ticari bir ladder kitinden alınan 45 µL master mix ile 25 µL TDNA polimerazı birleştirin. PCR tüpüne beş µL DNA ekleyin ve pipetle en az beş kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın.DNA'yı protokol metninde detaylandırılan koşulları takip ederek amplifiye edin. Ardından, 20 µL PCR reaksiyonunu dört µL altı x yükleme boyası ile karıştırın ve %2'lik agaroz jele yükleyin. Elektroforez tamamlandığında agaroz jeli etidyum bromür ile boyayın ve PCR ürünlerini tespit edin.Bir jel görüntüleme sistemi ile, 100, 200, 300, 400 ve 600 baz çifti boyutlarında beş PCR ürünü veren örnekler, yalnızca VDJ amplikonları üretmek için kullanılacaktır. Bu videoda, framework bölgesi bir veya IGV HFR bir'den rekombine I-G-H-V-D-J segmentinin amplifikasyonu gösterilecektir. Framework bölgesi iki'den rekombine I-G-H-B-D-J segmentinin amplifikasyonu benzer bir prosedür izler ve bir PCR tüp karışımı içindeki protokol metninde açıklanmıştır.Ticari bir somatik IGH HİPERMUTASYON jel tespit kiti için "mix two" olarak etiketlenmiş tüpten 45 µL master mix, 0,25 µL TAC DNA polimeraz ve 5 µL örnek DNA ekleyin. DNA'yı, protokol metninde açıklanan koşullara uygun olarak amplifiye edin. Suboptimal DNA'yı amplifiye etmek için, tavlama süresi uzatılarak veya amplifikasyon döngü sayısı artırılarak PCR koşulları ayarlanabilir. Tüm PCR ürünlerini %2'lik AGROS jelde elektroforez ile ayırın. AGROS jeli 0,5 µg/mL etidyum bromür çözeltisi ile boyayın ve PCR ürünlerini tespit edin.Bir jel görüntüleme sistemi ile 310 ile 380 baz çifti boyut aralığında monoklonal bir amplikon elde edilmesi beklenir. Monoklonal amplikonu içeren jel kısmını kesin. Ardından, üretici protokolüne uygun olarak standart bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak kesilen jelden DNA'yı saflaştırın.Bu prosedüre başlamak için, saflaştırılmış V-D-J-P-C-R ürününü bir PCR tüpüne aktarın ve hacmi 60 µL'ye tamamlamak için DNA örnek hazırlama kitindeki Resus süspansiyon tamponunu ekleyin. DNA örnek hazırlama kitinden 40 µL uç onarım karışımı (end repair mix) ekleyip iyice karıştırın ve reaksiyonu, 100 °C'ye ısıtılmış kapağı olan önceden ısıtılmış bir termosayklerda 30 °C'de 30 dakika inkübe edin. Ardından, 1,5 mL'lik bir tüpte 136 µL manyetik boncuk ve 24 µL PCR sınıfı suyu karıştırın; uç onarım reaksiyonunun tamamını bu tüpe aktarın ve boncuk çözeltisiyle iyi karıştırın.Boncukların çözeltiden ayrılmasını sağlamak için tüpleri iki dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Süpernatantı aspire edin ve boncukları taze hazırlanmış %80 etanol ile iki kez yıkayın. Etanol çözeltisini tamamen aspire edin ve boncukların oda sıcaklığında 15 dakika boyunca havada kurumasını bekleyin.15 dakika sonra tüpleri manyetik standdan çıkarın ve boncukları 17,5 µL Resus Süspansiyon Tamponu içinde yeniden süspanse edin. Boncukları Resus Süspansiyon Tamponundan ayırmak için tüpleri iki dakika boyunca tekrar manyetik standa yerleştirin. Artık uç onarım ürününü içeren Resus Süspansiyon Tamponunu temiz bir PCR tüpüne aktarın.Bir sonraki adım, uç onarım ürününe a kuyruğu eklemektir. Uç onarım ürününü içeren PCR tüpüne 12,5 µL a kuyruklama karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. PCR tüplerini, kapağı 100 °C'ye ısıtılmış ön ısıtmalı bir termosiklet cihazında 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Adaptör ligasyonu için, a-kuyruklama reaksiyonuna 2,5 µL Resus süspansiyon tamponu, 2,5 µL ligasyon karışımı ve 2,5 µL DNA adaptör indeksi ekleyin. Reaksiyonu, kapağı 100 °C'ye önceden ısıtılmış bir termosiklet cihazında 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, her bir reaksiyona beş µL ligasyon durdurma tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.Her bir reaksiyona iyice karıştırılmış 42,5 µL manyetik boncuk ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi %80 etanol ile yıkayın. Adaptör ligasyon ürününü elüe etmek için 50 µL Resus süspansiyon tamponu ekleyin. Adaptör ligasyon ürününü, 50 µL iyice karıştırılmış ampu XP boncukları kullanarak ikinci kez temizleyin ve ürünü 25 µL Resus Süspansiyon Tamponu içinde temiz bir PCR tüpüne elüe edin.VDJ Amplikonu amplifiye etmek için, adaptör ligasyonu yapılmış ürünün bulunduğu PCR tüpüne beş µL PCR primer kokteyli ve 25 µL PCR master mix ekleyip iyice karıştırın ve amplifikasyonu protokol metninde belirtilen koşullarla bir termosikletörde gerçekleştirin. Amplifikasyon tamamlandığında, reaksiyonu 50 µL iyi karıştırılmış manyetik boncuk kullanarak temizleyin ve nihai ürünü 30 µL Resus Buffer ile elüe edin. VTJ Amplikon kütüphanesi daha sonra protokol metninde açıklandığı şekilde valide edilir, havuzlanır ve dizilenir.VVG sekanslama kütüphanesinin karmaşıklığı düşük olduğundan, doğru baz çağırmasını sağlamak için onaylanmış sekanslama örneklerine %20 ile %50 oranında spike-in eklenmesini öneririz. Bu temsili jel görüntüleri, lenfoma hasta örneklerinden ekstrakte edilen DNA'dan elde edilen V-D-J-P-C-R amplikon ürünlerini göstermektedir. V-D-J-P-C-R amplikonunun kütüphane kurulumu öncesindeki ve sonrasındaki kalitesi bir bioanalyzer ile değerlendirilmiştir.334 baz çiftinden 459 baz çiftine meydana gelen boyut değişimi, bir diffüz büyük B hücreli lenfoma nüks vakasının klonal evrimini izlemek için adaptörün eklendiğini göstermektedir. Tanı ve nüks örnekleri arasında, ana ağır zincir VDJ yeniden düzenlemelerinin somatik hipermutasyon veya SHM profillerinin filogenetik analizi gerçekleştirilmiştir.Geç diverjan klonal evrim modu gözlemlendi. Klonal evrimi görselleştirmek için yeni grafik yöntemleri geliştirildi. Gösterilen paternler, geç diverjan ve erken diverjan nüks modellerinin çok boyutlu ölçeklendirme grafikleridir.Her bir dairenin yarıçapı, belirli bir SHM profiline karşılık gelen alt klon sayısını belirtir. Mavi renk tanı örneğini, kırmızı renk ise nüks örneğini temsil eder. Benzer şekilde, yönsüz grafikler, geç diverjan vakadaki alt klon sayısı dağılımının erken diverjan vakadan farklı olduğunu göstermektedir.Kenarlar, bir harf ayrımı kadar dizgi mesafesine sahip iki SHM profiline karşılık gelir ve renk ölçeği çubuğu, kırmızı tanı örneğine veya sarı nüks örneğine karşılık gelen belirli bir SHM profiline eşleşen dizilerin oranını gösterir. Bu prosedürü uygularken, örnekler arası çapraz kontaminasyonlardan kaçınmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, lenfoma tümör örneklerinin kalitesinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu yaklaşım ayrıca minimal rezidüel hastalığı takip etmek ve kanserlere karşı immün sürveyans yanıtını incelemek için de kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

