VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi

Bu prosedürün genel amacı, lenfoma nüksünün klonal evrim modellerini belirlemek için lenfoma örneklerinin klonal kompozisyonunu karakterize etmektir. Bu yöntem, nüks eden tümörlerin orijinal tümörlerden nasıl köken aldığı gibi lenfoma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajı, lenfoma ortaklıklarının daha kapsamlı bir şekilde haritalanmasına olanak tanımak için en güncel yüksek throughput sekanslama teknolojisini uyarlamasıdır.

Bu protokolde, dondurulmuş OCT gömülü dokuların yanı sıra formalinle sabitlenmiş parafin gömülü normal veya malign dokuların ince kesitlerinden DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilecektir. İlk olarak, 10 ila 30 ince kesiti, protase K ve %0,625 SDS içeren 4 mL nükleik lizis tamponu içerisinde, 37 °C su banyosunda gece boyunca sindirin. Ertesi gün, sindirim karışımına 1 mL doygun 5 M sodyum klorür ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın, ardından 1.100 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, süpernatantı yeni bir 15 milliliter santrifüj tüpüne aktarın. İki hacim %100 etanol ekleyin, tüpü altı ila sekiz kez ters çevirerek karıştırın ve 4 °C'de 60 dakika boyunca 5,000 ×g'de santrifüjleyin. Çökelmiş DNA'yı toplamak için, DNA peletini iki kez %70 etanol ile yıkayın ve her seferinde 15 dakika boyunca 5,000 ×g'de santrifüjleyin.

Formin ile fikse edilmiş parafin gömülü dokunun ince kesitlerinden DNA ekstraksiyonu yapmak için, DNA peletini 100 ila 400 microliters TE tamponu içerisinde oda sıcaklığında, bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca çözdürerek peleti toplayın. Öncelikle, parafin kesitlerini oda sıcaklığında, her seferinde 10 dakika süreyle iki kez bir milliliter ksilen içerisinde inkübe ederek deparafinize edin. Doku kesitlerini oda sıcaklığında 13, 000 times G hızda beş dakika santrifüjleyerek toplayın.

Ardından, kesitleri oda sıcaklığında her seferinde 10 dakika boyunca bir mililitre %100 Ethanol içinde iki kez inkübe ederek kalıntı xylenleri uzaklaştırın. Doku kesitlerini 13.000 ×g hızında beş dakika santrifüj ederek toplayın. Kesitleri oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca havada kurutun.

Taze hazırlanmış proteaz çözeltisini, numunelere 50 ila 100 microliters nihai hacme ulaşacak şekilde ekleyin ve 37 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin. Proteinazı inaktive etmek için numuneleri 95 degrees Celsius'de 10 dakika boyunca ısıtın. Önceki bölümde gösterilen ekstraksiyonlardan elde edilen DNA verimi, dokunun boyutuna bağlı olarak beş ila 200 micrograms arasındadır.

Bir sonraki adım, bir PCR tüpü karışımı içindeki her bir DNA örneğinin kalitesini değerlendirmektir. Ticari bir ladder kitinden alınan 45 µL master mix ile 25 µL TDNA polimerazı birleştirin. PCR tüpüne beş µL DNA ekleyin ve pipetle en az beş kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın.

DNA'yı protokol metninde detaylandırılan koşulları takip ederek amplifiye edin. Ardından, 20 µL PCR reaksiyonunu dört µL altı x yükleme boyası ile karıştırın ve %2'lik agaroz jele yükleyin. Elektroforez tamamlandığında agaroz jeli etidyum bromür ile boyayın ve PCR ürünlerini tespit edin.

Bir jel görüntüleme sistemi ile, 100, 200, 300, 400 ve 600 baz çifti boyutlarında beş PCR ürünü veren örnekler, yalnızca VDJ amplikonları üretmek için kullanılacaktır. Bu videoda, framework bölgesi bir veya IGV HFR bir'den rekombine I-G-H-V-D-J segmentinin amplifikasyonu gösterilecektir. Framework bölgesi iki'den rekombine I-G-H-B-D-J segmentinin amplifikasyonu benzer bir prosedür izler ve bir PCR tüp karışımı içindeki protokol metninde açıklanmıştır.

Ticari bir somatik IGH HİPERMUTASYON jel tespit kiti için "mix two" olarak etiketlenmiş tüpten 45 µL master mix, 0,25 µL TAC DNA polimeraz ve 5 µL örnek DNA ekleyin. DNA'yı, protokol metninde açıklanan koşullara uygun olarak amplifiye edin. Suboptimal DNA'yı amplifiye etmek için, tavlama süresi uzatılarak veya amplifikasyon döngü sayısı artırılarak PCR koşulları ayarlanabilir. Tüm PCR ürünlerini %2'lik AGROS jelde elektroforez ile ayırın. AGROS jeli 0,5 µg/mL etidyum bromür çözeltisi ile boyayın ve PCR ürünlerini tespit edin.

Bir jel görüntüleme sistemi ile 310 ile 380 baz çifti boyut aralığında monoklonal bir amplikon elde edilmesi beklenir. Monoklonal amplikonu içeren jel kısmını kesin. Ardından, üretici protokolüne uygun olarak standart bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak kesilen jelden DNA'yı saflaştırın.

