Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış
3 Kasım 2015
Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre yanıtını belirlenmesinde yardımcı olmak için, in vitro olarak fizyolojik veya patolojik kan akışını çoğaltır. Kan pompası alt bölmeyi sönümleme bir basınç katılmasıyla, damar boyunca kan akımı değinmeyecek edilebilir ve vasküler endotelyum, ya da taklit eden ko-kültür, bir tek tabaka üzerine koydu.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı pulsatil akış patolojilerinin endotel hücreleri üzerindeki etkilerini gözlemlemektir. Laboratuvar ortamında. Bu, önce cam slaytların kimyasal olarak işlenmesi ve akışa maruz kalma sırasında hücre bağlanmasını sağlamak için protein ile kaplanmasıyla elde edilir.
İkinci adım olarak, akışın pulsatilite indeksi belirlenir, bu da in vitro akışın literatürde açıklanan değerlerle karşılaştırılmasına olanak tanır. Daha sonra hücre oturmalı slaytlar, akım patolojilerine hücre yanıtını ölçmek için akış sistemine bağlanır. Sonuçlar, optik mikroskopi ve immünofloresan boyama kullanılarak akış profillerine dayalı olarak morfoloji ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri göstermektedir.
Bu tekniğin peristaltik veya pulsatil pompaya göre ana avantajı, hastalıklı veya sağlıklı yanıtı taklit etmek için akış pulsatilitesini ayarlama yeteneğidir. Bu, arteriyel hastalık alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, 75 milimetre x 50 milimetre x bir milimetre ölçülerinde yeni cam slaytları temiz bir cam slayt boyama kabına yerleştirin.
Daha sonra, cam slaytları tamamen daldırmak için yeterli miktarda %20'lik bir sülfürik asit çözeltisi ekleyin ve ertesi gün gece boyunca asit çözeltisi içinde inkübe edin. Slaytları her seferinde beş dakika taze deiyonize suya batırarak üç kez yıkayın. Durulandıktan sonra, slaytları 30 dakika asetona batırın ve ardından gece boyunca aseton içinde% 6 üç amino propil trixi selin çözeltisine batırın.
Daha sonra, slaytları her yıkamadan sonra asetonu değiştirerek beş dakika boyunca saf asetonda üç kez durulayın. Daha sonra slaytları deiyonize suda üç kez beş dakika yıkayın ve her yıkamadan sonra deiyonize suyu değiştirin. Daha sonra slaytları %1,5 gluteraldehit içine daldırın ve 60 dakika su altında bırakın.
Çapraz bağlandıktan sonra, slaytları deiyonize suda iki kez yıkayın, deiyonize suyu değiştirin Her yıkamadan sonra, slaytları sterilize etmek için 30 dakika boyunca %70 etanole yerleştirin. Etanolü çıkarın ve kalan kalıntıların slaytlardan buharlaşmasına izin verin. Kuruduktan sonra, slaytları kısa bir süre steril deiyonize suya koyarak yeniden sulandırın.
Ardından, sürgü tutucuyu çıkarın ve 100 milimetreye 100 milimetre karelik bir Petri kabına yerleştirin. Laminer akış başlığında, hücre kültürü odasına maruz kalacak yaklaşık alanı kaplayan mililitre fibronektin çözeltisi başına bir mililitre 25 mikrogram ile işlevselleştirilmiş sürgü kaplanır. Daha sonra tabağı örtün ve slaytları bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin İnkübasyondan sonra, kalan çözeltiyi aspire edin ve 600.000 endotel hücresini bir mililitre DMEM'de% 10 FBS ile slaydın kaplanmış tarafına tohumlayın.
Odayı örtün ve ardından hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 120 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri ek ortamla örtün ve %70 ila 80 birleşene kadar inkübe etmeye devam edin. Akış devresini ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ve burada gösterildiği gibi bağlayın, sönümleme odasının ve ultrasonik akış ölçerin doğru akış yönünde düzenlendiğinden emin olun.
