Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, elektron taşıma zincirinin, TCA döngüsü beta oksidasyon yolunun ve substrat taşıyıcılarının işlevini değerlendirmek için mikroplaka tabanlı oksijen tüketimi teknolojisini kullanmaktır. Bu, önce tahlil için substrat ve enjeksiyon çözeltilerinin hazırlanmasıyla elde edilir. İkinci adım, oksijen tüketim makinesini kalibre etmek için enjeksiyon çözeltilerini önceden hidratlanmış bir trik tahlil kartuşuna eklemektir.

Daha sonra, mitokondriyal substrat çözeltilerini hazırlayın ve bu çözeltileri hücre kültürü plakasına yükleyin. Plakayı Respira metrik testine yüklemeden önce plakaya mitokondriyal yapışmayı sağlamak için hücre kültürü plakasını döndürün. Her bir respiro metrik test için mitokondriyal solunuma dayalı oksijen tüketim oranlarını gösteren cihaz sonuçları elde edilir.

Bu tekniğin Clark Elektrot gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, mikroplaka tabanlı teknolojilerin daha az miktarda mitokondri ile oksijen tüketiminin daha verimli ve daha yüksek verim elde edilmesine izin vermesidir, genellikle bu yönteme yeni olan bireyler, test için çözeltilerin hazırlanmasında yer alan tüm hareketli parçalar nedeniyle mücadele edeceklerdir. Deneyden önceki gece Hidrat trik tahlil kartuşu bir mililitre kalibrasyon çözeltisinde olmayan bir Ertesi gün 37 santigrat derecede CO2 inkübatörü, tüm donmuş sapları çıkarın ve 37 santigrat derece banyoda veya inkübatörde çözdürün. Tüm substrat çözeltilerini ve enjeksiyon çözeltilerini hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Bir sonraki adım, çok kuyulu oksijen tüketimi ölçüm makinesini uygun karışım ağırlığına ve ölçüm parametrelerine programlamaktır.

Analiz yazılımına girin ve standart modu seçin. Denizatı konuk forumuna girin ve tahlil sihirbazına tıklayın. Tahlil sihirbazına girdikten sonra, karışım ağırlığını değiştirmek ve parametreleri ölçmek için protokole tıklayın.

Arka düzeltme sekmesinin altındaki arka plan kutularını etiketleyin ve vurguladığınızdan emin olun. Arka plan düzeltmesi yapın. Önce gruplar ve etiketler sekmesine, ardından grup bilgileri sekmesine tıklayarak koşulları etiketleyin.

Bu parametreler girildikten sonra, sonlandır'a ve ardından şablonu kaydet'e tıklayın. Bu prosedüre başlamak için, enjeksiyon çözeltilerini bir tahlil çalıştırma kartuşuna yükleyin. Solüsyonları uygun bağlantı noktalarına enjekte etmeye özen gösterin.

Tahlil çalıştırma kartuşunu, sol altta çentikli bir köşe olacak şekilde makineye yükleyin. Önce analiz yazılımına ve ardından standart moda girerek kalibrasyonu başlatın. Denizatı konuk forumuna girin.

Şablonlar sekmesi altındaki XF Drive'ın altındaki kaydedilen şablonu açın. Açıldıktan sonra, yaklaşık 30 dakika sürecek olan kalibrasyonu başlatmak için başlat'a tıklayın. Bu prosedür için mitokondri, kırmızı iskelet kasından nazikçe izole edildi, ancak mitokondri substrat stoğunu karıştırarak, çözeltiyi ucunun yaklaşık üç milimetresi kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile hafifçe yineleyerek iyice karıştırdı.

Mitokondriyal stoğun protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, resus süksinat çürüklüğü bilinen substrat karışımının 200 mikrolitresi başına 10 mikrogram mitokondriyal proteini askıya alır. Mitokondri substrat solüsyonunu, aynı şekilde ucunun yaklaşık üç milimetresi kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucuyla hafifçe karıştırarak nazikçe ama iyice karıştırın. Reeses Band, kalan substrat karışımlarının her birinin 200 mikrolitresi başına 14 mikrogram mitokondriyal protein, tüm mitokondriyal protein substrat karışımlarını buz üzerine yerleştirir.

Buz üzerine 24 oyuklu bir hücre kültürü plakası yerleştirin ve mitokondri substrat karışımlarının her birinin oyuğu başına 50 mikrolitre üçlü yüke yerleştirin. Mikroplaka bazlı trik tahlilinin geliştiricileri, tercihen hücre kültürü plakasının her iki tarafında, mitokondri içermeyen en az iki boş kuyu bırakılmasını önermektedir. Plaka dönerken mitokondriyi kuyucuklara yapıştırmak için hücre kültürü plakasını 2000 G'de dört santigrat derecede 20 dakika

Alt tabaka çözeltilerini 37 santigrat derece su banyosunda ısıtın. Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, her bir substrat çözeltisinden 450 mikrolitreyi ilgili kuyucuklarının üzerine dikkatlice yükleyin. Plakayı oda sıcaklığında yüklediğinizden emin olun.

