Name: Bir kesilmiş yaprak Testi ile Dikot Weeds Herbisit Metabolizma düşük Ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Öğrenin dikot yabani otlarda herbisit metabolizmasını kesilmiş yaprak testiyle hassas şekilde ölçme yöntemini. Bu teknik, varyasyonu azaltarak farklı popülasyonlarda metabolizma hızlarını güvenilir biçimde belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley ve Brittany Janney'e bitki büyümesi ve ekstraksiyonu konusundaki yardımları için, Dr. Anatoli Lygin'e kromatografik analizlerdeki yardımları için ve Syngenta Crop Protection'a finansman için teşekkür ederiz.

1. Bitki Malzeme Büyüme Koşullar ve Bitkisel Klonlama Not: Üç waterhemp nüfusları bu araştırmada incelenmiştir: MCR (Adams County, IL itibaren), ACR ve WCS (McLean County, IL itibaren) (Tablo 1) (Wayne County, IL itibaren). <ol><li> Toplamak ve 0.1 g L-1 agar içinde waterhemp tohumları askıya: çimlenmeyi artırmak için en az 30 gün süre ile 4 ° C &#39;de su çözeltisi. Not: Bazı waterhemp popülasyonları uykuda, ama bu adım dinlenmesi aşmak ve tohum daha muntazam çimlenme yapmak için yardımcı olur. </li><li> Bir serada saksı ortamı içeren 12 x 12 cm tepsilere (Tablo 1 &#39;de olduğu gibi), her waterhemp nüfusun tohum çimlenme. <ol><li> Bir 16/8 saat fotoperyod 12 içinde 28/22 ° C gündüz / gece sıcaklıklarında sera koşulları koruyun. </li><li> 500 umol m minimum sağlamak için cıva halide lambaları ışık serada doğal ışık Supplement -2 </sup&gt; Bitki gölgelik düzeyinde sn -1 foton akı. </li></ol></li><li> Onlar 80 cm serada 3 tencere içine 2 cm boyunda olduğunda Nakli fidan ortaya çıktı. </li><li> 1: 1: saksı karışımı 1 karışımı: Toprak: turba: kum fidanları 4 cm boyunda 950 cm 3 içeren 3 kap içine Nakli fidanları. Her tencereye yavaş salınımlı gübre granüllerinin 5 g ekleyin ve bu toprak karışımı ile karıştırın. </li><li> Apikal hakimiyetini ortadan kaldırmak için kesin ve 7 cm boyunda bitkilerden üç genç yaprakları içeren sürgün apikal meristemi kaldırın. Not: Bu adım her bitki klonlamak için yeterli 3 cm aksiller sürgünler büyüyecek olmasını sağlar. </li><li> Fideleri (Tablo 1 &#39;de olduğu gibi), her waterhemp popülasyonundan boyunda yaklaşık 14 cm olan tüketim beş aksiller filizleri (uzunluğu 3 cm). Daha fazla kullanım sırasında su kaybını azaltmak için bu aksiller sürgünlerde yaprak çoğunluğu çıkarın, ancak nakli üzerine daha fazla büyümesini sağlamak için iki genç yaprakları korumak. <br/&gt; Not: dikkatle tutun ve yaprakları sökerken sürgünler zarar vermemeye çalışın. Bir hissesini her bitkiyi etiketleyin. </li><li> Nakli Aksiller çimlenme için kullanılan aynı orta saksı ortamı içine 80 cm 3 tencere (saksı başına bir fide) içine vuruyor. Dolgu ortamı başlangıçta, doymuş bir büyüme odasında kökleri oluşana kadar, daha sonra kökleri oluşturmak için 7 gün boyunca bir büyüme odasında sabit bir nem ve yeri kaplar muhafaza edilmelidir. Not: Bitkiler bu noktada çok hassastır ve stresli olmamalıdır. <ol><li> Bir 16/8 saat fotoperyod 12 içinde 28/22 ° C gündüz / gece sıcaklıklarında büyüme odası koşulları koruyun. </li><li> Akkor ve floresan ampuller bir arada büyüme odasında ışık sağlamak için kullanılabilir ve en az 550 ľmol m -2 bitki gölgelik düzeyinde 12 at sn -1 foton akı teslim etmelidir. </li></ol></li><li> 950 cm 3 tencere içine tekrar Nakli (saksı başına bir fide) c1: 1: saksı karışımı 1 karışımı: Toprak: turba: 3 içeren gruptur klonlanmış bitkiler 4 cm boyunda olduğunda kum sonra tekrar seraya transfer (ayrıca 5 gr yavaş salınımlı gübre granülleri dahil). </li><li> Yukarıda açıklanan aynı yöntemi kullanarak bitkilere ikinci kez Clone (yani tekrar adımlar daha sonra 1.8 1.5 ve 2.1 den adıma geçin). Tipik bir zaman ders çalışması için, her waterhemp nüfus en az altı bağımsız bitkilerden klonlar oluşturmak ve çizgiler MCR 1-6, 1-6 ve ACR WCS 1-6 olarak kaydeder. <ol><li> Deneyi tekrar ve yeterli her waterhemp nüfus içindeki genetik değişkenliği temsil etmek için en az altı farklı &quot;üst&quot; klonal hatları oluşturulması. </li><li> Analiz edilecektir kaç zaman noktalarında bağlı olarak, zaman ders çalışma yürütmek için her bir &quot;ebeveyn&quot; klonal satırından yeterli alt klonları oluşturmak. </li></ol></li></ol> 2. eksize Waterhem ile Metabolizma Çalışması yürütmekp