Name: Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Öğrenin fare iskelet kasından izole edilmiş mitokondri kullanarak yüksek verimli mikroplate solunum ölçümleri yapmayı. Bu yöntem metabolik adaptasyonları incelemek için etkili bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fralin Yaşam Bilimleri Araştırma Enstitüsü ve Virginia Tech'teki Metabolik Fenotipleme Çekirdeği bu çalışmayı destekledi.

NOT: Bir kırmızı iskelet kası mitokondri izole sonra Bu protokol başlar. Kırmızı iskelet kası 13, 100 mg - daha önce ~ 75 altında tarif edildiği gibi Mitokondri izole edilmiştir. Mitokondriyal protein 10 ug / ul mitokondri için izolasyon tampon ≤50 ul son mitokondriyal pelet (IBM) 2 (Frisard ve ark 13 bakınız) resuspending doku bu tutardan ulaşılacaktır - 5 arasında. 1. Kur <ol><li> Sonraki deneyleri için stok çözeltileri (Tablo 1) ve mitokondriyal tahlil çözeltisi (MAS) karışımları (Tablo 2) çalışma hazırlayın. Not: En stokları çözeltiler ve MAS saklanabilir gibi tahliller için hazırlık çoğu önceden yapılabilir. </li><li> 37 ° C &#39;de olmayan bir CO2 inkübatör içinde deneyden önce gece 1 mi kalibrasyon çözelti içinde respirometrik deney kartuşu hidratı. </li><li> Deney, t günlük37 ° C banyo veya inkübatör donmuş stokları (yüzeyler ve mitokondriyal modülatörleri MAS karışımı, MAS BSA o / w, Tablo 1) ve çözülme dışarı ake. </li><li> Tüm alt-tabaka solüsyon (Tablo 3) ve iğne (Tablo 4-5) hazırlamak ve (pH 7,4), arzu edildiği gibi pH ayarlamak. PH değeri ayarlandıktan sonra, buz üzerinde muhafaza edin. </li><li> Program, uygun karışımı, bekleyin ve ölçü parametreleri çok iyi oksijen tüketimi ölçüm makine ilk &quot;Standart&quot; modunda ardından analiz yazılımı, girerek ve etiket arka plan ve grup / durumu kuyular (Tablo 6 bakınız). <ol><li> &quot;Misafir&quot; forumunda giriniz ve &quot;Testi Sihirbazı&quot; üzerine tıklayın. Bir kez &quot;Deney Wizard&quot; olarak, karışımı değiştirmek bekleyin ve parametreleri ölçmek için &quot;Protokolü&quot; üzerine tıklayın. &quot;Geri altında arka plan kuyuları etiketleyin. Düzeltme &quot;sekmesine gidin ve vurgulamak için emin olun&quot; &quot;arka plan düzeltme yapın. </li><li> Etiket koşul&quot;Grup Info&quot; sekmesinin ardından &quot;Gruplar ve Etiketler&quot; sekmesine tıklayarak ilk tarafından itions. Bu parametreler girildikten sonra, &quot;Save Template&quot; ardından tıklayın &quot;End&quot;. </li></ol></li></ol> 2. Testi Çalıştır <ol><li> Bir tahlil çalıştırmak kartuşu içine enjeksiyon çözümleri yükleyin ve ilk &quot;Standard&quot; moduna girerek takip analiz yazılımı, girerek kalibrasyonu başlatın. &quot;Misafir&quot; forumunda giriniz. &quot;Şablonlar&quot; sekmesi altındaki &quot;XF&quot; sürücüsünün altında adım 1.5 kaydettiğiniz şablonu açın. Açık kez kalibrasyon başlamak için &quot;Başlat&quot; a tıklayın. Not: Tahlil çalıştırmak kartuş alt sol kesik köşesi makinenin içine girilmelidir. Bu yaklaşık 30 dakika sürer. Uygun liman içine enjekte çözüm için özen gösterin. Tablo 4-5 enjeksiyonları yükleme sırasına göre listelenir. </li><li> Yavaşça, ama iyice karıştırın mitochondnazikçe makas ile ucu ucuna kapalı ~ 3 mm keserek genişletmiştir onun deliği olmuştur 200 ul pipet ile stok triturating ardından 200 ul pipet ile çözüm karıştırılarak ria stok. </li><li> Mitokondriyal stokunun protein konsantrasyonu belirlemek için bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi gerçekleştirmek. </li><li> Aşama 2.3 elde edilen stok konsantrasyonu kullanarak, / sukinat / rotenon substrat karışımı 200 ul (Tablo 3), mitokondriyal protein 10 ug yeniden süspanse edin. Mitokondriyal protein 14 ug / kalan substrat karışımları 200 ul (Tablo 3) (Bu, her substrat karışımı için yapılmalıdır) tekrar süspansiyon. Tüm mitokondriyal protein / alt-tabaka buz karışımları yerleştirin. Not: Önceden 9 tarif edildiği gibi her bir deney için oyuk başına mitokondriyal protein optimal miktarı belirlenmiştir. Bu tespit edilmiştir piruvat / malat, palmitoil karnitin / malat, glutamat / malat birsüksinat / rotenone tahlil mitokondriyal protein 2.5 ug başına iyi kullanır iken d elektron akışı deneyleri, mitokondriyal protein 3.5 ug kullanır. Bu nedenle, araştırmacı 4 beri bu adımda çoğaltır için yeterli mitokondriyal protein tekrar süspansiyon gerekiyor ya 2.5 ug veya 50 ul başına 3.5 ug kuyu başına yüklenir (adım 2.6 bakınız). </li><li> Yavaşça, ama iyice hafifçe sonu ~ 3 mm olmuştur 200 ul pipet ile stok triturating ardından 200 ul pipet ile çözüm karıştırılarak mitokondri / substrat çözümleri karıştırın kesti. </li><li> Yük 50 ul / oyuk mitokondri / substrat karışımı her biri buz üzerinde ve üç kopya halinde bir hücre kültür plakası yerleştirin. Mikro-bazlı respirometrik tahlilin geliştiriciler, tercihan, hücre kültür plakası üzerine iki tarafında, iki boş (mitokondri) kuyu en az bırakarak önerilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 2000 g&#39;da hücre kültürü plakası dönerler. Plaka s ikeniğneleme, 37 ° C su banyosunda substrat çözümleri ısınmak. </li><li> Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde, ilgili haznelerin üstüne her bir taban çözeltisi 450 ul yük (örneğin, başlangıçta bu alt-tabaka çözeltisi içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş mitokondri sahip oyuklara piruvat / malat substrat yük). RT&#39;de plaka yüklemek için emin olun. Not: Boş kaplar alt-tabaka 500 ul ile yüklenmiş olması gerekir. Birleştirilmiş bir deney boş oyukları birleştirme deneyi, substrat ile yüklenebilir ise elektron akışı analizi için belirlenmiş Boş kaplar, elektron akışı alt-tabaka (Piruvat / Malat + FCCP) ile yüklenmiş olması gerekir. Not: Aynı plaka üzerinde akuple ve elektron akış deneyleri gerçekleştirmek Eğer tahlil çalıştırmak &quot;Enstrüman&quot; sekmesinden &quot;XF Reader&quot; platformu kullanarak tamamlandıktan sonra, araştırmacı ilgili deneyleri arka plan kuyuları yeniden atamanız gerekir. Bir kez &quot;Enstrüman&quot; ortamında, &quot;Administration&quot; linkine tıklayın&quot;Arkaplan Düzeltme&quot; takip sekmesi. Tamamlandığında Hit &quot;Cihaz Kurulumu Mode End&quot;. Askorbat / TMPD kombinasyonu böylece ayrı bir arka plan düzeltmesi her tahlil türü için gerekli olan O 2, tüketmek olmasıdır. </li><li> Alt-tabakanın 450 ul her bir göze ilave edildikten sonra, mitokondri, tek tek tabaka içinde muntazam bir şekilde dağılmış olduğundan emin olmak için iyi bir mitokondri katmanı görüntülemek (20X büyütme [Rogers 9 Bakınız, Şekil 4]). Bir eşit dağıtılmış tek tabaka var görünmüyor Wells sonrası hoc kaldırılabilir. </li><li> Mitokondriyal bağlılık için kontrol ettikten sonra, respirometrik tahlil aracı haline mikroplağı yerleştirin ve &quot;Tamam&quot; tıklayarak çalıştırın tahlil başlayın. Not: run başlayacak önce adım 2.1 kalibrasyon eksiksiz olmalıdır. Araştırmacı &quot;Tamam&quot; tıkladığında, makine kalibrasyonu için kullanılan bir yardımcı programdır plakasını çıkarır. <ol> &lt;li&gt; yarar plakasını çıkarın ve tepsiye mitokondri içerir hücre kültürü plakasını yerleştirin. Hücre kültürü plaka üzerinde mavi çentik kasetin sol alt köşesine yerleştirilmelidir. Tahlil çalışmasını başlatmak için &quot;devam&quot; üzerine tıklayın. </li></ol></li><li> Çalışma tamamlandıktan sonra, ekranda &quot;Çıkart&quot; düğmesine basarak hücre kültürü plakasını ve kartuşu çıkarın. <ol><li> Plaka atılır sonra, kaldırmak ve hücre kültürü plakasını ve kartuşu atmak ve ekranda &quot;Devam&quot; butonuna tıklayınız. Run otomatik olarak &quot;Veri&quot; dosyasında bir .xls dosyası olarak kaydedilecektir. </li></ol></li><li> Bu dosyayı açın ve altındaki aşağı ok vurarak &quot;OCR&quot; ile &quot;O2&quot; dan görüntüsünü değiştirmek &quot;Y1:&quot; işaretleyici. <ol><li> Seçeneği altında: Sonraki değişiklik için &quot;Noktadan Noktaya Oranları&quot; &quot;Middle Point&quot; &quot;Oranı Verileri görüntüleniyor&quot;. Bu değişiklikleri uygulamak için &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol&gt; </li><li> Birbirine benzer koşullar grup kuyuları için ekranın alt solunda &quot;Eh Grubu Mode&quot; sekmesini tıklayın. Son olarak, sola, ekranın ortasına doğru &quot;Örnek Ortalama / Standart Hata&quot; sekmesine tıklayın. Tahlil &quot;Tahlil Sihirbazı&quot; ayarı başlamadan Alternatif olarak, bu komutlar kurulum olabilir. Not: Her koşul her oranda ve her durum için görüntülenen ± standart sapma bir ortalama olacaktır. Durum (Devlet 2 [Kavrama] / State3u [Elektron Akışı] solunum dört enjeksiyonları takiben) başına alınan hızı ölçümleri vardır. , Enjeksiyon oligomycin sonra asgari noktada State 4o belirlemek, ikinci ölçüm Devlet 2 oranının ortalamasını kullanın sırasıyla ADP ve FCCP enjeksiyonu, sonra Devlet 3 ve Devlet 3U için maksimum noktası kullanmak ve Antimycin A için minimum noktası kullanmak Kavrama Tahliller için indüklenen solunum. Minimum kullanmak, piruvat / malat kaynaklı Devlet 3u solunum için maksimum noktası kullanınrotenone kaynaklı solunum için gelin, süksinat kaynaklı Devlet 3u solunum için maksimum noktası kullanmak ve Elektron Akış analizi için Antimycin bir neden olduğu solunum için minimum noktasını kullanın. Bütün deneyler 3 kez yapıldı ve gösterilen veriler temsili bir izleme sonuçlarıdır. </li></ol>

<ol><li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+muscle+mitochondrial+DNA+content%2C+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man%3A+alterations+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Applied+Physiology+and+Occupational+Physiology%22%5BJournal%5D)">Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).</li>
<li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li>
<li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance%2C+metabolic+flexibility%2C+and+mitochondrial+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).</li>
<li>Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2014).</li>
<li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746(2011).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzymology+and+Related+Subjects+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Mitochondrial pathways and respiratory control. Gnaiger, E. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. (2007).</li>
</ol>

George W. Rogers, bu deneyleri geliştirildi hangi cihazı üretmektedir Seahorse Bioscience bir çalışanıdır.