İnsan monoklonal antikorlarının sentezi, oto-antikor aracılı immün yanıtların patofizyolojik mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan çalışmaların ilk basamağıdır. B hücresi izolasyonu, antikor klonlaması ve in vitro sentez dahil olmak üzere kanla sınıflandırılmış B hücrelerinden rekombinant insan immünoglobulin G (IgG) monoklonal antikorları üretmek için bir protokol geliştirdik.

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Burada, klasik Hodgkin lenfoma (HRS) hücrelerinden Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) hücrelerinden yüksek kaliteli, tamamen exome veri üretmek üzere tasarlanmış, kombine bir akış sitometrik hücre sıralama ve düşük girişli, yeni nesil kütüphane yapılandırma protokolünü açıklıyoruz.

Klasik Hodgkin Lenfomalı Reed-Sternberg Hücrelerinin Akış-Sıralama ve Ekstraksiyon Sıralaması

Burada, biz ayrıntıları teknik özellikleri ve sağlam IG Gen Dizi Analizi hastalarda kronik lenfositik lösemi (CLL), emin olmak için temel gereksinimleri dayalı Avrupa araştırma girişimi birikmiş deneyim bir iletişim kuralı mevcut CLL (ERIC).

Kronik Lenfositik Lösemi içinde immünglobulin Gene dizi analizi: Sıra yoruma hasta malzemeden

Burada, analiz ve görselleştirme yapısı ve bütün antikor kapsayacağını Anayasası için iletişim kuralları açıklar. Bu büyük yeni nesil sıralama kullanarak antikor RNA dizisi edinimi içerir.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Burada, fare Peyer'in yamalarından germinal merkez B hücrelerini kullanarak immünoglobulin ağır zincir gen lokusu içindeki somatik hipermütasyonu ölçmek için bir test sunulmaktadır.

Fare Peyer Yamalarından Germinal Center B hücrelerinin JH4 intronunda Somatik Hipermütasyon Analizi

Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi

Bu video post-mortem gözünde, insan vitreus vücudunun çeşitli yarı saydam yapıların ayrılması ve diseksiyon için etkili bir teknik gösterir.

Proteomik Analizi İnsan Vitreus Gövde Elemanları diseksiyonu

Insan retinoblastom farelerde tümörlerin yaymak için bir yöntem açıklanmıştır. Tümör hücreleri bağışıklık eksikliği olan farelerde gözlerinin içine doğrudan enjekte edilir. İkincil tümörlerin başarıyla doğrudan insan tümörleri ve kültürlü tumorspheres hasat hücreler kullanılarak kurulmuştur.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Öğrenin, B hücreli lenfoma örneklerinde klonal evrim desenlerini ortaya çıkarmak için immünglobulin ağır zincir VDJ bölgelerinin derin dizileme analizini. Bu yöntem, tekrarlayan tümörlerin kökenini anlamaya yardımcı olur.

VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi

Daha fazla video keşfet