Name: Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi İn Vivo: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli Candida albicans Ve Pseudomonas aeruginosa Airways (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Keşfedin Candida albicans ve Pseudomonas aeruginosa arasındaki mikrobiyal etkileşimleri fare modeli kullanarak in vivo. Bu yöntem, ventilatör ilişkili pnömoni patogenezini anlamak için klinik olarak değerli veriler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Lille Üniversitesi'ne ve Lille Pasteur Enstitüsü'ne, özellikle de hayvan barınağı, yetiştirme güvenliği ve yetiştiriciliğinden sorumlu Thierry Chassat ve Jean-Pierre Decavel'e teşekkür eder. Bu çalışma "Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française" (SPILF) tarafından desteklenmiştir.

Hayvan deneylerinde bölgesel etik kurul bölgesel araştırma araştırma kılavuzlarında ulusal ve uluslararası hayvan bakımı ve kullanımı ile uygun olarak bu yöntemi onayladı. 1. Numune Toplama <ol><li> Örnek depolama <ol><li> Bozulmasını önlemek için dondurucu saklama kadar 20 ° C veya buz üzerinde - en depolamak hemen tüm örnekleri toplamak ve. Bronko-alveol lavaj (BAL) performansını artırmak için buz üzerinde, steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) yerleştirin. </li></ol></li><li> Cerrahlık <ol><li> Bir otoklav kullanarak tüm cerrahi ekipman sterilize edin. NOT: Eğer mümkünse, bu çapraz bulaşmayı önlemek için karın ve göğüs adımlar için araçların iki farklı ayarlar kullanılması tavsiye edilir. Gerekli diseksiyon ekipmanları Şekil 4A ayrıntılı olarak </li></ol></li></ol> 2. Fareler, Bakteriyel ve Maya Türler <ol><li> Yeniden hayvanların yerel kullanım uygun Ev farelerinedeniyle biyogüvenlik düzeyi 2 mikro organizmaların kullanımına bir biyogüvenlik düzeyi 2 konut tesisi, gıda ve suyla birlikte, kafes başına 5 fare aşmadan havalandırılan bir rafa arama komitesi kuralları: P. aeruginosa ve C. albicans arasından seçilir. </li><li> 40% gliserol ortamında -80 ° C sıcaklıkta bakteriyel suşlar tutun. <ol><li> 10 ul aşılama döngü kullanarak steril Luria-Bertani suyu 3 ml içeren kültür tüpüne donmuş stoktan doğrudan bakteri ekleyin. Orbital çalkalama (400 rpm) 37 ° C&#39;de uygulanmasından önce gün O / N bırakın. </li><li> Santrifüj Hasat bakteri 5 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de. </li><li> Uygun bir kapalı biyolojik tehlikeli atık bertaraf içine süpernatant aspire. Kültür tüpünün dibinde beyaz yapışık pelet gözlemleyin. </li><li> Yıkayın ve 5 ml PBS ile pelet askıya. </li><li> Tekrarlayın ikinci yıkama gerçekleştirmek için ikinci kez 2.2.3 için 2.2.2 adımlar. </li><li> 1 ml PBS ile yeniden süspanse edin topak haline bakterive kısa vorteksleme. </li><li> Optik yoğunluk ölçer kullanılarak 600 nm&#39;de optik dansitometresi kullanılarak aşı yoğunluğunun belirlenmesi. 0.9 bir yoğunlukta PAO1 10 9 CFU / ml sine tekabül eder, buna bağlı olarak seyreltilir. NOT: Bu sonuç, kalibre edilmiş bir aşı ardışık seyreltiler yoğunluğunu belirlemek her kullanılan bir suş için elde edilmelidir. </li><li> Seri logaritmik seyreltme inokülumu doğrulayın ve bromokrezol mor ağar (BCP) plakaları ve O / N kültürü üzerine her seyreltme 100 ul plaka. Her fareye, ml başına 1 x 10 8 8 x 10 ila 2 CFU (fare başına 5 x 10 6 7 x10 1 CFU) içeren çözeltinin intranazal 50 ul uygulayın. </li></ol></li><li> Kullanım C. Bir referans suş olarak albicans SC5314. -80 ° C&#39;de 40% gliserol ortamında suşu koruyun. <ol><li> Bakteriyel kontaminasyonu önlemek ve daha fazla saymak kolaylaştırmak için% 0.015 amikasin ile Maya-Pepton-Dekstroz suyu Supplement. </li><li> &amp; 10 ile mayayı ekleyin# 181; 37 ° C &#39;de amikasin O / N ile takviye hazırlanmıştır YPD-suyu içine l aşılama döngü. </li><li> 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj ile hasat maya. </li><li> Uygun bir bioharzard atık bertarafı içine süpernatantı. Beyaz yapışık pelet kültür tüpünün dibinde dikkat edilmelidir. </li><li> Yıkama PBS ve kısa vorteks 5 ml kullanılarak topak haline bakteri askıya alma ve. </li><li> Tekrarlayın ikinci yıkama gerçekleştirmek için ikinci kez 2.2.3 için 2.2.2 adımlar. </li><li> PBS ve kısa karıştırın 1 ml kullanılarak pelletini. </li><li> 40x büyütme standart bir mikroskop kullanılarak bir Mallassez hematositometre üzerinde sayılarak inokulum boyutunu belirler. Not: (maya sayısı x 10 5) / (Mallassez hematositometre ile sayılmıştır ızgara dikdörtgenler