Fare iskelet kası 100 mg - Bu makalede sunulan yöntemler 75 izole edilen mitokondri kullanarak mikroplaka bazlı Respirometrik tahlillerin bir koleksiyon performansı için adım adım yönergeler sağlar. Üç kopya halindeki gözlerin arasında sıkı standart sapma ile kanıtlandığı gibi Bu deneyler, yüksek bir kesinlikle gerçekleştirilebilir. Önemlisi, bu Respirometrik deneyler anormallikler ve / veya uyarlamalar yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde ETC, TCA döngüsü, β-oksidasyon yolu, alt tabaka taşıyıcılar, vb meydana olabilir nerede saptayarak izin verir. Bu protokolde kullanılan çeşitli yakıtlar ve inhibitörleri kullanım gerekçesini vurgulamak önemlidir. Piruvat / malat ve glutamat / malat respirometrik deneyler Kompleks I aracılı solunum değerlendirmesi ve aynı zamanda bunların ilgili taşıyıcılar değerlendirilmesi için izin verir ve glutamat durumunda deaminaz 15. Seçenek olarak ise, kombinerotenone karmaşık I inhibe eder ve süksinat flavin adenin dinükleotid azaltılması yoluyla Kompleks II&#39;nin elektronları sağladığı süksinat / rotenone (FADH 2) 15 ETC Kompleksi II ile mitokondriyal solunum akının değerlendirilmesini sağlar. Bu deneyler kavrama verimliliği ve maksimal solunum olarak substrat özgü bilgiler sağlar. Elektron akış deneyi substratları ve önleyicilerinin kombinasyonu mitokondriyal solunum akı 9 sırasında birden fazla kompleksleri değerlendirilmesi için izin vermesidir eşsizdir. Süksinat ardından rotenone enjeksiyon Kompleksi II tarafından tahrik değerlendirme maksimum solunum için izin verirken piruvat / malat + FCCP ilk substrat karışımı, Kompleks I tarafından yönlendirilen maksimal solunum değerlendirilmesi için izin verir. Askorbat enjeksiyonu takiben Antimycin A enjeksiyonu, Kompleks III inhibitörü, / TMPD Askorbat yana Kompleks IV ile tahrik edilen solunum değerlendirilmesine olanak tanır / TMPD is anSitokrom C / Kompleks IV elektron verici. Bağlama verimliliği hiçbir bilgi elde edilirken, yöntem bağımsız birden fazla alt tabakaları çalışan engel çok küçük örneklem büyüklüğü için idealdir. Son olarak, palmitoil karnitin / malat kullanılması β-oksidasyon ve palmitik asit (β-oksidasyon) oksidasyonu sonucunda ortaya çıkan indirgeme eşdeğer beri ETC arasındaki koordinasyon değerlendirilmesi için izin verir flavoprotein 15 aktarma elektron yoluyla ETC besleyen. Bu bağlama ve elektron akış deneyleri, aynı zamanda, bazı müdahale nedeniyle (ilaç tedavisi, genetik manipülasyon) mitokondriyal fonksiyon değişiklikleri tespit etmek üzere birbiri ardında olarak kullanılabileceği unutulmamalıdır. Bu tahliller için elde yüksek hassasiyetli protein tayini, ya da alt-tabaka çözeltiler ile önceden olup, mitokondri iyice karışması yatmaktadır. Bu doğrultuda, mitokondri kez substrat solutio içinde resuspendend edilirns, bu genişletilmiş bir menfez pipet ile Aşama 2.2 de tarif edildiği gibi hücre kültür plakası yüklemeden önce iyice Bu çözelti karıştırmak için kritik öneme sahiptir. Mitokondri karıştırmak için Başarısızlık iyice tahlil içinde büyük değişime yol açacaktır. Buna ek olarak, mitokondri karıştırma ve süre kesme kuvvetleri yaratacak dar delikli bir pipet kullanarak yapışma adım (2.7) de bu protokolü önemli bir adımdır mitokondriyal membranlar ve Sitokrom C salınımını zarar potansiyelini artırır. Uzun / yeterince hızlı yüklenen hücre kültürü plakasını dönmeye Başarısızlık böylece kuyu ve ölçümler arasında artan değişkenliği lider, kuyuya mitokondri eksik bağlılık neden olacaktır. Hisse senedi ve yüzey çözümleri yapmak için doğru konsantrasyonları / hazırlama yöntemleri kullanılarak, başına iyi mitokondriyal protein optimum miktarda yükleme tahlil çalıştırmak değiştirerek mitokondriyal devlet pla sağlamak için: açıklanan protokol içerecek şekilde optimize edilmiştirteaus ve mitokondriyal stok ve mitokondriyal / substrat karışımları uygun karıştırma. Bu optimizasyon çalışmalarından önce, yazarlar tahlil vadede tuzaklar karşılaştı. Aşağıdaki sorun giderme yöntemlerini / bu protokolü optimize yararlı değişiklikleri tartışıyor. Microchamber içindeki oksijeni dışarı atmasını sağlar ve ölçümde yol açacaktır çok mitokondri yüklenirken optimal yüklenmesi ile ilgili olarak, yükleme çok az mitokondri, güçlü bir yanıt ortaya çıkarmak olmaz. Rogers ve diğerleri 9 mikroplaka göre respirometrik deneyleri için oyuk başına mitokondri optimal yükleme miktarını belirlemek örnekleri sağlar. Daha sık, çok fazla mitokondri başına yüklenen sıra devlet tarafından kanıtlanan 2 oranlarını 100-200 pmol / dakika boyunca / kuyu ve devlet 3 oranlar&gt; 1500 pmol / dak / kuyu olduğunu. (. - 10 ug, örneğin 1 arasında) dinamik r içindeki OCRs ortaya çıkarmak için üzerinde yükleme oluşursa, mitokondriyal protein konsantrasyonu değişen bir deneyi gerçekleştirmekoksijen tüketimi ölçüm makinesinin ange. Hazırlanması ve yüzeylerde ve stokların doğru konsantrasyonları kullanılarak büyük önem taşımaktadır. Her alt-tabakalar / enjeksiyon asit formunun kullanımı ve potasyum hidroksit ya da HCI ile pH ayarlamak; Sodyum tamponları / çözüm tavsiye edilmez. Buna ek olarak, resuspending yüzeyler / DMSO veya% 100 etanol içinde stokları ölçüm hatası veya hata neden olur. Not nerede% 95 etanol kullandığınızdan emin olun. Bu palmitoil karnitin ve böylece büyük bir değişkenlik neden dondurulmuş stok çözündürüldükten sonra% 95 etanol içinde çökelmeye yaygındır. Kullanmak için iyi önce palmitoil karnitin stok ve girdap ısınmak emin olun. Buna ek olarak, bir çok değişken piruvat / malat tahlil sonucu nedeniyle 2 hafta eski piruvat stok varlığa&gt; olabilir. Pirüvat dondurulmuş alikotları 2 haftada yeniden emin olun. Tahlil çalıştırmak mitokondriyal devlet yaylaları sağlamak için 2-min ölçümlerine güncellenmiştir. ADP tüketilmesi gözlem isteniyorsa, araştırmacı olabilir&quot;Deney Sihirbazı&quot; forumun altında &quot;Protokol&quot; sekmesi altında ölçüm süresini uzatmak. Son olarak, büyük değişkenlik mitokondriyal hisse senedi ve mitokondrinin artı alt tabakanın çözümleri yükleme tam öncesinde homojenize değildir oluşur. Kuyular arasındaki değişkenlik tahlil çalıştırdıktan sonra yüksek ise, tam öncesinde bir sonraki deneyde substrat çözüm karıştırmak emin olun. Asla mitokondri / substrat çözümleri vorteks yerine, püre karıştırın ve nazikçe genişletilmiş menfez pipet ile çiğnemek. Fazlalaştı olan bu tekniğin bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, bu deneyler için kullanılan hücre kültürü levha üzerindeki kuyu sayısı nispeten düşüktür (yani., 24 kuyu ve boş kuyu için belirlenmiş en az 2). Bu bir plaka üzerinde, bu tahlillerde tüm 5 gerçekleştirmek için arzu edildiği takdirde, araştırmacı bir seferde sadece bir fare yanıtları incelemek edebilmektedir. Bununla birlikte, 96 gözlü araçlar highe için uygun olduğuna dikkat edilmelidirr çıktı. İkincisi, bozulmamış hücrelere 1 ile karşılaştırıldığında izole mitokondri mitokondriyal disfonksiyon değerlendirilmesi doğasında güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bazı zayıflıklar bozulmamış hücreler ve izolasyon süreci uyaran eserler ile karşılaştırıldığında daha az fizyolojik alaka sahip bulunmaktadır. Son olarak, bu yöntemin başarısı mitokondriyal izolasyon