Name: Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Öğrenin, fare iskelet kasından minimal miktarda doku kullanarak yüksek kaliteli mitokondri izolasyonunu ve mikroplate solunum ölçümleri için bu yöntemi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fralin Yaşam Bilimleri Araştırma Enstitüsü ve Virginia Tech'teki Metabolik Fenotipleme Çekirdeği bu çalışmayı destekledi.

Hayvan çalışmaları Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış bir protokol çerçevesinde gerçekleştirilen ve Virginia Politeknik Enstitüsü ve Eyalet Üniversitesi&#39;nde Committee bulundu. 1. Kurulum (Saat: ~ 45 dk) <ol><li> 37 ° C su banyosunda Mitokondri (IBM) 1 ve IBM2 için% 0.25 tripsin, İzolasyon Tampon çözülme dondurulmuş saklar. </li><li> Cam ve yüksek saflıkta su ile,% 70 etanol içinde kesme durulayınız. </li><li> 4 bölümden IBM1 1 kısım tripsin seyrelterek% 0.25 tripsin stokundan% 0.05 tripsin çözüm hazırlayın. </li><li> Vidalı kapaklı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde (100 oranı 1) hücre liziz tamponu ile proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl karıştırın. </li><li> Kısım 5 ml 15 ml&#39;lik plastik tüp içine% 0.05 tripsin (5 ml / fare). </li><li> Set Motor 80 RPM doku homojenleştirici tahrik. </li></ol> İskelet Kası Mitokondri 2. izolasyonu (Saat: ~ 90 dk) <ol><li> CO 2 ile bir fare Euthanize </suservikal dislokasyon b&gt; inhalasyon. </li><li> Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi soleus (~ 75-100 mg toplam) içeren kuadriseps ve gastroknemius kasının, kırmızı kas kaldırın: <ol><li> Fare doğru cilt soyma. </li><li> Kuadriseps kökenli noktası üzerinde yağ yastığı çıkarın. Ince uçlu makasla patella bağlı olduğu kuadriseps tendonu kesin. Not: quadriceps proksimal femur ön kısmı üzerindeki anatomik pozisyonuna ile tanımlanır. </li><li> Kemik kuadriseps kurtarmak için, femoral arter kaçınarak Yavaşça, kemik ve kuadriseps arasındaki künt snip. Kuadriseps kas özgürleştirmek ve soğutulmuş PBS kuadriseps kas yerleştirmek için femur üzerinde orijin noktasında ince uçlu makasla tendon kesin. </li><li> Makasla kuadriseps üzerinde görünür yağ dokusu çıkarın. Yani femur örten oldu kas kısmı u bakacak şekilde çevirin üzerinde kuadrisepss. Bir yelpaze hareket forseps ile kuadriseps kas açın. Soğutulmuş IBM1 5 ml içeren bir cam kapta ince uçlu makas ve yer ile her lobdan iki görünür kırmızı kas kısımlarını çıkarın. Not: kuadriseps her lobun yan kenarında bulunan kırmızı bir kas şeridi ile iki lob olarak görünür. </li><li> İnce uçlu makasla Aşil tendonu örten deri kesin ve fare doğru cilt soyma. Maruz Aşil tendonu kesin ve fare gövdesine doğru kas soyun. </li><li> Gastroknemius serbest ve soğutulmuş PBS kendi tendon bağlı gastrocnemius yerleştirmek için ince uçlu makasla femur lateral ve medial kondil de tendon kesin. </li><li> Üzerinde gastroknemius ve soleus kas çevirin kalkmasına ve soğutulmuş IBM1 5 ml içeren beher içine yerleştirin. Fan gastroknemius açın. Ince uçlu makas ile üç görsel kırmızı kas kısımlarını (iki yanal ve bir medial yüzeysel kırmızı şeritler) çıkarıns ve soğutulmuş IBM1 5 ml ihtiva eden bir behere aktarın. </li></ol></li><li> (Adım 2.2 de tarif edildiği gibi) fare diğer bacak kırmızı kas diğer ~ 75-100 mg çıkarın ve proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli ve hücre liziz tamponu (50 mM Tris-HCl, 1 ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirmek mM EDTA, 150 mM NaCl,% 1 sodyum dodesil sülfat,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1 polioksietilen (9) nonilfenileter. hemen Western blotlama daha sonra kullanmak için sıvı azot içinde bu ikinci örnek flaş dondurularak dallanmış (adım 6.1). </li><li> Büyük bir kova buz üzerinde önceden soğutulmuş, düz plastik yüzeyi yerleştirin. Plastik yüzeye IBM1 bir damla dökün ve IBM1 damlacık içinde bölümlere kırmızı kas (adım 2.2.4 ve 2.2.7) tüm yerleştirmek için cımbız kullanın. Değişen jilet ile 3 tek kenar jilet her 40 saniye ile 2 dakika süreyle kas dokusu kıyma. </li><li> Th plastik yüzey tutarak taze IBM1, 5 ml ile yeni bir behere kıyılmış doku transfere beher ve bir jilet ile beher içine kas kazıma. Bu çözümü alın ve 50 ml konik tüp yerleştirilir 100 mikron hücre süzgecinden boşaltın. </li><li> Bir hassas bir görev silecek ile doku Blot ve daha sonra% 0.05 tripsin solüsyonu 5 ml aktarın. Görev silecek doku kaldırmak için cımbız kullanın. </li><li> % 0.05 tripsin solüsyonu içinde 30 dakika için buz üzerinde kas dokusu inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 200 x g&#39;de 15 ml konik tüp içeren tripsin / kas karışımı dönerler. </li><li> Bir atık kabına tripsin süpernatant dökün ve buz 3 ml soğuk IBM1 ile pelletini. 