Bu prosedüre başlamak için, saflaştırılmış V-D-J-P-C-R ürününü bir PCR tüpüne aktarın ve hacmi 60 µL'ye tamamlamak için DNA örnek hazırlama kitindeki Resus süspansiyon tamponunu ekleyin. DNA örnek hazırlama kitinden 40 µL uç onarım karışımı (end repair mix) ekleyip iyice karıştırın ve reaksiyonu, 100 °C'ye ısıtılmış kapağı olan önceden ısıtılmış bir termosayklerda 30 °C'de 30 dakika inkübe edin. Ardından, 1,5 mL'lik bir tüpte 136 µL manyetik boncuk ve 24 µL PCR sınıfı suyu karıştırın; uç onarım reaksiyonunun tamamını bu tüpe aktarın ve boncuk çözeltisiyle iyi karıştırın.

Boncukların çözeltiden ayrılmasını sağlamak için tüpleri iki dakika boyunca manyetik standa yerleştirin. Süpernatantı aspire edin ve boncukları taze hazırlanmış %80 etanol ile iki kez yıkayın. Etanol çözeltisini tamamen aspire edin ve boncukların oda sıcaklığında 15 dakika boyunca havada kurumasını bekleyin.

15 dakika sonra tüpleri manyetik standdan çıkarın ve boncukları 17,5 µL Resus Süspansiyon Tamponu içinde yeniden süspanse edin. Boncukları Resus Süspansiyon Tamponundan ayırmak için tüpleri iki dakika boyunca tekrar manyetik standa yerleştirin. Artık uç onarım ürününü içeren Resus Süspansiyon Tamponunu temiz bir PCR tüpüne aktarın.

Bir sonraki adım, uç onarım ürününe a kuyruğu eklemektir. Uç onarım ürününü içeren PCR tüpüne 12,5 µL a kuyruklama karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. PCR tüplerini, kapağı 100 °C'ye ısıtılmış ön ısıtmalı bir termosiklet cihazında 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Adaptör ligasyonu için, a-kuyruklama reaksiyonuna 2,5 µL Resus süspansiyon tamponu, 2,5 µL ligasyon karışımı ve 2,5 µL DNA adaptör indeksi ekleyin. Reaksiyonu, kapağı 100 °C'ye önceden ısıtılmış bir termosiklet cihazında 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, her bir reaksiyona beş µL ligasyon durdurma tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.

Her bir reaksiyona iyice karıştırılmış 42,5 µL manyetik boncuk ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi %80 etanol ile yıkayın. Adaptör ligasyon ürününü elüe etmek için 50 µL Resus süspansiyon tamponu ekleyin. Adaptör ligasyon ürününü, 50 µL iyice karıştırılmış ampu XP boncukları kullanarak ikinci kez temizleyin ve ürünü 25 µL Resus Süspansiyon Tamponu içinde temiz bir PCR tüpüne elüe edin.

VDJ Amplikonu amplifiye etmek için, adaptör ligasyonu yapılmış ürünün bulunduğu PCR tüpüne beş µL PCR primer kokteyli ve 25 µL PCR master mix ekleyip iyice karıştırın ve amplifikasyonu protokol metninde belirtilen koşullarla bir termosikletörde gerçekleştirin. Amplifikasyon tamamlandığında, reaksiyonu 50 µL iyi karıştırılmış manyetik boncuk kullanarak temizleyin ve nihai ürünü 30 µL Resus Buffer ile elüe edin. VTJ Amplikon kütüphanesi daha sonra protokol metninde açıklandığı şekilde valide edilir, havuzlanır ve dizilenir.

VVG sekanslama kütüphanesinin karmaşıklığı düşük olduğundan, doğru baz çağırmasını sağlamak için onaylanmış sekanslama örneklerine %20 ile %50 oranında spike-in eklenmesini öneririz. Bu temsili jel görüntüleri, lenfoma hasta örneklerinden ekstrakte edilen DNA'dan elde edilen V-D-J-P-C-R amplikon ürünlerini göstermektedir. V-D-J-P-C-R amplikonunun kütüphane kurulumu öncesindeki ve sonrasındaki kalitesi bir bioanalyzer ile değerlendirilmiştir.

334 baz çiftinden 459 baz çiftine meydana gelen boyut değişimi, bir diffüz büyük B hücreli lenfoma nüks vakasının klonal evrimini izlemek için adaptörün eklendiğini göstermektedir. Tanı ve nüks örnekleri arasında, ana ağır zincir VDJ yeniden düzenlemelerinin somatik hipermutasyon veya SHM profillerinin filogenetik analizi gerçekleştirilmiştir.

Geç diverjan klonal evrim modu gözlemlendi. Klonal evrimi görselleştirmek için yeni grafik yöntemleri geliştirildi. Gösterilen paternler, geç diverjan ve erken diverjan nüks modellerinin çok boyutlu ölçeklendirme grafikleridir.

Her bir dairenin yarıçapı, belirli bir SHM profiline karşılık gelen alt klon sayısını belirtir. Mavi renk tanı örneğini, kırmızı renk ise nüks örneğini temsil eder. Benzer şekilde, yönsüz grafikler, geç diverjan vakadaki alt klon sayısı dağılımının erken diverjan vakadan farklı olduğunu göstermektedir.

Kenarlar, bir harf ayrımı kadar dizgi mesafesine sahip iki SHM profiline karşılık gelir ve renk ölçeği çubuğu, kırmızı tanı örneğine veya sarı nüks örneğine karşılık gelen belirli bir SHM profiline eşleşen dizilerin oranını gösterir. Bu prosedürü uygularken, örnekler arası çapraz kontaminasyonlardan kaçınmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, lenfoma tümör örneklerinin kalitesinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu yaklaşım ayrıca minimal rezidüel hastalığı takip etmek ve kanserlere karşı immün sürveyans yanıtını incelemek için de kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.