sürecinin kalitesi bağlıdır. Bu deneylerin bir kısmını ya da farklı sistemlerde geliştirilmiştir ve diğer hayvan modellerinde doğrulanmıştır olmasına rağmen, burada sunulan metotlar, bir çok-çukurlu oksijen tüketimi ölçüm makinesi kullanılarak farede en iyi kullanım için yukarıda bahsedilen deneylerde tüm sentez ilk sırada iskelet kas. Böylece çok az malzeme ile yüksek verim sağlayan bir fare iskelet kasının 100 mg - Daha da önemlisi, bu tahlillerin tümüne 5 ~ 75 izole mitokondri miktarı ile gerçekleştirilebilir. Büyük öneme, çok çukurlu yeteneği arasındaoksijen tüketimi teknolojileri optimize edilmiş bir izolasyon yönteminin ile birleştirilmiş mitokondri minimal miktarlarda ile analizi gerçekleştirmek için, bir araştırmacı, iskelet kas dokusunda geri kalan diğer deneyler (örneğin., Western lekeleme çok sayıda gerçekleştirmek için olanak sağlar, RT-PCR, enzimatik deneyler, sık sık bu hayvan modeli ile bir mücadele vb). Sonuç olarak, burada sunulan yöntemler fare iskelet kası minimal miktarlarda kullanılarak mikroplaka bazlı Respirometrik tahlillerin bir koleksiyon performansı için adım adım yönergeler sağlar. Önemli olarak, sunulan yöntemler doku ve mitokondri az miktarlarda gerektirir. Hakim sonra, burada tarif edilen teknikler araştırmacılar sıklıkla kullanılan bir hayvan modeli mitokondriyal oksijen tüketimi bir bileşik ya da bir gen ürünün muhtemelen mekanizmasını belirlemek için izin verir.

İskelet kası mitokondri ana fizyolojik rolü oksidatif fosforilasyon 1 ATP üretmektir. Önemlisi, iskelet kası mitokondrinin 3, dejeneratif hastalıkları 4 ve Tip II diyabet 5 yaşlanma, egzersiz kapasitesi 2 belirli bir rol oynamaktadır. Yaşlanan bir toplum ve Tip II Diyabet ABD&#39;de 6 ölüm 7. önde gelen nedeni olarak, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek yöntemlere ihtiyaç biyomedikal araştırma 7,8 giderek daha yaygın hale gelmiştir. Oksidatif fosforilasyon 9 fonksiyonel bileşenlerini ifade mitokondriyal ve nükleer genom koordineli fonksiyonunu temsil beri Özellikle, oksijen tüketiminin ölçülmesi mitokondriyal fonksiyon değerlendirilmesinde olağanüstü yarar vardır. Çeşitli teknolojiler bu sağlam hücrelerde oksijen tüketiminin ölçümü sağlar ve izole bulunmamaktad mitokondri 7-10. Buna ek olarak, deneyler, birden fazla hücre tipi ve dokusunda için geliştirilen ve mitokondriyal yolları ve solunum kontrolü 9,11,12 ölçümüne imkan veren türün çeşitli edilmiştir. Bununla birlikte, mikro-tabanlı oksijen tüketimi teknolojileri kullanım için fare iskelet kasından izole mitokondri kullanarak bu tahlillerin tümüne derlenmesine açısından literatürde void vardır. Önemlisi, mikroplate bazlı Respirometrik tahlillerin kullanılması mitokondriyal biyologlar arasında büyüyen ve izole mitokondri 9 minimal miktarlarda kullanılarak yüksek verimli ölçümler için izin verir. Bu nedenle, mikroplate bazlı Respirometrik tahliller bir koleksiyon anormallikleri ve / veya uyarlamalar elektron taşıma zinciri (ETC) meydana olabilir nerede saptayarak izin veren geliştirilmiştir. Buna ek olarak, iki ilave mikroplaka göre respirometrik deneyler koordinasyon değerlendirme betwee etkinleştirmek geliştirilmiştirtrikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve OGS ve ß-oksidasyon ve VB ile n Önemlisi, sunulan yöntemlerin yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal fonksiyon mekanik değişiklikleri ölçmek için bir açık ve özlü bir yol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>RT</td></tr><tr><td>D-Mannitol'de</td> saklayın <td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>RT'de saklayın</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik, minimum% 99.0</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td>RT'de saklayın</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür heksahidrat, ACS reaktifi,% 99.0-102.0</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>RT HEMES'te saklayın</td></tr><tr><td>minimum% 99.5 titrasyon</td><td>RT'de Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Mağazası</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>RT'de</td></tr><tr><td>Mağaza Esasen Yağlı&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>Mağazası 4 > C</td></tr><tr><td>Asit İçermez - BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirüvik Asit,% 98</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>4 & ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Süksinik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td> RT <td></td></tr><tr><td>L (-) Malik Asit, BioXtra, vb.'de saklayın; %95</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>RT'de saklayın</td></tr><tr><td>L-Glutamik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>RT'de saklayın</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametil-p-fenilendiamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>RT'de saklayın</td></tr><tr><td>%99, toz [TMPD]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palmitoil L-karnitin klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>-20 °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Oligomisin A, &ge;% 95 (HPLC)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>2 - 8 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>fenilhidrazon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; % 98 (TLC), toz [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Streptomyces sp.'den antimisin A.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Mağazası -20 > C</td></tr><tr><td>Adenozin 5&asal;-difosfat monopotasyum tuzu dehidrat [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>-20 °C'de saklayın; RT</td></tr><tr>Pierce & <td>trade'de</td>C<td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td> Mağazası</tr><tr><td>; BCA Protein Test Kiti&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel</td><td>23225</td><td>N / A</td></tr></tbody></table>

yüksek verim mikroplate solunum Ölçümler fare İskelet kası minimal miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

İskelet kası mitokondrileri birçok hastalık patolojisinde spesifik bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, bu dokudaki mitokondriyal fonksiyonun bir göstergesi olarak oksijen tüketiminin ölçümü daha yaygın hale gelmiştir. Çeşitli hücrelerde, dokularda ve türlerde mitokondriyal solunum yollarını ölçen birçok teknoloji ve test mevcut olmasına rağmen, mikroplaka bazlı teknolojilerde kullanılmak üzere fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak bu testlerin derlenmesi ile ilgili olarak literatürde şu anda bir boşluk bulunmaktadır. Daha da önemlisi, mikroplaka bazlı respirometrik tahlillerin kullanımı, minimum miktarlarda izole mitokondri kullanarak yüksek verimli ölçümlere izin verdiği için mitokondriyal biyologlar arasında artmaktadır. Bu nedenle, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları değerlendirebilen bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonu geliştirilmiştir. Burada sunulan yöntemler, bu tahlilleri optimal miktarda mitokondriyal protein ve reaktiflerle ve her bir tahlilin dinamik aralığı boyunca minimum varyans ile kanıtlandığı gibi yüksek hassasiyetle gerçekleştirmek için adım adım talimatlar sağlar.