45 ml&#39;lik bir cam homojenizatör tüp doku aktarın. Kalan numune toplamak ve cam homojenleştirici tüp bu eklemek için başka bir 1.5 ml IBM1 ile 15 ml konik tüp durulayın. </li><li> Cam homogenizer beher içinde minimal hareket yani buz ile bir bardak ya da plastik kap dolu yarım içine cam homojenizatör tüp yerleştirin. </li><li&gt; 80 rpm&#39;de 10 geçişle bir motor tahrikli doku homojenleştirici bağlı PTFE havan ile doku / IMB1 homojen bir karışım. ~ 2 saniye, her geçişte alt tutun. </li><li> Yeni 15 ml konik tüp doku Homojenat aktarın ve IBM1 6.5 ml cam homojenizatör tüp durulayın. Doku Homojenat içeren 15 ml konik tüp içine IBM1 dökün. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 700 g&#39;de 15 ml konik bir tüp dönerler. Yavaşça cam yüksek mukavemetli santrifüj tüpüne süpernatant dökün ve pelet atın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 8000 x g&#39;de, yukarıdaki aşamada elde edilen süpernatant dönerler. </li><li> IBM1 Süpernatantı ve yavaşça IBM2 500 ul ekleyerek pelet yeniden askıya. Bir pipet ucunu kesti ve hafifçe karıştırma ve hareketleri karıştırılarak IBM2 pelet homojenize. Pelet tamamen askıya sonra karışıma IBM2 başka 4,5 ml ilave edilir. T gibi büyük pelet parçaları kırarak aşırı öğütme kaçının: Notonun mitokondriyal zarlarının zarar verebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 8000 x g&#39;de IBM2 / doku Homojenat dönerler. Not: Bu adım, toplam protein içeriğinin katkıda bulunabilir bakiye BSA yana Aşama 4 izole mitokondri daha doğru bir protein ölçümü için temiz bir yüksek mukavemetli santrifüj tüpüne tekrarlanabilir. </li><li> Nazikçe Süpernatantı ve kaldırmak, ancak tamamen kesilmiş olan nokta ile bir pipet ile IBM2 iki 25 ul artışlarını ekleyerek pelet yeniden askıya. Yavaşça karıştırın ve IBM2 25 ul her bir ilaveden sonra pelet karıştırın. Buz üzerinde bu mitokondriyal stok yerleştirin. </li></ol> Tüm Doku Lizat 3. Homojenizasyon (Saat: ~ 45 dakika; Adım sırasında Yapılabilir 7) <ol><li> Bu adım 2.3 sıvı azot içine yerleştirilmiştir gelen kas çıkarın ve tam çözülmüş kadar oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Ince uçlu makasla buz üzerinde ~ 30 saniye için doku kıyma. </li><li> Zirco iki 100 ul kepçe eklemekıyılmış doku içeren adım 3.2 vidalı kapaklı 1.5 ml mikrosantrifüj tüp uranyum Oksit Boncuk. 4-6 (orta ayar) bir hız ayarında iki 5 ila üç dakika döngüleri kullanarak bir boncuk değirmeni doku homojenleştiricide doku homojenize. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12.000 x g&#39;de aşama 3,3 karışımın dönerler. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine spin ve transferden sonra 1000 ul pipet kullanarak süpernatantı. Pelet atın ve buz üzerinde supernatant yerleştirin. </li></ol> 4. Protein Tayini (süre: ~ 30 dakika) <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre BCA Protein tahlil kiti kullanılarak tüm doku lizat (adım 3.4) ve mitokondriyal stokunun (adım 2.17) protein konsantrasyonu belirleyin. </li></ol> 5. Mitokondri Membran Bütünlüğü; Sitrat Sentaz (CS) Etkinlik (Saat: ~ 15 dk) <ol><li> Yüksek saflıkta su mitokondriyal stokunun 20 dilüsyonları: iki ayrı 1 yapın. EklemekTek örnek Triton 100 X% 0,1 ve düşük ayarda (765 Watt, 2 genlik) it at ses dalgalarına maruz. Buz üzerinde başka seyreltme bırakın. Sonikasyon sonra buza örneği dönün. </li><li> Olan bir sitrat sintaz deneyi gerçekleştirmek hem sigara soniklendi ve daha önce tarif edildiği gibi 11,12 bir spektrofotometrik deneyle mitokondriyal dilüsyonları sonike edilmiştir. </li><li> Aşağıdaki denklemleri kullanarak sağlam mitokondri zarlarının yüzdesini belirleyin: (Non-soniklendi CS faaliyeti ÷ soniklendi CS aktivitesi) * 100 </li></ol> 100- N (yüzde yukarıdan elde) 6. Mitokondri İzolasyon Kalite; Western Blot (Saat: Lab Protokole göre) <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 12 tam doku lizat ve izole mitokondri Batı blotting gerçekleştirin. Not: GAPDH kullanımlar primer antikor (1: 1000 seyreltme,% 5 BSA / TBS-T) ve COXIV (1: 1000 seyreltme içinde% 5 yağsızsüt / TBS-T, sırasıyla anti-keçi, tavşan sekonder antikor, (1) ve akabinde: 10,000). </li></ol> 7. Respirometrik Deneyi Run (Saat: ~ 90 dk) <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi mikroplaka bazlı O 2 tüketimi ölçüm teknolojisi kullanılarak istenilen Respirometrik tahlilleri yapın (arkadaşı makale ve Rogers bkz ark 8). </li><li> Devlet 4o (RCR) tarafından State 3 bölünmesi veya Devlet 4o Devlet 3U bölerek Solunum kontrol oranı (RCR) belirleyin. RCR belirlerken noktadan noktaya izlerinden orta (ortalama) noktası, ya da en yüksek (Devlet 3) ve en düşük fiyatları (Devlet 4o) kullanın. </li></ol>