Ardından, akışı, devreyi ve rezervuarı deiyonize su ile doldurun. Rezervuar çıkış borusunun rezervuar hacmine daldırıldığından emin olun. Ardından bir akış ölçer kullanarak akış dalga biçimini görselleştirin.
Sıvı-hava hacim oranını değiştirmek için sönümleme odasındaki hava tahliye vanasını açın. Hava tahliye vanasını farklı sıvı seviyesi aralıklarında kapatın ve pulsatilite indeksini hesaplayın. Endeksi hesaplamak için, tepe noktası VM maksimumunu temsil ettiğinden akış dalga biçimini değerlendirin.
Oluk v min'i temsil eder ve V ortalaması sinyal kaydının ortalamasıdır. Bir not defterindeki puls indeksi değerleri. Elde edilen sıvı seviyesini ve nabız indeksini, ileride kullanmak üzere keçe uçlu kalıcı mürekkepli kalem kullanarak sönümleme haznesinde işaretleyin.
Akış odası ısınmasını hazırlarken ekteki metin protokolünde atıfta bulunulan patoloji literatüründen istenen pulsatilite indeksi seviyelerini belirleyin. DMEM, 37 santigrat derece su banyosunda% 1 FBS ile desteklenmiştir. Hücre kaplı slaytlardan birini, %70 ila 80 oranında birleştikten sonra ortamdan çıkarın ve hücrenin oturduğu tarafın üzerine bir conta yerleştirin.
Ardından, akış odasının vakum kanalını contadaki deliklerle hizalayın. Ardından, vakum borusunu vakum bağlantı noktalarına takın ve vakuma ortam sızmamasını sağlayın. Cam sürgünün altına bir polikarbonat levha yerleştirin ve akış odası düzeneğini, kısa kenarların her birinde bir yaylı kelepçe ve akış odasının uzun kenarları boyunca iki yaylı kelepçe ile sıkıştırın.
Ardından, akış odasını, girişi ve çıkışı akış devresine bağlayın. Akış sistemini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve rezervuarı ortamla doldurarak ve düşük titreşimde pompalayarak devreyi ön ısıtma ortamıyla doldurun. Hücreleri ön koşullandırmak için bu akışı dört saat boyunca koruyun.
Ardından sönümleme odasındaki sıvı hacmini önceden işaretlenmiş pulsatilite indeksi seviyesine ve kültüre ayarlayın. İstenilen süre boyunca hücreler. Burada gösterilen endotel hücreleri, akış yok, sabit akış ve pulsatil akış ile kültürlendi.
Morfolojideki değişiklikler, tipik endotel hücre morfolojisinden, yüksek pulsatil akışa maruz kaldıktan 24 saat sonra daha iğ benzeri bir morfolojiye kadar görülebilir. Hem statik hem de sabit akış morfolojide çok az fark gösterir veya hiç fark göstermez. Düz kas hücreleri ayrıca, burada farklı seviyelerde alfa, düz kas aktini ve miyozin ağır zinciri ile gösterildiği gibi, yüksek pulsatil akışa maruz kalan endotel hücreleri ile ko-kültürden etkilenir.
Değişen akış koşulları boyunca, pulsatil akışa maruz kalan hücreler, hipertrofi ve kasılmanın göstergesi olan her iki proteinin de en büyük miktarlarını gösterdi. Bu prosedürü denerken, tüm contaları korumayı ve bu prosedürü takiben sıvı seviyelerinin sabit kalmasını sağlamayı unutmamak önemlidir. Hücreden hücreye etkileşimler gibi ek sorulara cevap vermek için endotel hücresi, vasküler hücre ko-kültürü gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, akış devresinin nasıl monte edileceğini, indeksin nasıl kontrol edileceğini ve endotel hücrelerinin pulsatil akışa nasıl maruz bırakılacağını iyi anlamalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre tepkisini belirlemeye yardımcı olmak için fizyolojik veya patolojik kan akışını in vitro koşullarında çoğaltır. Deney, farklı darbesel akış patolojilerinin endotel hücreleri üzerindeki etkilerini gözlemleme üzerine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Vasküler Biyoloji
Arka Plan
- Endotel hücre tepkisini anlamak, damar hastalıklarını incelemek için çok önemlidir.
