Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Bu video makalesinin genel amacı, mikroplaka bazlı trik tahlillerde kullanılmak üzere küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli mitokondriyi izole etmektir. Bu yöntem, bazı ilaçların ve proteinlerin iskelet kasını, mitokondriyal oksijen tüketimini nasıl modüle ettiğini açıklamak gibi biyomedikal araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, yüksek kaliteli mitokondrinin daha önce bildirilenden daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından izole edilebilmesidir.

Farenin ötenazisini kurum yönergelerine uygun olarak gerçekleştirin. Ardından fareyi yan yatırın ve ciltte bir kesi yapmak için ince uçlu makas kullanın. Femurun lateral epikondilinin üst üste bindirilmesi.

Cildi fareye doğru soyun ve ardından kuadriseps başlangıç noktasının üzerine yerleştirilmiş yağ pedini çıkarın. Ardından, patellaya bağlı olan kuadriseps tendonunu kesin. Femoral arterden kaçınırken kemik ve kuadriseps arasındaki apo nevrozunu yavaşça kesin.

Daha sonra kuadriseps kasını serbest bırakmak için tendonu femur üzerindeki başlangıç noktasında kesin ve kuadriseps kasını soğutulmuş PBS'ye yerleştirin. Bir makas kullanarak kuadriseps üzerindeki görünür yağ dokusunu çıkarın. Temizledikten sonra, kuadrisepsleri, uyluk kemiğinin üzerindeki kasın bir kısmı yukarı bakacak şekilde ters çevirin.

Kuadriseps kasını forseps ile yelpaze hareketiyle açın. Her lobdan görünen iki kırmızı kas kısmını çıkarın ve bunları beş mililitre soğutulmuş mitokondri içeren bir behere yerleştirin. İzolasyon tamponu.

Bir sonraki adımda, aşil tendonunun üzerindeki cildi ince uçlu makasla kesin ve cildi fareye doğru soyun. Açıkta kalan aşil tendonunu kesin ve kası farenin gövdesine doğru soyun. Gastroknemiusu serbest bırakmak için tendonu femurun lateral ve medial kondillerinden kesin ve tendonlarına bağlı gastroknemiusu soğutulmuş PBS ile dolu bir tabağa yerleştirin.

Gastroknemius'u ters çevirin ve soleus kasını soyun. Soleus kasını beş mililitre soğutulmuş mitokondri içeren behere yerleştirin. İzolasyon tamponu.

Bir sonraki fan gastroc'u açtı ve üç görsel kırmızı kas kısmını çıkardı. İki yan kısım ve bir medial yüzeysel kırmızı şerit olacaktır. İzole edildikten sonra, kırmızı kası beş mililitre soğutulmuş mitokondri içeren behere aktarın.

İzolasyon tamponu bir. Farenin diğer bacağından 75 ila 100 miligram daha kırmızı kas çıkarın. Az önce gösterilen işlemi tekrarlamak.

İkinci bacaktan disseke edilen kası, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanan proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ve hücre lizis tamponu ile 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Hemen yanıp sönün, ikinci numuneyi batı lekelemede kullanmak için sıvı nitrojen içinde dondurun. Büyük bir kovada buzun üzerine önceden geliştirilmiş düz bir plastik yüzey yerleştirin.

Daha sonra plastik yüzeye bir damla mitokondri izolasyon tamponu dökün ve kesitli tüm kırmızı kasları bir izolasyon damlasına yerleştirmek için cımbız kullanın. Arabellek. Tek kenarlı tıraş bıçağı kullanarak kas dokusunu iki dakika kıyın, her 40 saniyede bir yeni keskin bir tıraş bıçağına geçin. Kıyılmış dokuyu beş mililitre taze mitokondri içeren yeni bir behere aktarın.

İzolasyon tamponu bir. Daha sonra çözeltiyi alın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilmiş 100 mikronluk bir hücre süzgecinden boşaltın. Dokuyu hassas bir görev sileceği ile kurulayın ve ardından beş mililitre% 0.05 tryin çözeltisine aktarın.

