Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, elektron taşıma zincirinin, TCA döngüsü beta oksidasyon yolunun ve substrat taşıyıcılarının fonksiyonlarını değerlendirmek için mikroplaka tabanlı oksijen tüketim teknolojisini kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle analiz için substrat ve enjeksiyon çözeltilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise oksijen tüketim cihazını kalibre etmek için enjeksiyon çözeltilerinin önceden hidrate edilmiş bir tric analiz kartuşuna eklenmesidir.

Ardından, mitokondriyal substrat çözeltilerini hazırlayın ve bu çözeltileri hücre kültür plağına yükleyin. Plağı Respira metrik analize yerleştirmeden önce, mitokondrilerin plak kuyucuğuna tutunmasını sağlamak için hücre kültür plağını santrifüjleyin. Her bir respiro metrik analiz için mitokondriyal solunuma dayalı oksijen tüketim hızlarını gösteren cihaz sonuçları elde edilir.

Bu tekniğin Clark Elektrodu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikroplaka tabanlı teknolojilerin daha az miktarda mitokondri ile oksijen tüketiminin daha verimli ve daha yüksek kapasiteli bir şekilde ölçülmesine olanak sağlamasıdır; genellikle bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, analiz için solüsyonların hazırlanmasındaki tüm hareketli aşamalar nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Deneyden önceki gece, tric analiz kartuşunu 37 °C'deki CO2 içermeyen bir inkübatörde 1 mL kalibrasyon solüsyonu ile nemlendirin; ertesi gün, tüm dondurulmuş stokları çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda veya inkübatörde çözdürün. Tüm substrat solüsyonlarını ve enjeksiyon solüsyonlarını hazırlayıp buz üzerinde saklayın. Bir sonraki adım, çok kuyucuklu oksijen tüketimi ölçüm cihazını uygun karıştırma hızı ve ölçüm parametrelerine göre programlamaktır.

Analiz yazılımını açın ve standart modu seçin. Seahorse misafir forumuna giriş yapın ve analiz sihirbazına tıklayın. Analiz sihirbazına girdikten sonra, karışım ağırlığını ve ölçüm parametrelerini değiştirmek için protokol kısmına tıklayın.

Arka plan düzeltme sekmesi altındaki arka plan kuyucuklarını etiketleyin ve vurguladığınızdan emin olun. Arka plan düzeltmesini gerçekleştirin. Önce gruplar ve etiketler sekmesine, ardından grup bilgileri sekmesine tıklayarak koşulları etiketleyin.

Bu parametreler girildikten sonra, önce "end" ardından "save template" butonuna tıklayın. Bu prosedüre başlamak için, enjeksiyon solüsyonlarını bir analiz çalıştırma kartuşuna yükleyin. Solüsyonları uygun portlara enjekte etmeye dikkat edin.

Analiz kartuşunu, çentikli köşesi sol alt gelecek şekilde cihaza yerleştirin. Önce analiz yazılımına, ardından standart moda girerek kalibrasyonu başlatın. Seahorse misafir forumuna giriş yapın.

XF Drive altındaki şablonlar sekmesinden kayıtlı şablonu açın. Açıldıktan sonra, yaklaşık 30 dakika sürecek olan kalibrasyonu başlatmak için start'a tıklayın. Bu prosedür için mitokondriler kırmızı iskelet kasından izole edilmiştir; uç kısmından yaklaşık üç milimetre kesilmiş bir 200 µL pipet ucu ile çözeltiyi hafifçe karıştırarak mitokondri substrat stokunu nazikçe ancak tamamen karıştırın.

Mitokondriyal stokun protein konsantrasyonu belirlendikten sonra, 200 µL süksinat rot bilinen substrat karışımı başına 10 µg mitokondriyal protein olacak şekilde yeniden süspande edin. Mitokondriyal substrat çözeltisini, ucu yaklaşık üç milimetre kesilmiş bir 200 µL pipet ucuyla aynı şekilde nazikçe karıştırarak, yavaş ama tamamen karıştırın. Kalan her bir substrat karışımı için 200 µL başına 14 µg mitokondriyal protein şeklinde yeniden süspande edin; tüm mitokondriyal protein substrat karışımlarını buz üzerinde bekletin.

24 kuyucuklu bir hücre kültür plağını buz üzerine yerleştirin ve her bir mitokondri substrat karışımından her kuyucuğa 50 µL olacak şekilde üç tekrar halinde yükleyin. Mikroplaka tabanlı tric deneyi geliştiricileri, tercihen hücre kültür plağının her iki yanında olacak şekilde, mitokondri içermeyen en az iki boş kuyucuk bırakılmasını önermektedir. Mitokondrilerin plak dönerken kuyucuklara yapışmasını sağlamak için hücre kültür plağını 4 °C'de 20 dakika boyunca 2000 G'de santrifüj edin.

Substrat çözeltilerini 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, her bir substrat çözeltisinden 450 µL'yi ilgili kuyucukların üzerine dikkatlice ekleyin. Plakanın oda sıcaklığında yüklendiğinden emin olun.