sayısı): Konsantrasyon (CFU / ml) aşağıdaki formül kullanılarak elde edilir. </li><li> Bu çözüm içeren onaylamak için 10 -5 ve 10 -6 seri logaritmik seyreltme ile doğrulayın 2 x 10 6 CFU / ml. </li><li> YPD agar plakaları üzerinde Plaka% 0.015 amikasin ile desteklenmiş. </li></ol></li></ol> C. 3. Airways Kolonizasyon albicans Not: çevreye uyum sonra, farelere günde iki kez tartılmıştır. <ol><li> Davlumbaz altında, 4 cm x 4 cm gazlı bez (açık-drop tekniği) 14 üzerine Sevofluran mevduat 500 ul. <ol><li> Hemen yaklaşık 750 ml indüksiyon odasının zemininde gazlı bez yerleştirin. Hemen hayvan ve gazlı bez arasında doğrudan temasını önlemek için gazlı bez üzerinde bir örgü kaldırdı bir platform yerleştirin. </li><li> Hava geçirmez Kapağı kapatın ve odasında Sevofluran yayılmasına imkan 1 dk 2 bekleyin. </li><li> Platformu ve yakın kapak mesh kafes fare aktarın. Korunmuş spontan solunum Işık anestezi 30 ila 45 sn sağlanmalıdır. </li><li> Fare f çıkarılabilir bu noktada refleksi kaybı gözlemleyerek hipotoni için izlemekutu ve telkin rom. </li></ol></li><li> İntranazal instilasyon (eğitimli bir operatör 10 saniye içinde) yapılabilir. <ol><li> Dik tutulan Sırtında (Şekil 4B) sokuldu tek elli fareyi tutun. </li><li> Işaret parmağı kullanarak, baş desteklemek ve çeneyi tutmak için başparmak kullanın balgam (Şekil 4C) önlemek için kapalı. </li><li> Aşama 2.3.8 de tarif edildiği gibi, hazırlanan C sağlamak albicans çözüm hacmini telkin bir 50 ul için ml başına 2 x10 6 CFU içermektedir. NOT: İkinci kritik nokta aşılanan birimdir. Daha düşük 50 ul yetersiz kolonizasyon veya havayolu homojen olmayan damlatma neden olabilir bir hacim, daha geniş bir hacim boğulma / boğulma ve ölüme neden olabilir. </li><li> Burun delikleri için pipet yaklaşarak içi nazal fareyi aşılamak. </li><li> Burun deliklerinde çözeltisi içeren bir kabarcık oluşturan bir 50 ul damla Pipet daha sonra spontaneousl tarafından teneffüsy nefes fare. </li><li> Bir kurtarma alanında yerleştirin Fare (örneğin, bir havai ısıtma lambası ile büyük, iyi havalandırılmış çıplak kafes). Fareler tam uyanış kadar izlenmesi gerekir. O sternum yatma ve doğrulma refleksi sürdürmek için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Bu noktada, bir fare normal muhafaza kafesine geri döndürülebilir. </li></ol></li></ol> 4. P. aeruginosa -kaynaklı Akut Akciğer Enfeksiyonu NOT: Fareler dört Aşağıdaki günlerde tartılır. Normalde, fareler C. sırasında kilo albicans aracılı havayolu kolonizasyonu (Şekil 2A). <ol><li> P ihtiva eden bir süspansiyon hazırlayın aeruginosa O / N büyüme (bölüm 2.2) sonra instilasyonunun gün. </li><li> (Bölüm 3.1) yukarıda tarif edildiği gibi kısa bir süre anestezi sevofluran inhale kullanılarak. NOT: Akut akciğer enfeksiyonu gerçekleştirmek için, önerilen bakteriyel yükü önerilenTablo 1. </li><li> Post-instillation kurtarma özel dikkat (bölüm 3.2) yukarıda tarif edildiği gibi fareyi aşılamak. </li></ol> Akciğer Hasarı Endeksi 5. ölçün <ol><li> FITC-işaretli albümin ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. Hayvan ötenazi önce bu çözelti 2 saat enjekte edilir. <ol><li> Uygun ekipman ile albümin-FITC 0.2 mg tartılır. </li><li> 1 ml PBS içinde 0.2 mg ekleyin. Kısaca vorteks. Derhal kullanılmadığı takdirde, ortam ışığına maruz kalmasını önlemek için folyo çözüm yerleştirin. </li><li> Her bir fare FITC-işaretli albumin çözeltisi intraperitoneal olarak 200 ul enjekte edilir. </li></ol></li><li> Ötenazi <ol><li> Geçen ağırlık verileri için fareler tartılır. </li><li> % 5.47 pentobarbital 300 ul: pentobarbitalin letal doz aşımı bir intra-peritonal enjeksiyon kullanılarak araştırma komitesi kurallarda hayvanlarda lokal kullanımı ile uygun olarak, tek fare öldürülür. </li><li> Kafesinden fareyi çıkarın ve l alıroperatör tarafından Ethal enjeksiyon. </li><li> Enjeksiyonu takiben, herhangi bir diğer hayvanlardan gizli bir kafes, tek başına fare aktarmak. Hareketin yokluğunda kadar fareyi gözlemleyin. Onay ölüm hareketi, özellikle de solunum hareketi, nabız eksikliği olmaması gereğidir. </li><li> Bu nedenle anestezik ne analjezikler olmadan, ölü hayvanlar üzerinde numunelerin cerrahi koleksiyon gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Cerrahi numune toplama: Göğüs aşama. NOT: steril koşullar oluşturmak için, her cerrahi biyo-güvenlik seviyesi 2 ortamında, steril ekipmanı ile ifa edilir. <ol><li> Cilde etanol uygulayın. Makasla orta karın için sternum orta hat cilt