<ol><li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li>
<li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).</li>
<li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance%2C+metabolic+flexibility%2C+and+mitochondrial+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6, e21746(2011).</li>
<li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).</li>
<li>Hulver, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+stearoyl-CoA+desaturase-1+expression+in+skeletal+muscle+contributes+to+abnormal+fatty+acid+partitioning+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans.</a> Cell Metab. 2, 251-261 (2005).</li>
<li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+modulates+skeletal+muscle+substrate+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subjects+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol.%3A+Respir.%2C+Envir.+and+Ex.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).</li>
<li>Asmann, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+functions%2C+mitochondrial+DNA+copy+numbers%2C+and+gene+transcript+profiles+in+type+2+diabetic+and+nondiabetic+subjects+at+equal+levels+of+low+or+high+insulin+and+euglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia.</a> Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
</ol>

George Rogers, bu protokolün değiştirildiği aracı üreten Seahorse Bioscience'ın bir çalışanıdır.

Burada sunulan yöntemler fare iskelet kası minimal miktarlarda (~ 75-100 mg) bir mitokondriyal izolasyon prosedürü ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bu izolasyon prosedürü O 2 tüketimi oranları, RCR değerleri, maksimal sitrat sentaz aktivitesi ve immunoblotting protein ifadesi ile kanıtlandığı gibi yüksek işleyişi, saf mitokondri (~ 450 mikrogram) elde edebiliyor. Önemli olarak, bu prosedür izole mitokondri, yüksek verimlilik sağlayan mikroplaka göre O2 tüketimi teknolojisi ile birden çok respirom...