Şekil 1 piruvat / malat, süksinat / rotenone, palmitoil karnitin / malat ve glutamat / malat deneyler (Kavrama Tahliller) için oksijen tüketimi oranlarını (OCR) temsil eder. Bu tahlil iz, Oksijen Tüketimi Oranı veya OCR, vs zaman olarak gösterilir arka correceted edilir ve noktadan noktaya oranları olarak görüntülenir. Her panel Şans ve Williams 14 tarafından açıklandığı gibi farklı mitokondriyal devletlerde oksijen tüketimini gösterir. Birinci panel, ADP enjeksiyonundan sonra bazal oksijen tüketimi ya da State 2. ikinci panel, temsil eden oligomycin enjeksiyonu (Karmaşık V inhibitörü) sonra, maksimal birleştiğinde solunum ya da State 3. Üçüncü paneli temsil nedeniyle solunum temsil proton sızıntısı, ya da Devlet 4o için. Dördüncü panel FCCP enjeksiyonundan sonra, maksimum Kuplajsız solunum veya Devlet 3U temsil eder. Son olarak, beşinci paneli Antimycin A enjeksiyonundan sonra, oksidatif solunumun engellenmesini gösterir. Özellikle, arkl mitokondriyal devletler minimal standart sapma var. Bu mitokondriyal stok ve mitokondri / substrat karışımları ve bağlılık dönüş (Adım 2.6) sonra mitokondri tek tek tabaka ulaşma kapsamlı karıştırma kaynaklanmaktadır. Öte yandan, her bir göze olup mikrolevhanın oyuk mitokondri tek tek tabaka elde eşit olmayan mitokondri yükleme Şekil 2 &#39;de gösterildiği gibi, her bir durumda, standart sapma sebep olur. Her mitokondriyal devlet ve her alt tabaka için Şekil 1 ekran yaylalarda iz. İki ölçüm döngüsünden sonra elde plato iyi mitokondriyal kalitesini göstermektedir ve mitokondri tahlil süresince de uyulması kalması. Bu sayede oluşabilecek önyargı azaltarak, araştırmacı bu mitokondriyal devletlerin ortalama OCR almasına izin veriyor çünkü ek olarak, plato maksimal oranları ulaşılması daha arzu edilebilirkeyfi bir noktaya seçerek. Oyuk başına mitokondri miktarı optimizasyonu çalışmalarla belirlenmiştir. Oyuk başına mitokondri optimum miktar, State sonuçlanmalıdır 100-200 pmol / dak / oyuk ve devlet 3 oranları &lt;2 ila oranları 1500 pmol / dak / oyuk, bu değerler, çok oyuklu oksijen dinamik oksijen algılama aralıkta olması nedeniyle tüketim ölçüm makinesi. Kuyu başına çok mitokondriyal protein yüklenmesi. Enstrüman (Şekil 3A) dinamik aralığın dışında OCRs neden (3 kuyu başına mitokondriyal protein yüklenmesi 2.5 ug göre kuyu başına mitokondriyal protein (mavi izleme) ve 3.5 ug yükleniyor tasvir kırmızı Şekil olabilir süksinat / rotenone tahlil için) izleme. Kuyu başına çok mitokondriyal protein yüklenmesi de böylece birbirini izleyen ölçümü 9 (Şekil 3B &lt;OCR doğru ölçümü engelleyen, kuyunun microchamber içinde oksijenin tükenmesi yol açabilir/ strong&gt;). Noktadan noktaya OCR OCR değişim anlık oranıdır. Düz ise, OCR / sabit kararlı olduğunu, ancak azalan, sonra bir biyolojik veya teknik bir sorun olabilir. Devlet 3 Devlet 3u solunum (Şekil 3A) OCR dik düşüş ölçümü (Şekil 3B) sonundan önce oksijen kaynağı yorucu mitokondri neden olur. Şekil 4, elektron akışı analizi için zamana karşı OCR temsil eder. Şekil 1 için tarif edildiği gibi izleme giderilmiştir ve görüntülenir. Bu deneyde ilk panel ikinci panel, rotenone enjeksiyonundan sonra, kompleks I aracılı solunum inhibisyonu Kompleks I ile piruvat / malat Devlet 3u solunum temsil eder. Üçüncü paneli, süksinat enjeksiyonundan sonra, elektronlar Kompleks II&#39;nin (Site II aracılı solunum) de ETC girerek substrat uyarılan Devlet 3U temsil eder. Antim enjeksiyonundan sonra dördüncü panelgentamisin A, Kompleksi III ve böylece toplam solunum inhibisyonu temsil eder. Son olarak, beşinci paneli, askorbat / TMPD enjeksiyonundan sonra, Kompleks IV aracılı solunum temsil eder. Şekil 1&#39;de traselerine benzer tüm mitokondriyal devletler minimal standart sapma var ve her oran bir plato ulaşmıştır neredeyse vardır ya. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Şekil 1. Birleştirme Deneyleri (A). 10 mM piruvat / 5 mM malat, (B), 10 mM süksinat / 2 uM rotenon, (C) 40 uM palmitoil karnitin / 1 mM malat ve (D) 10 mM glutamat / 10 mM oksijen tüketimi, çok oyuklu ölçümü ile tespit edildiği üzere, malat mitokondriyal solunum deney trase bağlanmış. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Kuyu başına yüklenen Mitokondriyal protein süksinat / rot dışındaki tüm analizleri için 3.5 ug oldumitokondriyal protein 2.5 ug göz başına kullanan enon. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Piruvat; SUCC = Süksinat; ROT = Rotenone; PAL-C palmitoil karnitin =; GLUT = glutamat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Şekil 2. Yüksek derecede Değişken Piruvat / Malat Deneyi. Eksik ve böylece değişken mitokondriyal pro yol alt tabaka / MAS karışımı mitokondriyal stoktan mitokondri karıştırma kaynaklanan yüksek değişken 10 mM piruvat / 5 mM malat tahlilHer oyuktaki tein yükleme. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 3,5 ug idi. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; PYR = Piruvat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Sukinat / Rotenone Testi için Şekil 3. Aşırı Mitokondriyal Protein. (A) kuyu başına mitokondriyal protein (mavi izleme) ve 3.5 ug yükleyerek neden çok iyi oksijen tüketimi ölçüm makinesinin dinamik aralığının dışında Oksijen tüketimi oranları kuyuda (kırmızı izleme) başına mitokondriyal protein yüklenmesi 2.5 ug göre. (B ) Oxyaklaşan gerginlik yGen sıfır ADP ve kuyu başına mitokondriyal protein optimal miktarda (2.5 ug) (kırmızı izleme) yüklenmesi ile karşılaştırıldığında iyi (mavi tracing) başına aşırı mitokondriyal protein (3.5 ug) yükleyerek neden FCCP enjeksiyonlar takip. Veriler mitokondriyal protein miktarı başına n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; ADP = Adenozin difosfat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Karbonil siyanür 4 - (triflüorometoksi) fenilhidrazon; Anti-A = Antimycin A; SUCC = Süksinat; ROT = Rotenone; O 2 = oksijen; cıva mm Hg = milimetre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Şekil 4. Elektron Akış Testi. 5 mM piruvat / 1 mM malat + 4 iM FCCP, elektron foksijen tüketimi, çok oyuklu ölçülmesi ile belirlendiği üzere, düşük mitokondriyal solunum deneyi takip. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. Oyuk başına yüklü Mitokondrial proteini 3,5 ug idi. Veriler, n = 3 eşleştirilmiş biyolojik çoğaltır temsil eder. OCR = Oksijen Tüketim Hızı; Anti-A = Antimycin A; Artan = Askorbat; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; tetrametilsiklopentadienil p -fenilendiamin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Ayıraç </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> MW </td><td> Nihai Cilt </td><td> Kitle Eklendi </td><td> Yorumlar / Açıklama </td></tr><tr><td></td><td> (M) </td><td> (g / mol) </td><td> (mi) </strong&gt; </td><td> (g veya ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7.2 </td><td> 0.1 </td><td> 380,35 </td><td> 1 M Tris baz, 100 mi </td><td> 3,801 g </td><td> Mağaza 4 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238,3 </td><td> Dihidro 2 O 250 mi </td><td> 59. 57 g </td><td> Mağaza 4 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> MgCl2, heksahidrat </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> Dihidro 2 O 250 mi </td><td> 50,82 gr </td><td> Mağaza 4 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> Piruvat pH 7.4 </td><td> 0.1 </td><td> 88,06 (14,11 M solüsyon olarak gelir) </td><td> Dihidro 2 O 40 mi </td><td> Piruvik asit 0,283 mi </td><td> -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza sağlayın her iki haftada bir taze yapmak </td></tr><tr><td> Süksinat pH 7.4 </td><td> 0.5 </td><td> 118,09 </td><td> Dihidro 2 O 100 mi </td><td> Su 9.4 gccinic asit </td><td> -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza sağlayın </td></tr><tr><td> Malat, pH 7.4 </td><td> 0.5 </td><td> 134,09 </td><td> % 95 Etanol 100 ml </td><td> Malik asit 6.7 g </td><td> -20 ° C&#39;de 200 ul alikotları ve mağaza olun </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0.01 </td><td> 164,25 </td><td> 10 mi </td><td> 0,0164 g </td><td> -20 ° C&#39;de 300 ul alikotları ve mağaza olun; Indirgenmiş TMPD tutmak için askorbat bir eş-molar miktarıyla karıştırılır </td></tr><tr><td> Palmitoil L-karnitin klorit </td><td> 0.01 </td><td> 436,07 </td><td> % 95 Etanol ve 1.14 mi </td><td> 0.005 g </td><td> -20 ° C&#39;de 40 ul alikotları ve mağaza sağlayın </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 0.006 </td><td> 791,06 </td><td> % 95 Etanol 0.987 ml </td><td> 0.005 g </td><td> -20 ° C&#39;de 20 ul alikotları ve mağaza sağlayın </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0.01 </td><td> 254,17 </td><td> % 95 Etanol ve 3,9 mi </td><td> 0,01 g </td><td> -20 ° C&#39;de 40 ul alikotları ve mağaza sağlayın </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 0.001 </td><td> 394,4 </td><td> % 95 Etanol ve 10 ml </td><td> 0.0039 g </td><td> -20 ° C&#39;de de </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 0.005 </td><td> 548,63 </td><td> % 95 Etanol ve 9.12 mi </td><td> 0.025 g </td><td> -20 ° C&#39;de de </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0.5 </td><td> 501,32 </td><td> MHP 2 O 3.9 ml </td><td> 1.0 g </td><td> -20 ° C&#39;de de </td></tr><tr><td> Malik asit, pH 7.4 </td><td> 0.5 </td><td> 134,09 </td><td> 40 mi </td><td> 2.68 g </td><td> -20 ° C&#39;de 200 ul alikotları ve mağaza olun </td></tr></tbody></table><strong&gt; Tablo 1. Stok Çözümleri <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Ayıraç </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> Kitle Eklendi </td><td rowspan="2"> Final Molarite / Yüzde </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (g veya ml) </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> - </td><td> 11,98 g </td><td> 70 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> - </td><td> 20.04 gr </td><td> 220 mM </td></tr><tr><td> Potasyum fosfat monobazik </td><td> - </td><td> 0.34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2, heksahidrat </td><td> 1 </td><td> 2,5 mi </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 mi </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.1 </td><td> 5,0 mi </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Esas yağlı asit, SERBEST BSA </td><td> - </td><td> 1.0 g </td><td> % 0.20 </td></tr></tbody></table> . Tablo 2. MAS Mix pH 7.4, 500 ml: Kısım 25 ml ve mağaza -20 ºC * Not at: tahlil enjeksiyonlar için kullanılan MAS karışımı için BSA hariç. <table border="0"><tbody><tr><td> Yüzey Orta </td><td> Nihai Konsantrasyon </td><td> Stokta miktarı (ul) </td><td> MAS * Miktarı (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Piruvat / Malat </td><td rowspan="2"> 10 mM / 5 mM </td><td> Piruvat: 1000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malat: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / Rotenone </td><td rowspan="2"> 10 mM / 2 mcM </td><td> Süksinat: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Rotenone 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Piruvat / malat + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mM / 1 mM / 4 uM </td><td> Piruvat: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malat: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoil L-karnitin / Malat </td><td> 40 uM / 1 mM </td><td> Palmitoylcarnitine: 40 malat: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Glutamat / Malat </td><td rowspan="2"> 10 mM / 10 mM </td><td> Glutamat: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malat: 200 </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Yüzey Çözümleri pH 7.4: Deney gün taze olun. * Elektron akış deneyi çözeltisi. <table border="0"><tbody><tr><td> Enjeksiyon Orta </td><td> Konsantrasyon </td><td> Stokta miktarı (ul) </td> &lt;td&gt; MAS Miktarı (ml) </td><td> Tutar Kartuş enjekte </td><td> Nihai Konsantrasyon </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (İkinci levha enjekte) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mM </td><td> 300 ul </td><td> 3 </td><td> 50 ul </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 20 uM </td><td> 10 ul </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 2,0 uM </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 uM </td><td> 12 ul </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 uM </td><td> 24 ul </td><td> 3 </td><td> 65 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr></tbody></table> TCoupled Tahliller için mümkün 4. Enjeksiyonlar pH 7.4. Deney gün taze olun. * Birleştirme tahlilleri bulunmaktadır (bunlarla sınırlı değildir), piruvat / malat, süksinat / rotenon, palmitoil karnitin / malat ve glutamat / malat. <table border="0"><tbody><tr><td> Enjeksiyon Orta </td><td> Konsantrasyon </td><td> Stokta miktarı (g veya ul) </td><td> MAS Miktarı (ml) </td><td> Tutar Kartuş enjekte </td><td> (İkinci levha enjekte) nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 20 uM </td><td> 60 ul </td><td> 3 </td><td> 50 ul </td><td> 2,0 uM </td></tr><tr><td> Sukinat </td><td> 50 mM </td><td> 300 ul </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 uM </td><td> 24 μl </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 ul </td><td> 3 </td><td> 65 ul </td><td> 100 uM, 10 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Askorbat: 0,059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Elektron Akış Testi için Tablo 5. Enjeksiyonlar pH 7.4. Deney gün taze olun <table border="0"><tbody><tr><td> Komut </td><td> Süre (dk) </td><td> Döngü içinde </td></tr><tr><td> Kalibre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 10 dakika (plaka uyumu aşamasından ısınmasını sağlamak için) </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Beniaşure </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> A enjekte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> B enjekte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> C enjekte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> D enjekte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1 dakika </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 2 dakika </td></tr></tbody></table> Tablo 6. Enstrüman çalıştırın Protokolü.

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, elektron taşıma zincirinin, TCA döngüsü beta oksidasyon yolunun ve substrat taşıyıcılarının fonksiyonlarını değerlendirmek için mikroplaka tabanlı oksijen tüketim teknolojisini kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle analiz için substrat ve enjeksiyon çözeltilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise oksijen tüketim cihazını kalibre etmek için enjeksiyon çözeltilerinin önceden hidrate edilmiş bir tric analiz kartuşuna eklenmesidir.Ardından, mitokondriyal substrat çözeltilerini hazırlayın ve bu çözeltileri hücre kültür plağına yükleyin. Plağı Respira metrik analize yerleştirmeden önce, mitokondrilerin plak kuyucuğuna tutunmasını sağlamak için hücre kültür plağını santrifüjleyin. Her bir respiro metrik analiz için mitokondriyal solunuma dayalı oksijen tüketim hızlarını gösteren cihaz sonuçları elde edilir.Bu tekniğin Clark Elektrodu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikroplaka tabanlı teknolojilerin daha az miktarda mitokondri ile oksijen tüketiminin daha verimli ve daha yüksek kapasiteli bir şekilde ölçülmesine olanak sağlamasıdır; genellikle bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, analiz için solüsyonların hazırlanmasındaki tüm hareketli aşamalar nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Deneyden önceki gece, tric analiz kartuşunu 37 °C'deki CO2 içermeyen bir inkübatörde 1 mL kalibrasyon solüsyonu ile nemlendirin; ertesi gün, tüm dondurulmuş stokları çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda veya inkübatörde çözdürün. Tüm substrat solüsyonlarını ve enjeksiyon solüsyonlarını hazırlayıp buz üzerinde saklayın. Bir sonraki adım, çok kuyucuklu oksijen tüketimi ölçüm cihazını uygun karıştırma hızı ve ölçüm parametrelerine göre programlamaktır.Analiz yazılımını açın ve standart modu seçin. Seahorse misafir forumuna giriş yapın ve analiz sihirbazına tıklayın. Analiz sihirbazına girdikten sonra, karışım ağırlığını ve ölçüm parametrelerini değiştirmek için protokol kısmına tıklayın.Arka plan düzeltme sekmesi altındaki arka plan kuyucuklarını etiketleyin ve vurguladığınızdan emin olun. Arka plan düzeltmesini gerçekleştirin. Önce gruplar ve etiketler sekmesine, ardından grup bilgileri sekmesine tıklayarak koşulları etiketleyin.Bu parametreler girildikten sonra, önce "end" ardından "save template" butonuna tıklayın. Bu prosedüre başlamak için, enjeksiyon solüsyonlarını bir analiz çalıştırma kartuşuna yükleyin. Solüsyonları uygun portlara enjekte etmeye dikkat edin.Analiz kartuşunu, çentikli köşesi sol alt gelecek şekilde cihaza yerleştirin. Önce analiz yazılımına, ardından standart moda girerek kalibrasyonu başlatın. Seahorse misafir forumuna giriş yapın.XF Drive altındaki şablonlar sekmesinden kayıtlı şablonu açın. Açıldıktan sonra, yaklaşık 30 dakika sürecek olan kalibrasyonu başlatmak için start'a tıklayın. Bu prosedür için mitokondriler kırmızı iskelet kasından izole edilmiştir; uç kısmından yaklaşık üç milimetre kesilmiş bir 200 µL pipet ucu ile çözeltiyi hafifçe karıştırarak mitokondri substrat stokunu nazikçe ancak tamamen karıştırın.Mitokondriyal stokun protein konsantrasyonu belirlendikten sonra, 200 µL süksinat rot bilinen substrat karışımı başına 10 µg mitokondriyal protein olacak şekilde yeniden süspande edin. Mitokondriyal substrat çözeltisini, ucu yaklaşık üç milimetre kesilmiş bir 200 µL pipet ucuyla aynı şekilde nazikçe karıştırarak, yavaş ama tamamen karıştırın. Kalan her bir substrat karışımı için 200 µL başına 14 µg mitokondriyal protein şeklinde yeniden süspande edin; tüm mitokondriyal protein substrat karışımlarını buz üzerinde bekletin.24 kuyucuklu bir hücre kültür plağını buz üzerine yerleştirin ve her bir mitokondri substrat karışımından her kuyucuğa 50 µL olacak şekilde üç tekrar halinde yükleyin. Mikroplaka tabanlı tric deneyi geliştiricileri, tercihen hücre kültür plağının her iki yanında olacak şekilde, mitokondri içermeyen en az iki boş kuyucuk bırakılmasını önermektedir. Mitokondrilerin plak dönerken kuyucuklara yapışmasını