- Darbesel akış, in vitro koşullarda fizyolojik durumları taklit edebilir.
- Önceki çalışmalar, akış koşullarının hücre morfolojisi ve fonksiyonunu etkilediğini göstermiştir.
- Bu çalışma, daha iyi deneysel doğruluk için bu koşulları çoğaltmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Darbesel akış patolojilerinin endotel hücreleri üzerindeki etkilerini gözlemlemek.
- Damar araştırmaları için güvenilir bir in vitro model oluşturmak.
- Akış profilleri nedeniyle hücre morfolojisi ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri ölçmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre yapışması için cam slaytların kimyasal işleme tabi tutulması.
- Endotel hücre büyümesini kolaylaştırmak için slaytların protein ile kaplanması.
- Literatür ile karşılaştırma yapmak için akışın darbelilik indeksini belirleme.
- Hücrelerin oturduğu slaytları bir akış sistemine bağlayarak tepkileri ölçmek.
Ana Sonuçlar
- Farklı akış koşullarında endotel hücrelerinin morfolojisinde değişiklikler gözlendi.
- Uygulanan akış profillerine göre protein ekspresyon seviyeleri değişti.
- Sonuçları analiz etmek için optik mikroskopi ve immünofloresan boyama kullanıldı.
- Çalışma, akış patolojilerinin endotel davranışı üzerindeki etkileri hakkında bilgiler sağlamaktadır.
Sonuçlar
- Bu in vitro model, fizyolojik ve patolojik kan akışını etkili bir şekilde çoğaltır.
- Bulgular, damar hastalıklarında endotel hücre tepkilerini anlamaya katkıda bulunur.
- Metodoloji, damar biyolojisindeki diğer çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This in vitro flow model enables mechanistic de-risking of vascular targets by simulating physiological and pathological hemodynamics. It supports target validation through controlled modulation of pulsatility index to probe endothelial and smooth muscle cell responses. The system enhances predictive confidence in preclinical vascular research by linking flow dynamics to cytokine release and cross-talk mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating flow as an independent variable in vascular cell remodeling.
- Operational Value: Enables reproducible assessment of cell morphology and protein expression under defined flow conditions.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking hemodynamic stress to cytokine release and cell-type cross-talk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated co-culture systems for downstream compound screening in vascular disease models.
- Operational Value: Standardizes flow exposure via pressure damping chamber tuning for consistent pulsatility index control.
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (morphology, actin/myosin expression) for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant shear stress to study vascular cell remodeling in stenosis or hypertension contexts.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via tunable flow pathologies.
- Scientific Value: Addresses risk-adjusted advancement by identifying flow-dependent hypertrophy and contractility markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target engagement to lead optimization by providing hemodynamic context for vascular phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of flow-dependent pathways in endothelial dysfunction and vascular remodeling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell responses under controlled pulsatile and steady flow conditions.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell morphology and protein expression across flow profiles using imaging and staining.
- Translational Research: Connects hemodynamic stimuli to preclinical relevance through co-culture models reflecting arterial wall interactions.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular flow platform adaptable to multiple vascular cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by de-risking vascular targets through hemodynamic mechanism elucidation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via calibrated damping chamber and indexed flow waveforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing flow-dependent contractility and hypertrophy phenotypes early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets based on flow-responsive protein expression thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular cell culture and hemodynamic flow system setup.
- Depends on precision fluid handling, pressure damping chambers, and ultrasonic flow metering.
- Necessitates cross-team standardization of pulsatility index protocols for comparative studies.
- Involves adaptation considerations when extending to smooth muscle fibroblasts or co-culture configurations.
- Limited by approximation of complex physiological pulse waveforms, which may affect translational fidelity.
![Gelişim ve karakterizasyonu İn Vitro Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca 2+] I Ve Nitrik Oksit Üretimi](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-07-07T20%253A58%253A27.244Z&w=384&q=75)