kesisi yapın. Her iki tarafta göğüs kafesi boyunca orta hat insizyon itibaren. Göğüs kafesi görselleştirmek için toraks iki tarafında cilt geri katlayın. </li><li> Sırayla clavicles yukarı doğru gidiyor her iki tarafta göğüs kafesi dikey bir kesi yapın kıç ile tüm göğüs ön duvarı dayamak için muktedirum kalp ve akciğerler (Şekil 5A, 5B) mükemmel görselleştirme sağlıyor. </li><li> Interventriküler arter yanındaki kalbi delinmesiyle ön heparined şırınga kullanarak kan toplayın. Plazmanın en az 100 ul elde etmek için 500 ul en az çekin. Buz üzerinde kan örneğini yerleştirin. </li><li> Trakea (Şekil 5B ve 5C) görselleştirmek için bir orta hat servikal insizyon gerçekleştirin. Dikkatle trakea etrafında fasya teşrih. Trakea (Şekil 5C ve 5D) arkasında bir dikiş yerleştirin. Ardından dikiş doğru lavajı sağlamak için cannulating iğnenin etrafına kapalı olacaktır. </li><li> 20-G modifiye gavaj iğne (Şekil 5D ve 4A) ile trakea boşaltın. Önceden yerleştirilen sütür ile kanüle trakea etrafında bir cerrahi düğüm. </li><li> Bronkoalveolar lavajlar (BAL) gerçekleştirmek için, yavaşça ve kademeli olarak enjekte ve akciğer / &#39;içine buz gibi soğuk PBS 500 ul çizin. I üzerinde örnek yerleştirince hücresel lizis önlemek için. </li><li> Adımı yineleyin 5.3.6, 3 kez 2 ml santrifüj tüpüne (Şekil 5E) içine 1500 ul BAL sıvısı ve havuz lavaj örneklerinin toplam elde etmek. </li><li> Göğüs akciğerleri çıkarın. 80 ° C - 1,5 ml santrifüj tüpüne (boyut, bir akciğer ya da lob yarısına karşılık gelmelidir) ve en hızlı bir şekilde saklamak akciğer segmenti yerleştirin. </li><li> Bakteriyel yük tespit ve buz üzerine yerleştirin PBS içeren bir önceden tartılmış hemoliz tüpü bir akciğer segmentleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Cerrahi numune toplama: Karın aşama. <ol><li> Karnın sol tarafında başka bir kesi yapın. Periton yoluyla dalak gözlemleyin. </li><li> Dalak çıkarın ve buz üzerinde ikinci bir hemoliz 1 ml PBS içeren tüp ve yerine koyun. </li></ol></li><li> Akciğer hasarı indeksi Not: Alveoler kapiler membran geçirgenliği ölçülerek değerlendirilir FITC etiketli albumin sızıntısını vasküler bölmeden alveoler-interstitial bölmesi. <ol><li> Santrifüj kan örneği ve 1500 x g&#39;de 10 dakika boyunca BAL sıvısı. Yeni santrifüj tüplerine süpernatantlar toplayın. Peletler işe plazma veya BAL hucrelere karşılık gelır ve buz üzerine yerleştirilir. </li><li> 96 çukurlu bir saydam plaka (300 | il kuyu) her bir kan yüzer (plazma, sarı) veya BAL süpernatanın 100 ul ekle. Hemen kullanılmadığı takdirde plaka üzerinde bir folyo koyun. </li><li> Floresan plazmada düzeyleri ve floresan mikroplaka okuyucu (; emisyon, 520 nm uyarma, 487 nm) kullanılarak BAL süpernatantlar ölçün. </li><li> Floresan oranı hesaplayarak akciğer hasarı indeksi belirleyin [(BAL süpernatanı / kan süpernatant) x 100]. </li></ol></li><li> Bronkoalveoler lavaj (BAL) diferansiyel hücre sayımı. Not: Adım 5.5.1 BAL sıvısının santrifüj elde edilen hücre pelletini kullanın. <ol><li> Gerekirse, kırmızı hücre lisis tampon kullanın. Cel ihtiva eden bir santrifüj tüpüne kırmızı hücre lisis tampon 500 ul eklel pelet. Kısaca vorteks ve buz üzerinde 10 dakika bekletin. Kırmızı-hücre parçalama durdurmak için 500 ul PBS ekleyin. </li><li> 1,500 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile hasat hücreleri. Süpernatantı ve steril PBS 1 ml hücre pelet askıya. Hücreleri Count bir Hemasitometre kullanarak. Bir Mallassez hematositometre üzerinde hücreleri numaralandırmak. Bir Sitospin bir slayt hücreleri konsantre. </li><li> Hücre tanımlama ve sayımı (makrofajlar, lenfositler, nötrofiller) izin renklenme kiti kullanılarak leke hücreleri. </li></ol></li><li> Akciğer bakteriyel yükü ve bakteriyel yayma Not: Akciğer bakteriyel yükün ve bakteriyel yayma, akciğer ve dalak değerlendirmek için, sırasıyla toplanmış ve PBS (aşama 5.3.9) 1 ml ihtiva eden önceden tartılmış hemoliz tüpleri içine depolanmıştır. <ol><li> 1 ml PBS ve akciğer veya dalak birini içeren hemoliz tüpleri tartılır. Akciğer homojenatları ve dalak homojenatları elde etmek için bir doku homojenleştirici ile örnekleri homojenize. </li><li> Doku homo 100 ul yatırınSeri seyreltiler logaritmik elde etmek için steril PBS 900 ul ihtiva eden santrifüj tüplerine genates. </li><li> P. BCP-agar ya da üzerinde son iki uygun seyreltilmiş örnekleri (10 -3 ve 10 -2) Plakalı aeruginosa veya C için agar YPD-amikasin-desteklenmiş albicans akciğer ve dalak yükü tayini. </li><li> 37 ° C&#39;de plakaları O / N inkübe edin. Ertesi gün, plakalar üzerinde koloniler numaralandırmak. </li><li> Ana akciğer ağırlığı sonucu akciğer gramı başına CFU elde edildi. Akciğer örneklem büyüklükleri sonuçları akciğer gram başına CFU olarak ifade edilmelidir, aynı değildir. Dizin için formül şöyledir: [CFU] x [hemoliz tüpü ağırlığı ve akciğer] - [hemoliz tüpü ağırlığı]. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Casadevall, A., Pirofski, L. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+damage-response+framework+of+microbial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">The damage-response framework of microbial pathogenesis.</a> Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).</li>
<li>Eddens, T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defenses+against+bacterial+lower+respiratory+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opi.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection.</a> Curr. Opi. Immunol. , (2012).</li>
<li>Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+research+%3A+J.+Lab.+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the lung.</a> Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).</li>
<li>Hogan, D. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Candida+interactions%3A+an+ecological+role+for+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors.</a> Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).</li>
<li>Nseir, S., Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+and+Candida+albicans%3A+do+they+really+need+to+stick+together%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Gibbons, D. L., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+intestinal+immunity%3A+same+ballpark%2C+different+players%3B+different+rules%2C+same+score%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score.</a> Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).</li>
<li>Ariffin, J. K., Sweet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+repertoire%2C+regulation+and+function+of+Toll-like+Receptors+and+inflammasome-forming+Nod-like+Receptors+between+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opi.+Micro.%22%5BJournal%5D)">Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse.</a> Curr. Opi. Micro.. , (2013).</li>
<li>Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilator-Induced+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22NEJM%22%5BJournal%5D)">Ventilator-Induced Lung Injury.</a> NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).</li>
<li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medically+important+bacterial-fungal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li>
<li>Roux, D., Gaudry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+impairs+macrophage+function+and+facilitates+Pseudomonas+aeruginosa+pneumonia+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).</li>
<li>Mear, J. B., Gosset, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).</li>
<li>Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+Candida+albicans+colonization+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+load+and+lung+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+care%22%5BJournal%5D)">Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model.</a> Crit. care. , 1-33 (2009).</li>
<li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).</li>
<li>Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice%3A+comparison+with+125I-albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).</li>
<li>Faure, E., Mear, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+type-3+secretion+system+dampens+host+defense+by+exploiting+the+NLRC4-coupled+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).</li>
<li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medically+important+bacterial-fungal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Hayvan modelleri, özellikle memeliler, bağışıklık alanlarında-konak etkileşimin karmaşık mekanizmalar aydınlatmak için yararlıdır. Tabii ki, sadece gerekli olmalıdır hayvan modellerinden elde bilgiye ihtiyaç; aksi halde, hayvanların kullanımı in vitro modelleri ile değiştirilmelidir. Bu hayvan modeli patojen arasındaki etkileşim çok bileşenli bir konakçı tepkisi tarafından aracılık edildiği için, sadece bir hayvan modeli ile temin edilebilir fikir göstermektedir. Bu konak-patojen etkileşimi incelemek için kulla...