sağlamak için hücre kültür plağını 4 °C'de 20 dakika boyunca 2000 G'de santrifüj edin.Substrat çözeltilerini 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, her bir substrat çözeltisinden 450 µL'yi ilgili kuyucukların üzerine dikkatlice ekleyin. Plakanın oda sıcaklığında yüklendiğinden emin olun.Boş kuyucuklara 500 µL substrat körü ekleyin. Elektron akış analizi için belirlenen kuyucuklara elektron akış substratı eklenmeli, eşleşmiş analiz körü kuyucuklarına ise herhangi bir eşleşme analizi substratı eklenebilir. Her birine 450 µL substrat eklendikten sonra, mitokondrilerin tek bir monotabaka halinde eşit şekilde dağıldığından emin olmak için kuyucuktaki mitokondri tabakasını 20x büyütmede inceleyin.Bu örnekte gösterildiği gibi, düzgün dağılmış bir monolayer'e sahip olmadığı görülen görüntü kuyucukları, oc sonrası aşamada çıkarılabilir. Mitokondriyal yapışma doğrulandıktan sonra, hücre kültür plağını Respir metric analiz cihazına götürün. Tamam'a tıklayın.Cihaz, daha önce kalibrasyon için kullanılan yardımcı plakayı dışarı çıkaracaktır. Yardımcı plakayı çıkarın ve mitokondri içeren hücre kültür plakasını tepsiye yerleştirin. Hücre kültür plakasındaki mavi çentik, tepsinin sol alt köşesine gelecek şekilde yerleştirilmelidir.Yaklaşık 40 dakika süren analiz çalışmasını başlatmak için devam (continue) düğmesine tıklayın. Çalışma tamamlandıktan sonra, hücre kültür plağını çıkarmak için ekrandaki çıkart (eject) düğmesine basın. Plak çıkarıldıktan sonra, hücre kültür plağını ve kartuşu çıkarıp atın.Ekrandaki devam (continue) düğmesine tıklayın. Çalışma, veri dosyası içinde otomatik olarak bir XLS dosyası olarak kaydedilecektir. Bu dosyayı açın ve Y1 işaretçisinin altındaki aşağı oka tıklayarak ekran görüntüsünü O2'den OCR'ye değiştirin.Ardından, görüntülenen hız verileri altındaki seçeneği orta nokta yerine noktadan noktaya hızlar olarak değiştirin. Tamam'a tıklayın. Bu değişiklikleri uygulamak için, benzer koşullardaki kuyucukları birlikte gruplandırmak amacıyla ekranın sol alt köşesindeki kuyucuk grubu modu sekmesine tıklayın.Son olarak, ekranın sol orta kısmındaki örnek ortalama standart hata (sample mean standard error) sekmesine tıklayın. Bu komutlar analizden önce de ayarlanabilir. Bu grafikler, dört farklı kenetlenme analizi için zamana karşı oksijen tüketim hızlarını veya OCR değerlerini temsil etmektedir.İlk panel, bir ADP yokluğundaki solunumu veya durumu temsil eden durum iki solunumunu göstermektedir. Bir ADP enjeksiyonundan sonraki ikinci panel, durum üç solunumu olarak da adlandırılan maksimal kenetli solunumu temsil eder. Oligomisin enjeksiyonundan sonraki üçüncü panel ise, durum dört oh solunumu olarak da adlandırılan proton sızıntısına bağlı solunumu temsil eder.FCCP enjeksiyonundan sonraki dördüncü panel, Durum üç U solunumu olarak da adlandırılan maksimum ayrık solunumu temsil eder. Antimisin A enjeksiyonundan sonraki beşinci panel ise oksidatif solunumun inhibisyonunu temsil eder. Mitokondri stokunun ve mitokondri substrat karışımlarının iyice karıştırılması ve yapışma santrifüjü sonrası tek bir mitokondri monotabakasının elde edilmesi sayesinde tüm mitokondri durumları minimum standart sapmaya sahiptir.Buna karşılık, her kuyucuğa eşit olmayan miktarda mitokondri yüklemek ve tek bir mitokondri monoton tabakası elde edememek, dakikada 1.500 ole üzerindeki OCR değerlerini gösteren Mavi izle belirtildiği üzere, her durumdaki standart sapmanın artmasına ve ayrıca noktadan noktaya hız değerlerindeki düşüşle örneklendiği gibi, ölçüm süresi boyunca solunum hızlarının azalmasına yol açar. Kırmızı izin tutarlı noktadan noktaya hızlar gösterdiğine ve maksimum OCR değerlerinin dakikada 1.500 ole altında olduğuna dikkat edin. Mitokondriyal protein aşırı yüklemesi, kuyucuğun mikro odasındaki oksijenin tükenmesine de yol açabilir; bu durum, ölçüm süresi boyunca sıfıra yaklaşan O2 değerleri ve her ardışık ölçümden sonra önemli ölçüde azalan başlangıç O2 değerlerini gösteren Mavi İz ile belirtildiği gibi, her ardışık ölçüm için OCR'nin doğru şekilde ölçülmesini engeller.Bu prosedürü uygularken, mitokondriler ve substrat çözeltileri karıştırılırken sabırlı olmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu yöntemler ustalıkla uygulandıktan sonra, belirli bir substrat taşıyıcısını hedefleyen ilaç tedavilerinin mitokondriyal oksijen tüketimini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için ilave deneyler tasarlanabilir.

using-isolated-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano...

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Burada, anestezi uygulanmış bir domuzdan kuadriseps kas örneği alınır ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızları, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak belirlenir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Mitokondri ile ilgili biyoenerjetik ve metabolomik çalışmalar, mitokondrilerin birçok hastalıkta çok yönlü rolünü ortaya koymuştur, ancak bu organeller için izolasyon yöntemleri farklılık göstermektedir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, yüksek kaliteli mitokondriyi birden fazla doku kaynağından saflaştırma yeteneğine sahiptir. Kalite, solunum kontrol oranları ve yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirilen diğer metriklerle belirlenir.

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon 

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Bu çalışmada, zebra balığı larvaları üzerinde Evans Mavi Boya (EBD) analizi yapmak için basit bir yöntem açıklıyoruz.  Bu teknik, iskelet kası bütünlüğünün karakterizasyonu ve zebra balığı kas distrofisi modellerinin tanımlanması için güçlü bir araçtır ve yeni terapötiklerin geliştirilmesi için değerli bir yöntemdir.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

Öğrenin fare iskelet kasından izole edilmiş mitokondri kullanarak yüksek verimli mikroplate solunum ölçümleri yapmayı. Bu yöntem metabolik adaptasyonları incelemek için etkili bir protokol sunar.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Daha fazla video keşfet