Mitokondrinin birincil işlevi, oksidatif fosforilasyondan ATP üretmektir. Bununla birlikte, mitokondri, bunlarla sınırlı olmamak üzere, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve detoksifikasyonu, sitoplazmik ve mitokondriyal kalsiyumun düzenlenmesi, organel kaçakçılığı, iyonik homeostaz ve apoptoza katılım dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok başka önemli hücresel fonksiyona sahiptir1,2. Bu nedenle, işlevsiz mitokondrinin yaşlanma, nörodejeneratif hastalıklar, kardiyovasküler hastalık, kanser, obezite ve diyabet gibi birçok hastalık patolojisinde rol oynaması şaşırtıcı değildir3,4. Daha da önemlisi, iskelet kası mitokondrileri özellikle bu patolojilerin çoğundarol oynar 3-5.
İzole mitokondri kullanılarak yapılan mitokondriyal solunum testleri, elektron taşıma zincirinin ve oksidatif fosforilasyon fonksiyonunun değerlendirilmesine ve metabolizmayı modüle eden ilaçların ve proteinlerin etki mekanizmalarının belirlenmesine olanak tanır. Mitokondriyal izolasyon prosedürleri, çeşitli türler için çoklu doku ve hücre tipleri için mevcuttur6,7. Bununla birlikte, bu prosedürler genellikle klasik respirometrik testler için gerekli olan yüksek kaliteli bir mitokondri verimi için büyük miktarlarda doku/hücre gerektirir. 
Mikroplaka bazlı respirometirc tahlilleri, minimum miktarlarda izole mitokondri kullanarak, genellikle kuyucuk başına sadece birkaç μg kullanarak yüksek verimli ölçümlere izin verir8. Bu nedenle, mikroplaka bazlı respirometirk deneylerinde kullanılmak üzere yüksek kaliteli mitokondrinin daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından izole edilmesine izin vermek için daha önce yayınlanmış yöntemlerin7 bir modifikasyonunu sunuyoruz. Ek olarak, mitokondriyal izolasyon hazırlığının kalitesini ve mitokondriyal zarların bütünlüğünü belirlemek için yöntemler sağlanmıştır. İskelet kası mitokondrilerinin birçok patolojik durumda yer aldığı göz önüne alındığında, mekanik güdümlü çalışmalarda O2 tüketiminin ölçümü biyomedikal araştırmalarda daha yaygın hale gelmektedir9,10.

<table><tbody><tr><td>Esasen Yağlı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Asitsiz - BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris / HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Tris Baz</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N / A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6511</td><td>N / A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/</td></tr><tr><td>A D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.25), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür Beyaz Kristaller veya Kristal Toz &ge; % 99.0</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>Yok Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771 ve nbsp;</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&nbsp;</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Polioksietilen (12) nonilfenil eter, dallı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tek Kenarlı Tıraş Bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM Naylon Hücre Süzgeçleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A Halt</td></tr><tr><td>Proteaz & Fosfat İnhibitörü Kokteyl</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirkonyum Oksit boncuklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH antikoru (1D4)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-59540</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Anti-COXIV antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>4844s</td><td>Herhangi bir mitokondriyal iç zar proteini yeterli olacaktır</td></tr><tr><td>Peroksidaz konjuge afinisaf Eşek, Anti Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N / A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz konjuge afinipure Keçi, Anti Fare IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>Yok</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Yok Pierce BCA Protein Test Kiti&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pirüvik Asit, %98</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>4 &° C'de saklayın; C, respirometrik tahlilde kullanılmadan önce KOH ile pH 7.4'e</td></tr> kadar <tr><td>Süksinik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Respirometrik testte kullanmadan önce oda sıcaklığında, KOH ile pH 7.4'e</td></tr> kadar <tr><td>saklayın L (-) Malik Asit, BioXtra, &ge; % 95</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Oda sıcaklığında, respirometrik testte kullanılmadan önce KOH ile 7.4'e</td></tr> kadar <tr><td>saklayın L-Glutamik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Oda sıcaklığında saklayın, respirometrik testte kullanmadan önce KOH ile 7.4'e, respirometrik testte</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> kullanmadan önce KOH ile 7.4'e kadar <tr><td>Palmitoil L-karnitin klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>-20 ° C'de saklayın</td></tr><tr><td>Oligomisin A, &ge;% 95 (HPLC)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>2-8 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>fenilhidrazon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; % 98 (TLC), toz [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Streptomyces sp.'den antimisin A.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Mağazası -20 > C</td></tr><tr><td>Adenozin 5&asal;-difosfat monopotasyum tuzu dehidrat [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>-20 °C'de saklayın; C, respirometrik tahlilde</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> kullanılmadan önce KOH ile 7.4'e kadar <tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Oda sıcaklığında saklayın</td></tr></tbody></table>

yüksek verimli mikroplate solunum Ölçümler için fare İskelet kası minimal miktarları gelen mitokondri İzolasyonu