Yapraklar <ol><li> Klonlanmış waterhemp bitkiler herbisit metabolizması ve DT 50 analiz için uzun boylu 10 ila 12 cm ne üçüncü en genç yaprakları (ekli petiole 0.5 cm dahil uzunluğu 2 ila 3 cm) tüketim. </li><li> Her waterhemp bitkiden Kesme yaprak sapı ikinci kez su altında (yaprak sapı 0,3 cm kalmasını sağlayarak) ve Bu kesme 1,5 ml&#39;lik plastik tüplere (şişe başına bir yaprak) 15 içine sona yerleştirin. Not: su altında bir kez kesme biçimlendirilmiş ve odunsu doku damarları takmayı hava kabarcıkları önler. <ol><li> İlk olarak, kısmi olarak 1 saat süre ile 0.1 M Tris-HCl (pH 6) ile ön inkübasyon tampon maddesi (200 ul) kesme Petiol ile birlikte eksize yaprakları bırakın. </li><li> İkinci olarak, yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir şişe, 0.1 M Tris-HCl (pH 6) artı 150 uM [URL- 14C] herbisitin (200 ul), bir inkübasyon tampon içeren, her bir yaprak getirin ve 1 saat boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edin yaprak bitkilerine herbisit emme için izin verir. Not: Her iki 14 C-mezotrion ve <syukarı&gt; 14 C-primisulfuron-metil yaklaşık 20 mCi mmol belirli etkinlikler bizim çalışmalarda kullanılan -1. Ksilem transpirasyon akışı ile her ikisi de difüzyon ve alımı yaprak başına alınan herbisit miktarı katkıda bulunur. Not: herbisit metabolizması metabolik inhibitörlerinin etkisi, adım 2.2.1 yukarıda 2.2.2 değiştirerek belirlenebilir. Ön kuluçka tamponu inhibitörün 100 uM ekleyin ve sonra herbisit ile kuluçkalama tamponuna aktarma ve yeniden 100 uM inhibitörü ekleyin, 2 saat süre ile inkübe edin. Örneğin, malation ve tetcyclacis bitkiler 15-17 belirli sitokrom P450 aktivitelerini inhibe eder. </li><li> Deiyonize su ile eksize yaprakları dalmış kısmını yıkayın ve çeyrek gücü Murashige ve Skoog (MS) tuzları solüsyonu (500 ul), sırasıyla 0 saat, 5 saat, 11 saat, 23 saat veya 35 saat için eksize yaprakları transfer zaman akışı metabolizması çalışma için bir büyütme odasında. </li></ol></li><li> Izin kaldırarak HasatEl ile inkübasyon, uygun bir zaman noktasında çözeltisi ve S, bir polipropilen tüp (15 mi) ve cam havan tokmağı kullanarak sıvı azot içinde, her bir yaprak dokusu öğütün. </li><li> Radyo-etiketli herbisit ve yukarıdaki gibi aynı polipropilen tüp içinde laboratuar doku homojenizörü ile% 90 aseton 7 ml her yaprağın onun metabolitleri ekstrakte edin. % 90 aseton ek 7 ml doku homojenleştirici durulayın ve doku iyice (genellikle yaklaşık 2 dakika) toz haline gelene kadar homojenize devam eder. Not:% 90 aseton bitki dokularında en herbisitlerin ekstraksiyonu için de kullanılabilir. Bu yöntem emilen radyo-etiketli bileşikler% 90&#39;dan daha fazla elde etmek için mümkün olan, ancak, daha sonra% 90 metanol veya% 90 asetonitril özütleme çözücüsü gibi ikame edilebilir. </li><li> Ek çıkarma oluşması için Etiket% 90 aseton ekstreleri (14 ml toplam) ve mağaza da -4 16 saat C izin °. Not: işlenmiş yaprakların bu çekimi sonrasında, özütlenebilir rad miktarıioactivity işlenmiş yaprak tarafından emilen radyo-etiketli bileşiklerden en az% 98, tipik olarak. Eksize yapraklarda olmayan ekstrakte radyoaktivite (bağlanmış artıklar) daha önceki çalışmada 12 tüm zaman noktaları arasında sadece% 0.3 ortalama, fakat bu miktar incelenmiştir kullanılan herbisitin ve zaman noktasına göre değişebilir. </li><li> 0.5 ml&#39;lik bir nihai hacme kadar santrifüj 10 dakika boyunca 5000 x g&#39;de örnekler ve bir döner buharlaştırıcı ile 40 ° C &#39;de konsantre süpernatanlar elde edilir. 2.0 ml bir plastik tüpe Bu hacim aktarın. </li><li> Tesisinin son hacmi 1.25 ml özler ayarlayın ve yeniden santrifüj 10,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca herhangi bir partikülleri ortadan kaldırmak için: (1 hacim itibarı ile, 1) su: asetonitril ekleyin. </li><li> (Dpm ul -1), sıvı sintilasyon spektroskopisi (LSS) 12 ile her bir örnek alınan bir alikot toplam radyoaktivite ölçülür ve miktarlarını normalize (örneğin HPLC analizi için enjekte bileşikler, 10,00 [14C-etiketli]Sonuçları grafik zaman 0 toplam dpm / numune / run) yani y-eksenleri örnekleri arasında muntazam olacaktır. </li></ol> Kesilen Leaves Herbisit Metabolizma 3. HPLC Analizi Not: Aşağıdaki RP-HPLC koşulları 12 ile ana herbisit ve herbisit metabolitleri içine toplam ekstrakte radyoaktivite