Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi

Bu prosedürün genel amacı, tek bir bakteri ile tek bir fungus arasındaki etkileşimleri incelemek için bir model oluşturmaktır. Bu çalışma, çapraz etkileşim ve türler arası diyalogda hangi faktörlerin rol oynadığı gibi, patojen etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu in vivo modelden elde edilen verilerin klinik geçerliliğe sahip olmasıdır.

Mantarı intranazal olarak uygulamak için, önce mililitre başına iki çarpı on üzeri altıncı CFU C.albicans'ı steril PBS içinde seyreltin. Ardından, yetişkin bir hipotonik farenin düzeltme refleksinin kaybolduğunu onayladıktan sonra, fungal süspansiyondan en az 50 µL'yi 200 µL'lik bir pipete çekin. Şimdi, fareyi bir elinizle kavrayın ve hayvanın karnı yukarı bakacak şekilde sırt üstü yatırın.

Fare konumlandırıldığında, fareyi tutan elin işaret parmağını başı desteklemek, başparmağını ise çeneyi kapalı tutmak için kullanın ve pipet ucunu hayvanın burnuna yaklaştırın. Ardından, 50 µL'lik bir mantar damlasını dikkatlice burun deliklerine damlatarak damlanın farenin kendiliğinden solunumuyla içeri çekilmesini sağlayın. Fare tamamen iyileşene kadar tek başına bir kafese yerleştirin.

C.albicans kurulumundan dört gün sonra, ötanize edilen hayvanın karnını tıraş edin ve ardından açığa çıkan cildi etanolle sterilize edin. Sonrasında, sternumdan karnın ortasına kadar cildi açmak için makas kullanın. Ardından, insizyonu orta hattın her iki yanındaki göğüs kafesi boyunca genişletin ve toraksın her iki yanındaki cildi geriye doğru katlayın.

Göğüs kafesi görünür hale geldiğinde, göğsün her iki tarafında köprücük kemiklerine doğru dikey bir insizyon yapın ve kalbi ile akciğerleri görüntülemek için tüm ön göğüs duvarını sternumu kullanarak geriye doğru yatırın. Ardından, önceden heparinize edilmiş bir şırınga kullanarak kalbi intraventriküler arterin yanından ponktüre edin ve minimum 500 µL kan çekin. Kan örneğini buz üzerine yerleştirin.

Ardından, trakeayı ortaya çıkarmak için orta hat boyunca servikal bir insizyon yapın. Trakea çevresindeki fasyayı dikkatlice diseke edin ve ardından trakeanın altına bir sütür yerleştirin. Sonrasında, trakeayı kateterize etmek için 20-gauge modifiye bir gavaj iğnesi kullanın ve kanülü daha önce yerleştirilen sütürle sabitleyin.

Bronkoalveoler lavaj gerçekleştirmek için, akciğere nazikçe 500 µL buz gibi soğuk PBS boşaltın. Ardından, lavaj sıvısını aspire edin ve sıvıyı buz üzerinde iki mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. İki adet daha 500 µL örnek topladıktan sonra, akciğerleri göğüs boşluğundan çıkarın ve hemen -80 °C'de saklamak üzere bir parça akciğeri 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.

Ardından, PBS içeren ve buz üzerinde bekletilen, önceden tartılmış başka bir hemoliz tüpüne bir parça akciğer dokusu yerleştirin. Son olarak, abdomenin sol tarafında bir insizyon yapın. Dalak dokusunu, bir mililitre PBS içeren ikinci bir hemoliz tüpüne alın ve tüpü buz üzerine yerleştirin.

Fare başına intranazal olarak 5 × 10⁵ CFU C.albicans uygulanmasıyla dört günlük bir kalıcılık modeli elde edilir. Bu dört gün boyunca fareler kilo alır ancak akciğer hasarı göstermezler. Bununla birlikte, inokülumun CFU miktarı arttıkça akciğer hasarı da artar.

Maksimum akciğer hasarı, enfeksiyondan sonraki 24 ila 36 saat arasında gözlemlenmiştir. Buna karşılık bakteriyel yük, her 24 saatte bir mililitre başına bir log CFU azalma göstermekle birlikte, her gün kümülatif bir bakteriyel yayılım artışı gözlemlenmiştir. Enfekte farelerden alınan bronkoalveoler lavajda nötrofillerin yaygın şekilde toplandığı, diferansiyel hücre sayımının ise %90 nötrofil ve %10 makrofaj lenfosit infiltre eden immün hücre popülasyonu sergilediği görülmüştür.

Bu prosedürün ardından, inflamatuar yanıtın karakterizasyonuna ilişkin ek soruları yanıtlamak için bronkoalveoler lavaj analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir Pseudomonas kolonizasyonu nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Lüminesans özellikli Candida ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken damlacık kontaminasyonunu önlemek için koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.