Hayvan modelleri, özellikle de fare, yoğun patojenlere karşı bağışıklık karşılıklarını keşfetmek için kullanılmıştır. Doğuştan ve edinsel bağışıklık kemirgenler ve insanlarda 7 arasında farklılık göstermekle birlikte, ıslah kolaylığı ve çok sayıda genler için tırnakları geliştirilmesi, bağışıklık tepkilerini 8 incelemek için farelere mükemmel bir model olun. Bağışıklık tepkisi karmaşıktır ve bir patojenin etkileşimi sonucu, yerleşik flora ve çeşitli immün (lenfositler, nötrofiller, makrofajlar) ve non-immün (epitel hücrelerinde, endotel hücreleri) hücre türleri 2. İn vitro çalışmalar, gözlem izin vermez Bu karmaşık etkileşimler ve ağırlıklı olarak benzersiz hücre-patojen etkileşimleri odaklanın. Hayvan modelleri dikkatle kullanılmalıdır ve çok özel ve ilgili sorulara sınırlı olmalıdır iken, fare modelleri in vivo memeli bağışıklık tepkisi içine iyi bir fikir verir ve önemli klinik sorulara 7 bölümlerini hitap edebilir. 6 çok sayıda ilişkilendirme karmaşıktır. Ne bir &quot;normal&quot; bir hava yolu mikrobiyomları teşkil belirlenecek devam ederken, yerleşik topluluklar sık ​​sık polimikrobiyaldir, ve çeşitli ekolojik kaynaklardan. Süpüratif kronik akciğer hastalığı (kistik fibrozis, bronchectasis) olan hastalar ya da mekanik ventilasyon hastalar çevre edinilen mikroorganizmalar 9 ile bağlı solunum yollarının kolonizasyonu belirli bir bitki örtüsü sergilerler. Pseudomonas aeruginosa ve Candida albicans, hem sorun sık sık trakeobronşiyal örneklerinden birlikte izole, 5 patojenler olan ve özellikle yoğun bakım ünitesi (YBÜ) 4, bu hastalarda şiddetli fırsatçı enfeksiyon sorumlu değildir. P. karşı anti-mikrobiyal tedavi YBÜ sonuçlarında akut pnömoni sırasında bu mikroorganizmaların izolasyonu aeruginosa but maya genellikle bu sitede 5&#39;de patojenik olarak kabul edilmez. P. arasındaki In vitro etkileşimleri aeruginosa ve C. albicans yaygın bildirilen ve bu mikroorganizmaların büyümesini ve birbirlerinin yaşam süresini etkiler ancak çalışmalar sonucuna olamayacağını gösterdi olması halinde C. varlığı albicans konak 10 zararlı veya yararlı olduğunu. Fare modelleri P. bu alaka yönelik geliştirilen aeruginosa ve C. in vivo albicans, ancak mikroorganizmalar arasındaki etkileşim önemli nokta değildi. Nitekim, model C katılımını değerlendirmek için kurulmuştur konak immün yanıtın ve sonucun albicans. Roux ve arkadaşları tarafından kurulan bir önceki model zaten C ile ilk kolonizasyon kullanılan albicans P. tarafından uyarılan akut akciğer enfeksiyonu takiben aeruginosa. Onların modeli kullanarak, yazarlar p zararlı rolünü bulunduanterior C. albicans 11 kolonizasyon. Ancak Roux ve arkadaşları C&#39;lik bir yüksek yük kullanılan 3 ardışık gün boyunca 2 x 10 6 CFU / fare ile modelinde albicans arasından seçilir. Biz C&#39;lik bir 4 günlük bir modeli kurulmuş albicans havayolu kolonizasyonu veya bu modelde C akciğer hasarı olmadan en az sebat, az albicans fare (Şekil 2B) 12,13 başına 10 5 CFU tek bir uygulamasından sonra 4 gün öncesine kadar geri alındı. 4 gün sonra, iltihaplı hücre alımı, enflamatuar sitokin üretimini ne de epitel hasarı bir kanıt gözlenmedi. C tepe varlığı, 48 saat, - 24 &#39;de albicans, hücre ve sitokin doğal immün yanıt gözlemlendi bile, akciğer hasarı hiçbir kanıt yoktu. Şaşırtıcı bir şekilde, fareler, böylece C ile kolonize P. instilasyonunu intranazal albicans 48 saat önce aeruginosa P. ile farelere kıyasla enfeksiyonu zayıflatılmış olan yalnız aeruginosa enfeksiyonu. benndeed fareler az akciğer hasarını sergilenen ve bakteriyel yükün 12,13 azalmıştır. Birkaç hipotezler C ile önceden kolonizasyon bu olumlu etkisi açıklayabilir P. albicans aeruginosa akut akciğer enfeksiyonu aracılı. Birincisi, her mikroorganizmaları nisabı-algılama sistemleri, homoserinelactone tabanlı P. karıştığı bir türler arası çapraz konuşma aeruginosa sistemi ve farnesol tabanlı C. albicans sistemi değerlendirildi. İkinci olarak, C. akciğer epitel hücrelerinden patojenin aktarma P. aeruginosa için &quot;tuzak&quot; bir hedef olarak hareket albicans çalışılmıştır. Her iki hipotez (yayınlanmamış veri) geçersiz bulundu. Üçüncü hipotez C. tarafından doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir &quot;priming&quot; o oldu P. karşı geliştirilmiş bir sonraki doğal tepki sorumlu albicans aeruginosa. Bu son hipotez doğrulanmıştır. Nitekim C. albicans kolonizasyon doğal bağışıklık bir prime throu yol açtıGH IL-22, özellikle artan bakteriyel boşlukla sonuçlanan, doğuştan gelen lemfoid hücreleri tarafından salgılanır ve akciğer hasarını 12 azalttı. Sonuç olarak, bir ev sahibi doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin modüle edilmesi ve farklı enflamatuar hücre tipleri kapsayan mikroorganizmalar arasındaki etkileşimde bir rol oynamaktadır. Bu karmaşık etkileşmeler bağışıklık in vitro parçalara edilebilir olsa da, ilk hipotez, sadece in vivo modeller, uygun sağlanabilir. Aşağıdaki protokol, diğerleri mikroorganizmalar adapte edilebilir konukçunun yol açtığı patojen etkileşimi üzerinde in vivo çalışmalara bir örnek sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Sevorane, Sevoflurane</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>250 ml plastik şişe</td></tr><tr><td>Floresan Okuyucu Mithras&nbsp; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>referansı ilk sütunda</td><td>yorum yok</td></tr><tr><td>Bromo-cresol mor agar</td><td>Biomerieux</td><td>43021</td><td>birim başına 20x</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique% 5.47</td> <td>CEVA</td><td>6742145</td><td>100 ml plastik şişe</td></tr><tr><td>2 başlı valf&nbsp;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>yorum yok</td></tr><tr><td>Steril aşılama döngüsü 10 & mikro; l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>x1.000 koşullandırma</td></tr><tr><td>Insuline şırıngaları 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>başına 100 koşullandırma</td></tr><tr><td>2 pozisyon Kültür tüpü 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>yorum yok</td></tr><tr><td>Ultrospec 10&nbsp;</td><td>General Electric yaşam bilimleri</td><td>80-2116-30</td><td>yorum yok</td></tr><tr><td>Hemoliz tüpleri 13 x 75 mm&nbsp;</td><td>100</td>PBS başına <td>Gosselin</td><td>W1773X</td></tr><tr><td>- Fosfat Tamponlu Tuzlu Ömür</td><td>teknolojileri</td><td>10010023</td><td>10 nbsp'de 500 ml</td></tr><tr><td>amikasin 1 g</td><td>Mylan</td><td>62516778</td><td></td></tr> paketlenmiştir;<tr><td>Heparin 10.000 UI 2 ml Pan</td><td>pharma</td><td>9128701</td><td>birim başına 10x</td></tr><tr><td>RAL 555 renklendirme kiti</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>100 mL'lik 3 flacon</td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpü</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>Şeffaf 300 ve mikro; l 96 oyuklu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>yorum yok</td></tr><tr><td>Yest-peptone-Dekstroz Suyu</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>toz</td></tr><tr><td>FITC-albümin</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>toz</td></tr><tr><td>Luria Bertani Et</td><td>suyu Sigma</td><td>L3022</td><td>toz</td></tr><tr><td>25 gauge iğne</td><td>Terumo veya unisharp</td><td>A231</td><td>x 100 şartlandırma</td></tr><tr><td>Sitosantrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>yorum yok</td></tr></tbody></table>