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Fonksiyonel iskelet kası mitokondri yaşlanma, obezite ve Tip II diyabeti olan gözlenen değiştirilmiş metabolizmasında rol oynar. İzole mitokondriyal müstahzarlardan mitokondriyal respirometrik deneyler, ilaç ve metabolizmasını modüle eden proteinlerin hareket mekanizması (ler) in mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, hem de belirlenmesi için izin verir. Güncel izolasyon prosedürleri genellikle Respirometrik deneyleri için gerekli yüksek kaliteli mitokondri verim dokusunun büyük miktarlarda gerektirir. Bu tarifnamede sunulan yöntemler (~ 450 ug), yüksek verimli, solunum ölçümlerde kullanmak için, fare, iskelet kası, minimum miktarlarda (~ 75-100 mg) izole edilebilir ne kadar kaliteli saflaştırılmıştır mitokondri tarif eder. Bizim izolasyon yöntemi spektrofotometrik sitrat sentaz aktivitesini ölçerek 92.5 ± 2.0% bozulmamış mitokondri verimleri belirlenmiştir. Buna ek olarak, izole edilmiş bir mitokondride Western blot analizi, cytoso soluk ekspresyonu ile sonuçlandılic proteini, GAPDH ve mitokondriyal protein, COXIV sağlam ifadesi. İzole mitokondri belirgin bir GAPDH bantın yokluğu, izolasyon prosedürü sırasında olmayan mitokondriyal kaynaklardan çok az kirlenme göstergesidir. En önemlisi, O 2 tüketimi mikro plakalı tabanlı teknoloji ile hızı ve yüksek birleştiğinde gösterir akuple Respirometrik deneyleri için solunum kontrolü oranı (RCR) belirlenmesi ölçümü (RCR, tüm tahliller için&gt; 6) ve fonksiyonel mitokondri. Sonuç olarak, ayrı bir kıyma adım eklenmesi ve önemli ölçüde daha önce bildirilen yöntemin motor tahrikli homojenleştirme hızını azaltarak yüksek fonksiyonlu teneffüs yüksek bağlanmış mitokondri sonuçlanır fare iskelet kası küçük miktarlarda yüksek kalitede ve saflaştırılmış mitokondri izolasyonunu sağladı mikro-bazlı respirometirc deneyleri sırasında.

Sitrat sintaz aktivitesi sitrat sentez intakt membranlı mitokondri süspansiyonlar içinde mevcut olmamalıdır böylece iç mitokondriyal zarın içinde bulunan ve bu yana membran bütünlüğü için bir ölçüt olarak hizmet vermektedir. 1 sonike ile karşılaştırıldığında sigara sonike mitokondriyal örnekleri sitrat sentaz aktivitesini temsil etmektedir Şekil Aynı izolasyondan örnekler. Sitrat sintaz aktivitesi istatistiksel olarak önemli bir artış mitokondri sonuçları (P &lt;0.01) sonike. Önemlisi, ...