Boş kuyucuklara 500 µL substrat körü ekleyin. Elektron akış analizi için belirlenen kuyucuklara elektron akış substratı eklenmeli, eşleşmiş analiz körü kuyucuklarına ise herhangi bir eşleşme analizi substratı eklenebilir. Her birine 450 µL substrat eklendikten sonra, mitokondrilerin tek bir monotabaka halinde eşit şekilde dağıldığından emin olmak için kuyucuktaki mitokondri tabakasını 20x büyütmede inceleyin.

Bu örnekte gösterildiği gibi, düzgün dağılmış bir monolayer'e sahip olmadığı görülen görüntü kuyucukları, oc sonrası aşamada çıkarılabilir. Mitokondriyal yapışma doğrulandıktan sonra, hücre kültür plağını Respir metric analiz cihazına götürün. Tamam'a tıklayın.

Cihaz, daha önce kalibrasyon için kullanılan yardımcı plakayı dışarı çıkaracaktır. Yardımcı plakayı çıkarın ve mitokondri içeren hücre kültür plakasını tepsiye yerleştirin. Hücre kültür plakasındaki mavi çentik, tepsinin sol alt köşesine gelecek şekilde yerleştirilmelidir.

Yaklaşık 40 dakika süren analiz çalışmasını başlatmak için devam (continue) düğmesine tıklayın. Çalışma tamamlandıktan sonra, hücre kültür plağını çıkarmak için ekrandaki çıkart (eject) düğmesine basın. Plak çıkarıldıktan sonra, hücre kültür plağını ve kartuşu çıkarıp atın.

Ekrandaki devam (continue) düğmesine tıklayın. Çalışma, veri dosyası içinde otomatik olarak bir XLS dosyası olarak kaydedilecektir. Bu dosyayı açın ve Y1 işaretçisinin altındaki aşağı oka tıklayarak ekran görüntüsünü O2'den OCR'ye değiştirin.

Ardından, görüntülenen hız verileri altındaki seçeneği orta nokta yerine noktadan noktaya hızlar olarak değiştirin. Tamam'a tıklayın. Bu değişiklikleri uygulamak için, benzer koşullardaki kuyucukları birlikte gruplandırmak amacıyla ekranın sol alt köşesindeki kuyucuk grubu modu sekmesine tıklayın.

Son olarak, ekranın sol orta kısmındaki örnek ortalama standart hata (sample mean standard error) sekmesine tıklayın. Bu komutlar analizden önce de ayarlanabilir. Bu grafikler, dört farklı kenetlenme analizi için zamana karşı oksijen tüketim hızlarını veya OCR değerlerini temsil etmektedir.

İlk panel, bir ADP yokluğundaki solunumu veya durumu temsil eden durum iki solunumunu göstermektedir. Bir ADP enjeksiyonundan sonraki ikinci panel, durum üç solunumu olarak da adlandırılan maksimal kenetli solunumu temsil eder. Oligomisin enjeksiyonundan sonraki üçüncü panel ise, durum dört oh solunumu olarak da adlandırılan proton sızıntısına bağlı solunumu temsil eder.

FCCP enjeksiyonundan sonraki dördüncü panel, Durum üç U solunumu olarak da adlandırılan maksimum ayrık solunumu temsil eder. Antimisin A enjeksiyonundan sonraki beşinci panel ise oksidatif solunumun inhibisyonunu temsil eder. Mitokondri stokunun ve mitokondri substrat karışımlarının iyice karıştırılması ve yapışma santrifüjü sonrası tek bir mitokondri monotabakasının elde edilmesi sayesinde tüm mitokondri durumları minimum standart sapmaya sahiptir.

Buna karşılık, her kuyucuğa eşit olmayan miktarda mitokondri yüklemek ve tek bir mitokondri monoton tabakası elde edememek, dakikada 1.500 ole üzerindeki OCR değerlerini gösteren Mavi izle belirtildiği üzere, her durumdaki standart sapmanın artmasına ve ayrıca noktadan noktaya hız değerlerindeki düşüşle örneklendiği gibi, ölçüm süresi boyunca solunum hızlarının azalmasına yol açar. Kırmızı izin tutarlı noktadan noktaya hızlar gösterdiğine ve maksimum OCR değerlerinin dakikada 1.500 ole altında olduğuna dikkat edin. Mitokondriyal protein aşırı yüklemesi, kuyucuğun mikro odasındaki oksijenin tükenmesine de yol açabilir; bu durum, ölçüm süresi boyunca sıfıra yaklaşan O2 değerleri ve her ardışık ölçümden sonra önemli ölçüde azalan başlangıç O2 değerlerini gösteren Mavi İz ile belirtildiği gibi, her ardışık ölçüm için OCR'nin doğru şekilde ölçülmesini engeller.

Bu prosedürü uygularken, mitokondriler ve substrat çözeltileri karıştırılırken sabırlı olmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu yöntemler ustalıkla uygulandıktan sonra, belirli bir substrat taşıyıcısını hedefleyen ilaç tedavilerinin mitokondriyal oksijen tüketimini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için ilave deneyler tasarlanabilir.