Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı pulsatif akış patolojilerinin endotel hücreleri üzerindeki etkilerini in vitro ortamda gözlemlemektir. Bu, öncelikle cam lamların kimyasal olarak işlenmesi ve akışa maruz kalma sırasında hücre tutunmasını sağlamak için protein ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir.

İkinci bir adım olarak, in vitro akışın literatürde açıklanan değerlerle karşılaştırılmasına olanak tanıyan akış pulsatilite indeksi belirlenir. Ardından, akış patolojilerine karşı hücre yanıtını ölçmek amacıyla hücre ekili lamlar akış sistemine bağlanır. Sonuçlar, optik mikroskopi ve immünofloresan boyama kullanılarak akış profillerine bağlı olarak morfoloji ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri göstermektedir.

Bu tekniğin peristaltik veya pulsatil pompalara göre temel avantajı, hastalıklı veya sağlıklı yanıtı taklit etmek için akış pulsatilitesini ayarlayabilme yeteneğidir. Bu, arteriyel hastalıklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, 75 milimetre x 50 milimetre x 1 milimetre ölçülerindeki yeni lamları temiz bir lam boyama kabına yerleştirin.

Ardından, lamları tamamen daldıracak kadar %20'lik sülfürik asit çözeltisi ekleyin ve ertesi gün asit çözeltisinde gece boyunca inkübe edin. Lamları, her seferinde beş dakika boyunca taze deiyonize suya daldırarak üç kez yıkayın. Durulama işlemi tamamlandıktan sonra, lamları 30 dakika boyunca asetonda, ardından gece boyunca asetondaki %6'lık three amino propyl trixi seline çözeltisinde bekletin.

Ardından, her yıkamadan sonra asetonu yenileyerek lamları saf aseton içerisinde beşer dakikalık üç yıkama ile durulayın. Daha sonra, her yıkamadan sonra deiyonize suyu yenileyerek lamları deiyonize su içerisinde beşer dakikalık üç yıkama ile yıkayın. Sonrasında lamları %1.5 glutaraldehit içerisine daldırın ve 60 dakika boyunca bekletin.

Çapraz bağlama işlemi tamamlandıktan sonra, her yıkama sonrası deiyonize suyu yenileyerek lamları deiyonize su ile iki kez yıkayın, ardından sterilize etmek için lamları 30 dakika boyunca %70 etanol içinde bekletin. Etanolü uzaklaştırın ve lamlar üzerinde kalan kalıntıların buharlaşmasını bekleyin. Kuruduktan sonra, lamları kısa bir süre steril deiyonize suya yerleştirerek yeniden hidrate edin.

Ardından, lam tutucuyu çıkarın ve 100 mm x 100 mm boyutunda kare bir Petri kabına yerleştirin. Laminar akışlı kabinde, fonksiyonelleştirilmiş lamı, hücre kültürü haznesine maruz kalacak yaklaşık alanı kaplayacak şekilde 25 µg/mL konsantrasyonundaki fibronectin çözeltisinden 1 mL ile kaplayın. Daha sonra kabın ağzını kapatın ve lamları 37 °C'de bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kalan çözeltiyi aspire edin ve %10 FBS içeren 1 mL DMEM içindeki 600.000 endotel hücreyi lamın kaplanmış tarafına ekleyin.

Hazneyi kapatın ve ardından hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 120 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra hücrelerin üzerine ek besiyeri ekleyin ve %70 ila %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar inkübasyona devam edin. Akış devresini, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı ve burada gösterildiği şekilde bağlayın; sönümleme haznesinin ve ultrasonik akış ölçerin doğru akış yönünde düzenlendiğinden emin olun.

Ardından, akış hattını, devreyi ve rezervuarı deiyonize su ile doldurun. Rezervuar çıkış tüpünün rezervuar hacminin içinde daldırılmış olduğundan emin olun. Daha sonra, bir akış ölçer kullanarak akış dalga formunu görüntüleyin.

Sıvı-hava hacim oranını değiştirmek için sönümleme odasındaki hava tahliye valfini açın. Hava tahliye valfini farklı sıvı seviyesi aralıklarında kapatın ve pulsatilite indeksini hesaplayın. İndeksi hesaplamak için, pikin VM max'i temsil ettiği akış dalga formunu değerlendirin.

Çukur v min değerini temsil eder ve V mean, sinyal kaydının ortalamasıdır. Puls index değerlerini bir deftere kaydedin. Gelecekte kullanmak üzere, sonuçlanan sıvı seviyesini ve pulsasyon indeksini keçe uçlu kalıcı bir mürekkep kalem kullanarak sönümleme odası üzerine işaretleyin.

Akış odası ısıtma işlemini hazırlarken, ekteki metin protokolünde referans verilen patoloji literatüründen istenen pulsatilite indeksi seviyelerini belirleyin. %1 FBS ile desteklenmiş DMEM'i 37 °C'lik bir su banyosunda bekletin. Hücre kaplı lamlardan birini, hücreler %70 ila %80 konfluans düzeyine ulaştığında medyadan çıkarın ve hücrelerin bulunduğu tarafın üzerine bir conta yerleştirin.

Ardından, akış hücresinin vakum kanalını contadaki deliklerle hizalayın. Daha sonra, vakum portlarına vakum hortumlarını takarak ortama vakum sızıntısı olmadığından emin olun. Cam lamın altına bir polikarbonat levha yerleştirin ve akış hücresi düzeneğini, akış hücresinin kısa kenarlarının her birine bir adet ve uzun kenarları boyunca iki adet yaylı klemps kullanarak sabitleyin.

Ardından akış odasını, girişi ve çıkışı akış devresine bağlayın. Akış sistemini 37 °C ve %5 karbondioksit değerlerine ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin; rezervuarı besiyeri ile doldurup düşük pulsatiliteyle pompalayarak devreyi önceden ısıtılmış besiyeri ile doldurun. Hücreleri ön koşullandırmak için bu akışı dört saat boyunca sürdürün.

Ardından, sönümleme odasındaki sıvı hacmini önceden işaretlenmiş pulsatilite indeksi seviyesine ayarlayın ve hücreleri istenen süre boyunca kültüre edin. Burada gösterilen endotel hücreleri; akışsız, sabit akışlı ve pulsatil akışlı koşullarda kültüre edilmiştir.

Yüksek pulsatil akıma 24 saat boyunca maruz kalındıktan sonra, morfolojide tipik endotel hücre morfolojisinden daha iğ benzeri bir morfolojiye doğru değişimler görülebilir. Statik ve sabit akımın her ikisi ise morfolojide çok az fark göstermekte veya hiç fark göstermemektedir. Düz kas hücreleri de, burada farklı alfa düz kas aktini ve miyozin ağır zincir seviyeleriyle belirtildiği üzere, yüksek pulsatil akıma maruz kalan endotel hücrelerle yapılan ko-kültürden etkilenmektedir.

Değişen akış koşulları boyunca, pulsatif akışa maruz kalan hücreler, hipertrofi ve kontraktilitenin göstergesi olan her iki proteinin de en yüksek miktarlarını göstermiştir. Bu prosedürü uygularken, tüm sızdırmazlıkların korunması ve prosedür sonrasında sıvı seviyelerinin sabit kalmasının sağlanması gerektiğini unutmamak önemlidir. Hücreden hücreye etkileşimler gibi ek soruları yanıtlamak için endotel hücre ve vasküler hücre ko-kültürü gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, akış devresinin nasıl kurulacağı, indeksin nasıl kontrol edileceği ve endotelyal hücrelerin nasıl pulsatif akışa maruz bırakılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.