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Bu video makalesinin genel amacı, mikroplaka tabanlı tric analizlerinde kullanılmak üzere, küçük miktarlardaki fare iskelet kasından yüksek kaliteli mitokondrileri izole etmektir. Bu yöntem, belirli ilaçların ve proteinlerin iskelet kası mitokondriyal oksijen tüketimini nasıl modüle ettiğinin açıklanması gibi biyomedikal araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, daha önce bildirilenlerden daha küçük miktardaki fare iskelet kasından yüksek kaliteli mitokondrilerin izole edilebilmesidir.Fareye kurum yönergelerine uygun şekilde ötanazi uygulayın. Ardından fareyi yan tarafına yatırın ve ince uçlu makas kullanarak, femur lateral epikondilinin üzerine denk gelecek şekilde ciltte bir insizyon yapın.Deriyi fareye doğru soyun ve ardından quadriceps başlangıç noktasının üzerinde yer alan yağ pedini çıkarın. Daha sonra, patellaya tutunmuş olan quadriceps tendonunu kesin. Femoral arteri koruyarak kemik ile quadriceps arasındaki aponevrozu yavaşça kesin.Ardından, quadriceps kasını serbest bırakmak için tendonu femur üzerindeki başlangıç noktasından kesin ve quadriceps kasını soğutulmuş PBS içine yerleştirin. Quadriceps üzerindeki görünür tüm yağ dokularını bir makas yardımıyla temizleyin. Temizleme işlemi bittikten sonra, kasın femurun üzerinde kalan kısmı yukarı bakacak şekilde quadriceps'i ters çevirin.Kuadriceps kasını penset yardımıyla yelpaze şeklinde açın. Her lobdan görünen iki kırmızı kas kısmını çıkarın ve beş mililitre soğutulmuş mitokondri izolasyon tamponu içeren bir behere yerleştirin.Sırada, aşil tendonunun üzerindeki deriyi ince uçlu makasla kesin ve deriyi fareye doğru soyun. Açığa çıkan aşil tendonunu kesin ve kası farenin gövdesine doğru soyun. Gastroknemius kasını serbest bırakmak için tendonu femur'un lateral ve medial kondillerinden kesin ve tendonları bağlı olan gastroknemius kasını soğutulmuş PBS ile dolu bir kaba yerleştirin.Gastroknemius kasını ters çevirin ve soleus kasını soyarak ayırın. Soleus kasını, beş mililitre soğutulmuş mitokondri izolasyon tamponu içeren behere yerleştirin.Bir sonraki aşamada gastroknemius kası açıldı ve üç adet görsel olarak kırmızı kas parçası çıkarıldı. İki lateral parça ve bir medial yüzeysel kırmızı şerit olacaktır. İzole edilen kırmızı kas, beş mililitre soğutulmuş mitokondri içeren behere aktarılır.İzolasyon tamponu bir. Farenin diğer bacağından 75 ila 100 miligram daha kırmızı kas çıkarın. Az önce gösterilen işlemi tekrarlayın.Diseke edilmiş ikinci bacak kasını, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanan proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile hücre lizis tamponu içeren 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Western blotting işleminde kullanmak üzere, ikinci örneği hemen sıvı azot içinde şok dondurun. Geniş bir kova içindeki buzun üzerine önceden ısıtılmış düz plastik bir yüzey yerleştirin.Ardından plastik yüzeye bir damla mitokondri izolasyon tamponu bir dökün ve cımbız kullanarak kesilmiş kırmızı kasın tamamını izolasyon tamponu damlasının içine yerleştirin. Tek kenarlı jiletler kullanarak kas dokusunu iki dakika boyunca incece doğrayın ve her 40 saniyede bir yeni, keskin bir jiletle değiştirin. Doğranmış dokuyu, beş mililitre taze mitokondri içeren yeni bir behere aktarın.İzolasyon tamponu bir. Ardından çözeltiyi alın ve 50 mililitrelik konik tüp üzerine yerleştirilmiş 100 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Dokuyu hassas bir temizleme beziyle kurulayın ve ardından beş mililitrelik %0,05 tryin çözeltisine aktarın.Kalan tüm dokuları cımbız yardımıyla temizleme bezinden alıp tripsin içerisine ekleyin. Kas dokusunu, buz üzerinde tripsin çözeltisi içinde 30 dakika inkübe edin. Ardından numuneyi 4 °C'de, 200 ×g hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjasyonun ardından, tripsin süpernatantını bir atık kabına dökün ve peleti üç mililitre buz gibi soğuk mitokondri izolasyon tamponu bir ile yeniden süspande edin. Ardından dokuyu 45 mililitrelik bir cam homojenizatör tüpüne aktarın. Kalan tüm numuneyi toplamak için 15 mililitrelik konik tüpü başka bir 1,5 mililitre mitokondri izolasyon tamponu bir ile durulayın ve bunu cam homojenizatör tüpüne ekleyin.Ardından, cam homogenizatör tüpünü yarıya kadar buzla doldurulmuş