mikrobiyal toplulukları incelenmesi<em&gt; İn vivo</em&gt;: arası ana aracılı etkileşim modeli<em&gt; candida albicans</em&gt; ve<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Konak-patojen etkileşimi incelenmesi mikrobik enfeksiyon sırasında patojenite altında yatan mekanizmaları anlamak için bize sağlar. Ev sahibi prognozu patojenin 1 karşı adapte bağışıklık tepkisinin katılımı bağlıdır. İmmün cevap patojenler ve çeşitli immün ya da non-immun hücre tiplerinin 2 etkileşiminden karmaşık ve sonuçlar olduğunu. In vitro çalışmalar, bu etkileşimlerin karakterize ve hücre-patojen etkileşimleri odaklanmak olamaz. Dahası, özellikle süpüratif kronik akciğer hastalığı olan veya mekanik ventilasyon uygulanan hastalarda hastalarda havayolu 3&#39;te, polimikrobial topluluklar mevcut ve konak-patojen etkileşimi zorlaştırıyor. Pseudomonas aeruginosa ve Candida albicans, hem sorun sık sık trakeobronşiyal örneklerinden izole, 4 patojenler olup, Özellikle yoğun bakım ünitesinde 5, şiddetli enfeksiyonlara ilişkili. Mikrobiyal etkileşimler varin vitro bu patojenlerin arasında bildirilen ancak bu etkileşimlerin klinik etkisi 6 belirsizliğini koruyor mu. C. Albicans ve P. arasındaki etkileşimleri incelemek aeruginosa, C. bir murin modelinde Bir P. tarafından takip albicans hava yolları kolonizasyonu, aeruginosa- aracılı akut akciğer enfeksiyonu yapıldı.