Görev sileceğinden kalan dokuyu çıkarmak için cımbız kullanın ve tripsine ekleyin. Tripsin çözeltisindeki kas dokusunu buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneyi dört santigrat derecede üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, tripsin supinatı bir atık kabına dökün ve peleti üç mililitre buz gibi soğuk mitokondri izolasyon tamponu ile yeniden süspanse edin. Daha sonra dokuyu 45 mililitrelik bir cam homojenizatör tüpüne aktarın. 15 mililitrelik konik tüpü, kalan numuneyi toplamak için 1,5 mililitre başka bir mitokondri izolasyon tamponu ile durulayın ve bunu cam homojenizatör tüpüne ekleyin.

Ardından, cam homojenizatör tüpünü yarısına kadar buzla doldurulmuş bir behere veya plastik kaba yerleştirin. Böylece cam homojenizatör, beher içinde minimum düzeyde hareket eder. Numuneyi, motor tahrikli bir dokuya bağlı bir politetrafloroetilen havaneli ile homojenize edin.

80 RPM'de 10'lu homojenizatör. Her geçişin altını yaklaşık iki saniye basılı tutun. Daha sonra doku homojenatını 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın.

Ve cam homojenizatör tüpünü 6,5 mililitre mitokondri izolasyon tamponu ile durulayın. Tamponu, dokunun geri kalanını içeren 15 mililitrelik konik tüpe dökün. Homojenize. Numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 700 kez G'de döndürün ve ardından supinatı yavaşça yüksek mukavemetli bir cam santrifüj tüpüne dökün ve peleti atın.

Daha sonra, snat'ı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 8.000 kez G'de döndürün. Mitokondriyi peletlemek için, snat'ı çıkarın ve 500 mikrolitre mitokondri izolasyon tamponu ikisini yavaşça ekleyerek peleti yeniden süspanse edin, bir pipet ucunun ucunu kesin ve karıştırma ve karıştırma hareketleriyle tampondaki peleti nazikçe homojenize edin. Sonra 4,5 mililitre daha mitokondri izolasyonu ekleyin.

Karışıma iki tampon yapın Pelet tamamen süspanse edildikten sonra, mitokondriyi tekrar peletlemek için homojenatı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 8.000 kez G'de döndürün. S süpernatanı çıkarın ve 2 25 mikrolitrelik mitokondri izolasyonu artışları ekleyerek peleti nazikçe ama tamamen yeniden süspanse edin. İkinci tampon, ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, her 25 mikrolitre tampon baskısından sonra peleti hafifçe karıştırın ve karıştırın.

Bitirdiğinizde, bu mitokondriyal stoğu buzun üzerine yerleştirin. Yüksek saflıkta suda mitokondriyal stoğun iki ayrı bir ila 20 seyreltmesini yapın. Bir örneğe% 0.1 Triton 100 x ekleyin ve düşük bir ayarda 10 saniye boyunca sonikasyon yapın.

Diğer seyreltmeyi buz üzerinde bırakın ve sonikasyonlu numuneyi buza geri koyun. Sonikasyondan sonra, standart teknikler kullanarak bir fotometrik test kullanarak hem sonikasyonlu hem de sonikasyonlu mitokondriyal seyreltme ile bir sitrat sentaz testi gerçekleştirin, ekteki metin protokolünde sağlanan denklemleri kullanarak bozulmamış mitokondri zarlarının yüzdesini belirleyin. Mitokondrinin sendikatasyonu, sitrat sentaz aktivitesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden olur.

Sonikasyonlu olmayan mitokondriyal numunelerde sitrat sintaz aktivitesi, sonikasyonlu numunelerle karşılaştırıldığında, mitokondrinin% 92.5'inin ga'nın izolasyon ekspresyonunu takiben sağlam olduğunu gösterir. DH ve COX dört, izole edilmiş mitokondri ekspresyonu olan tüm doku lizatında belirgindir, Cox dördünün ekspresyonu gözlenir. GA DH'nin sadece soluk bantları belirgin olsa da, bu bulgular izolasyon prosedürü sırasında mitokondriyal olmayan bileşenlerden çok az kontaminasyon ile iyi mitokondriyal izolasyonları göstermektedir.

Bu prosedürü denerken, mitokondriyal stoğu dikkatli bir şekilde kullanmayı, bu prosedürü takiben asla girdap yapmamayı veya kuvvetli bir şekilde karıştırmamayı unutmamak önemlidir. Bir müdahalenin izole mitokondride reaktif oksijen türleri üretimini etkileyip etkilemediği gibi ek soruları yanıtlamak için reaktif eylem türü üretimini ölçmek gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.