bir behere veya plastik kaba yerleştirin. Böylece cam homogenizatör beher içinde minimum düzeyde hareket eder. Numuneyi, motorlu bir doku parçalayıcıya bağlı politetrafloroetilen havanla homogenize edin.80 RPM'de 10 kez homogenizatörle homojenleştirin. Her geçişin sonunda alt kısmı yaklaşık iki saniye boyunca tutun. Ardından doku homojenatını yeni bir 15 mililitre konik tüpe aktarın.Cam homojenizatör tüpünü 6,5 milliliters mitochondria isolation buffer one ile durulayın. Tamponu, dokunun geri kalanının bulunduğu 15 milliliters konik tüpe dökün. Homojenize edin. Örneği 4 °C'de 10 dakika boyunca 700 ×g hızında santrifüjleyin ve ardından süpernatantı nazikçe yüksek dayanımlı cam santrifüj tüpüne aktarıp peleti atın.Ardından, süpernatantı 4 °C'de 10 dakika boyunca 8,000 ×g'de santrifüjleyin. Mitokondrileri çöktürmek için süpernatantı uzaklaştırın ve 500 µL mitokondri izolasyon tamponu iki yavaşça ekleyerek peleti yeniden süspande edin; bir pipet ucunun ucunu kesin ve karıştırma ve çalkalama hareketleriyle peleti tampon içerisinde nazikçe homojenize edin. Daha sonra 4,5 mL daha mitokondri izolasyon tamponu ekleyin.Karışıma Tampon iki ekleyin. Pelet tamamen süspande olduktan sonra, mitokondriyaları yeniden peletlemek için homogenatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 8,000 ×g'de santrifüjleyin. Üst fazı uzaklaştırın ve ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak 25 µL'lik artışlarla toplam 2 kez mitokondri izolasyon Tampon iki ekleyerek peleti nazikçe ancak tamamen resüspande edin; her 25 µL tampon eklemesinden sonra peleti nazikçe karıştırın ve karıştırın.İşlem tamamlandığında, bu mitokondri stokunu buza yerleştirin. Mitokondri stokunun yüksek saflıktaki su ile iki ayrı 1/20 seyreltmesini hazırlayın. Örneklerden birine %0,1 Triton 100 x ekleyin ve düşük ayarda 10 saniye boyunca sonikasyon uygulayın.Diğer dilüsynu buz üzerinde bırakın ve sonikasyon işlemine tabi tutulan örneği tekrar buza yerleştirin. Sonikasyondan sonra, hem sonike edilmemiş hem de sonike edilmiş mitokondriyal dilüsyonlarla, standart teknikler kullanılarak fotometrik bir analizle sitrat sentaz testi gerçekleştirin; beraberindeki metin protokolünde verilen denklemleri kullanarak sağlam mitokondri membranlarının yüzdesini belirleyin. Mitokondrilerin sonike edilmesi, sitrat sentaz aktivitesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışla sonuçlanır.Sonikasyon uygulanmamış mitokondriyal örneklerdeki sitrat sentaz aktivitesinin sonike edilmiş örneklerle karşılaştırılması, izolasyon sonrası mitokondrilerin %92,5'inin sağlam olduğunu göstermektedir. GA DH ve COX 4 ekspresyonu tüm doku lizatında belirginken, izole edilmiş mitokondrilerde COX 4 ekspresyonu gözlenmektedir. GA DH'nin yalnızca sönük bantları görülürken, bu bulgular izolasyon prosedürü sırasında mitokondriyal olmayan bileşenlerden çok az kontaminasyon olduğunu ve başarılı bir mitokondriyal izolasyon gerçekleştirildiğini göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, mitokondriyal stokun dikkatle taşınması, asla vortekslenmemesi veya prosedür sonrasında şiddetli şekilde karıştırılmaması gerektiğini unutmamak önemlidir. Belirli bir müdahalenin izole mitokondrilerde reaktif oksijen türleri üretimine etki edip etmediği gibi ek soruları yanıtlamak için, reaktif oksijen türleri üretiminin ölçülmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

isolation-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano...

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Burada, anestezi uygulanmış bir domuzdan kuadriseps kas örneği alınır ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızları, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak belirlenir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur.  Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.

İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Enzimatik disosiasyon, fibro / adipogenic ve fare iskelet kası miyojenik atalarıdır flow sitometri ile yüzey etiketleme ve arıtma yöntemi.

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Öğrenin, fare iskelet kasından minimal miktarda doku kullanarak yüksek kaliteli mitokondri izolasyonunu ve mikroplate solunum ölçümleri için bu yöntemi.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Daha fazla video keşfet