giderin. <ol><li> 1 ml dk bir akış oranında bir C18 kolonu (4.6 x 250 mm, analitik HPLC için 5 um parçacık boyutu) olan, RP-HPLC gerçekleştirme -1 en polar olmayan herbisit. Not: C 4 ya da Cı 12 RP-HPLC sütunları da onun metabolitleri ile ilgili ana yabani ot öldürücü ayrılmasını optimize etmek için kullanılabilir. Ön sütun filtresi ve / ya da koruyucu sütunu korunması ve RP kolonuna ömrünü uzatmak için kullanılabilmektedir. <ol><li> Eluent A, su içinde% 0.1 formik asit (hac / hac) ve Taşıyıcı B% 100 HPLC-grade asetonitril: RP-HPLC için aşağıdaki mobil faz kullanın. Not: HPLC-dereceli metanol El olarak kullanılabiliruent daha polar bileşikleri ve metabolitleri çözülmesi için B, ama tutma süreleri de değişebilir unutmayın. Not: araştırmamızda 12 kendi polar metabolitlerden mezotrion ya primisulfuron-metil çözmek için kullanılan elüsyon profili: Adım 1, A: B (4: 1, hac / hac): B (3: 2, hac / hac ) doğrusal gradyanı (12 dakika); B: A: (2, hac / hac 3): Aşama 2, bir B (3: 7, v / v) bir doğrusal gradyan (5 dakika); Aşama 3, A: B: A: (7, hac / hac 3) B: 2 dakika boyunca lineer gradyanı (9: 1, v / v) (19 dakika toplam içeren) karıştırılır. Not: Degradeler ve İzokratik adımlar çözünürlüğünü optimize etmek için ana malzemenin fiziksel özelliklerine göre ayarlanması gerekebilir. </li><li> B (4: 1, v / v) bir doğrusal gradyan (3 dakika) ve a: A: (9, h / h 1) B: A, yukarıda doğrusal gradyan adımları B (4: 1, v / h) en az 2 dakika izokratik aşama () aşağıdaki özü 12 enjekte etmeden önce RP sütunu yeniden dengelemek için. </li></ol></li><li> Algılama ve Akış sintigrafisinde ile radyoaktif işaretli bileşikler görselleştirmekllation Analyzer. Her bir numunedeki toplam radyoaktivite yüzdesi olarak, her bir numune içinde Kalan üst herbisit miktarını kaydedin (algılanabilir ve üreticinin talimatlarına uygun olarak akış Sintilasyon Analiz cihazı ile ölçülmüştür) bir zaman boyunca, her waterhemp popülasyonda herbisit metabolizmasının oranlarını belirlemek için. </li></ol> 4. Statistik prosedürler <ol><li> Bir tesadüf tasarım (ya da istatistiksel analizler için başka uygun bir düzenleme) tedavileri düzenleyin. </li><li> Her bir deney için üç biyolojik çoğaltır oluşan her tedavi, iki bağımsız deneyler yapın. İki bağımsız deney toplam altı biyolojik çoğaltır içerir. Deney etkisi (α = 0.05) anlamlı olmayan ise, her bir bağımsız deneyde verileri birleştirmek ve analiz. Deney etkisi önemli ise, o zaman ayrı ayrı deney analiz. Not: İlk üç biyolojik çoğaltır dahil in 1 Deney ve Deney 2&#39;de önümüzdeki üç biyolojik çoğaltır Her biyolojik çoğaltmak (MCR 1-6, ACR 1-6 ve 1-6 WCS) Her nüfus türetilen klonal çizgi böylece ayrı bir &quot;üst&quot; temsil her zaman- Tabii analizi genetik özdeş bitkiler kullanır. Iki bağımsız deney her waterhemp nüfus için bir medyan DT 50 genetik değişkenliği ve kararlılık, yeterli temsili sağlayan toplam altı biyolojik çoğaltır içerir. </li><li> Doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile verileri analiz ve DT 50 s tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğri ile uyum. Aşağıdaki denklem modeli anlatılmaktadır: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> nerede bu model y t zamanında kalan ebeveyn herbisit yüzdesini temsil, μ i her DT 50waterhemp nüfusu i ve parametre C 0 t = 0 12 de ana herbisit mevcut tahmini tutardır. </li></ol>

<ol><li>Yu, Q., Powles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism-based+herbicide+resistance+and+cross-resistance+in+crop+weeds%3A+A+threat+to+herbicide+sustainability+and+global+crop+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production.</a> Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).</li>
<li>Powles, S. B., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+in+action%3A+plants+resistant+to+herbicides%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution in action: plants resistant to herbicides.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).</li>
<li>Heap, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+perspective+of+herbicide-resistant+weeds%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Global perspective of herbicide-resistant weeds.</a> Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).</li>