Protokol açıklaması sırasında önce gördüğümüz gibi, deney (: deney çizelgesi Şekil 1) tamamlamak için 5 gün gerekiyor. Bir operatör deney tüm çalışma sırasında İstenen ve 10 fareden maksimum süreçleri işleyebilir. Daha fazla hayvan gerekiyorsa, iki kişi özellikle cerrahi numune toplama için gereklidir. Gerçekten de, tüm numuneler son farelerde FITC etiketli albümin artmış pasif alveolar kapiler sızıntıyı önlemek için 2 saat altında toplanması gerekir. İlk adım C haz...

Konak-patojen etkileşimlerinin in vitro çalışması spesifik immün yanıtların karakterizasyonuna izin verirken, karmaşık yanıtların etkilerini gözlemlemek için in vivo modeller gereklidir. Candida albicans maruziyetini ve ardından Pseudomonas aeruginosa aracılı akciğer enfeksiyonunu kullanarak, ventilatörle ilişkili pnömoni patojenitesinde yer alan mikrobiyal etkileşimlerin bir fare modelini oluşturduk.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Bu prosedürün genel amacı, tek bir bakteri ile tek bir fungus arasındaki etkileşimleri incelemek için bir model oluşturmaktır. Bu çalışma, çapraz etkileşim ve türler arası diyalogda hangi faktörlerin rol oynadığı gibi, patojen etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu in vivo modelden elde edilen verilerin klinik geçerliliğe sahip olmasıdır.Mantarı intranazal olarak uygulamak için, önce mililitre başına iki çarpı on üzeri altıncı CFU C.albicans'ı steril PBS içinde seyreltin. Ardından, yetişkin bir hipotonik farenin düzeltme refleksinin kaybolduğunu onayladıktan sonra, fungal süspansiyondan en az 50 µL'yi 200 µL'lik bir pipete çekin. Şimdi, fareyi bir elinizle kavrayın ve hayvanın karnı yukarı bakacak şekilde sırt üstü yatırın.Fare konumlandırıldığında, fareyi tutan elin işaret parmağını başı desteklemek, başparmağını ise çeneyi kapalı tutmak için kullanın ve pipet ucunu hayvanın burnuna yaklaştırın. Ardından, 50 µL'lik bir mantar damlasını dikkatlice burun deliklerine damlatarak damlanın farenin kendiliğinden solunumuyla içeri çekilmesini sağlayın. Fare tamamen iyileşene kadar tek başına bir kafese yerleştirin.C.albica