Boş kuyuları 500 mikrolitre boş alt tabaka ile yükleyin. Elektron akış tahlili için belirlenen kuyucuklar, elektron akış substratı ile yüklenmelidir, birleştirilmiş tahlil boş kuyucukları ise herhangi bir birleştirme tahlil substratı ile yüklenebilir. Her birine 450 mikrolitre substrat eklendikten sonra, mitokondrinin tek bir tek tabakada eşit olarak dağılmasını sağlamak için kuyudaki mitokondri tabakasını 20 x büyütmede iyi görüntüleyin.

Bu örnekte gösterildiği gibi, eşit olarak dağılmış bir tek tabakaya sahip gibi görünmeyen görüntü kuyucukları, oc sonrası kaldırılabilir. Mitokondriyal yapışmayı onayladıktan sonra, hücre kültürü plakasını Respir metrik tahlil cihazına götürün. Tamam'a tıklayın.

Makine, kalibrasyon için daha önce kullanılan yardımcı plakayı çıkaracaktır. Yardımcı plakayı çıkarın ve mitokondriyi içeren hücre kültürü plakasını tepsiye yerleştirin. Hücre kültürü plakasındaki mavi çentik, tepsinin sol alt köşesine yerleştirilmelidir.

Yaklaşık 40 dakika süren tahlil çalıştırmasını başlatmak için devam'a tıklayın. Çalışma tamamlandıktan sonra, hücre kültürü plakasını çıkarmak için ekrandaki eject düğmesine basın. Plaka çıkarıldıktan sonra, hücre kültürü plakasını ve kartuşu çıkarın ve atın.

Ekranda devam et'e basın. Çalıştırma, veri dosyasında otomatik olarak bir XLS dosyası olarak kaydedilecektir. Bu dosyayı açın ve Y bir işaretçinin altındaki aşağı oka basarak ekranı O2'den OCR'ye değiştirin.

Ardından, seçenek olarak görüntülenen oran verileri altında orta noktayı noktadan noktaya oranlara değiştirin. Tamam'a tıklayın. Bu değişiklikleri uygulamak için, benzer koşullara sahip kuyuları birlikte gruplandırmak için ekranın sol alt kısmındaki kuyu grubu modu sekmesine tıklayın.

Son olarak, ekranın ortasına doğru sola doğru örnek ortalama standart hata sekmesine tıklayın. Bu komutlar tahlilden önce de ayarlanabilir. Bu izlemeler, oksijen tüketim oranlarını veya OCR'ye karşı dört birleştirme testi için zamanı temsil eder.

İlk panel, ikinci durumu, bir DP'nin yokluğunda solunumu veya solunumu temsil eder. A DP'nin enjeksiyonundan sonraki ikinci panel, aynı zamanda durum üç solunumu olarak da adlandırılan maksimal birleştirilmiş solunumu temsil eder. Oligo misin enjeksiyonundan sonraki üçüncü panel. A, proton sızıntısına bağlı solunumu temsil eder ve aynı zamanda durum dört oh solunumu olarak da adlandırılır.

FCCP enjeksiyonundan sonraki dördüncü panel, aynı zamanda Durum üç U solunumu olarak da adlandırılan maksimum bağlanmamış solunumu temsil eder. Antimisin A enjeksiyonundan sonraki beşinci panel, oksidatif solunumun inhibisyonunu temsil eder. Tüm mitokondriyal durumlar, mitokondriyal stok ve mitokondri substrat karışımlarının tamamen karıştırılması ve yapışma dönüşünden sonra tek bir tek katmanlı mitokondri elde edilmesi nedeniyle minimum standart sapmaya sahiptir.

Buna karşılık, her bir oyuğa eşit olmayan mitokondri yüklenmesi ve tek bir tek mitokondri tabakasına ulaşılmaması, dakikada 1.500 ole'nin üzerinde OCR değerlerini gösteren Mavi iz ile gösterildiği gibi, her durumda standart sapmanın artmasına ve noktadan noktaya hız değerlerindeki düşüşle örneklenen ölçüm süresi boyunca azalan solunum hızlarına yol açar. Kırmızı izlemenin tutarlı noktadan noktaya hızlar gösterdiğini ve maksimum OCR değerlerinin dakikada 1.500 ole'nin altında olduğunu unutmayın. Mitokondriyal protein aşırı yüklenmesi ayrıca kuyunun mikro odası içindeki oksijenin tükenmesine yol açabilir, böylece ölçüm periyodu boyunca sıfıra yaklaşan O2 değerlerini gösteren Mavi İz ile gösterildiği gibi her ardışık ölçüm için OCR'nin doğru ölçümünü önler ve her ardışık ölçümden sonra önemli ölçüde azaltılmış başlangıç O2 değerleri.

Bu prosedürü denerken, mitokondri ve substrat çözeltilerini karıştırırken hasta bulundurmayı unutmamak önemlidir. Bu yöntemlere hakim olduktan sonra, belirli bir substrat taşıyıcısının ilaç hedefli tedavileri mitokondriyal oksijen tüketimini nasıl etkiler gibi ek soruları yanıtlamak için ek deneyler deforme edilebilir.