studying-microbial-communities-vivo-model-host-mediated-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Kateter üzerinde biyofilmin oluştuğu ve C.albicans ile konakçı arasındaki etkileşimin klinik CRI ile iyi korelasyon gösterdiği C.albicans ile ilişkili kateterle ilişkili enfeksiyonun (CRI) bir fare modelini oluşturduk. Bu model, C.albicans biyofilmle ilişkili CRI için tarama tedavilerine yardımcı olarak klinik dönüşüm için bir temel oluşturur.

Farede Kateterle İlişkili Candida albicans Enfeksiyon Modeli

Bu protokol, oral kandidiyazisin bir fare modelinde antimikrobiyal Fotodinamik Terapinin (aPDT) uygulanmasını açıklar. aPDT, suda çözünür bir kurkuminoid ve mavi LED ışık karışımı kullanılarak gerçekleştirildi.

Oral Kandidiyazisin Murin Modelinde Kurkuminoid Aracılı Antimikrobiyal Fotodinamik Tedavi

Bu protokol, bakteri türleri arası etkileşimlerin etkisini araştırmak için kullanılabilecek kistik fibroz (KF) akciğerle ilgili dört tür polimikrobiyal biyofilm modelini tanımlar.

Topluluk fenotiplerini araştırmak için kistik fibrozla ilgili bir polimikrobiyal biyofilm yetiştirmek

Bu metodoloji, araştırma ve klinik laboratuvarlarda antimikrobiyal duyarlılık testi için kistik fibrozda bir polimikrobiyal biyofilm modelinin oluşturulmasına izin verir. Bu model, bir dizi çıktıda doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

Bu çalışma, kistik fibroz akciğer ortamını yansıtan Pseudomonas aeruginosa gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir agrega polimikrobiyal biyofilm modeli geliştirmek ve bir RNA ekstraksiyon protokolünü optimize etmek için bir çerçeveyi özetlemektedir. Uygulamalar, antimikrobiyal etkilerin değerlendirilmesini ve kistik fibroz ile ilgili koşullar altında antibiyotik alternatiflerinin çalışılmasını içerir.

Enfeksiyonla İlgili Gen Ekspresyonunu İncelemek için Kistik Fibroz Agregat Biyofilm Modeli

Bu protokol, mantar enfeksiyonu sırasında konak-patojen etkileşimlerini incelemek için planarial Schmidtea akdeniz deniz sistemini model sistem olarak kullanmak için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir rehber sunar. Yöntem, insan mantar patojeni Candida albicans ile planarian hayvanları enfekte etme prosedürünün üzerine inşa edilerek, tekrarlanabilirliği ve deneysel tutarlılığı artırmak için ayrıntılı rehberlik sağlar.

Schmidtea Akdeniz'de Candida albicans enfeksiyonu için Mantar Patogenezi ve Konak Savunmasını Araştırmak İçin Optimize Edilmiş Bir Protokol

Keşfedin Candida albicans ve Pseudomonas aeruginosa arasındaki mikrobiyal etkileşimleri fare modeli kullanarak in vivo. Bu yöntem, ventilatör ilişkili pnömoni patogenezini anlamak için klinik olarak değerli veriler sağlar.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi İn Vivo: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli Candida albicans Ve Pseudomonas aeruginosa Airways (Video) | JoVE Journal

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi

Daha fazla video keşfet