<li>Délye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-target-site-based+resistance+should+be+the+centre+of+attention+for+herbicide+resistance+research%3A+Alopecurus+myosuroides+as+an+illustration%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration.</a> Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).</li>
<li>Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+enzymes+for+a+new+job.+Herbicide+detoxification+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants.</a> Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).</li>
<li>Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detoxification+without+intoxication%3A+herbicide+safeners+activate+plant+defense+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression.</a> Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).</li>
<li>Siminszky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cytochrome+P450-mediated+herbicide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism.</a> Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).</li>
<li>Fonné-Pfister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylation+of+primisulfuron+by+an+inducible+cytochrome+P450-dependent+monooxygenase+system+from+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).</li>
<li>Steckel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dioecious+Amaranthus+spp.%3A+here+to+stay%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">The dioecious Amaranthus spp.: here to stay.</a> Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).</li>
<li>Horak, M. J., Loughin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+analysis+of+four+Amaranthus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Growth analysis of four Amaranthus species.</a> Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).</li>
<li>Hausman, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+HPPD-inhibiting+herbicides+in+a+population+of+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29+from+Illinois%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States.</a> Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+detoxi%EF%AC%81cation+mechanisms+confer+resistance+to+mesotrione+and+atrazine+in+a+population+of+waterhemp%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinct detoxiﬁcation mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp.</a> Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-target-site+resistance+to+ALS+inhibitors+in+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus).</a> Weed Science. in press, (2015).</li>
<li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29+biotype+with+multiple+resistance+across+three+herbicide+sites+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action.</a> Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).</li>
<li>Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbicide-insecticide+interaction+in+maize%3A+malathion+inhibits+cytochrome+P450-dependent+primisulfuron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).</li>
<li>Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorreia%2C+MA+%22Cytochrome+P450%3A+Structure%2C+Mechanism%2C+and+Biochemistry%22">Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry</a>. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).</li>
<li>Hawkes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesotrione%3A+mechanism+of+herbicidal+activity+and+selectivity+in+corn%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Brighton+Crop+Protection+Conference+%E2%80%93+Weeds%22%5BJournal%5D)">Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn.</a> Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).</li>
<li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+herbicide+responses+among+Illinois+waterhemp+%28Amaranthus+rudis+and+A.+tuberculatus%29+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations.</a> Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).</li>
<li>Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+resistance+across+glufosinate%2C+glyphosate%2C+paraquat+and+ACCase-inhibiting+herbicides+in+an+Eleusine+indica+population%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population.</a> Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).</li>
<li>Iwakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+CYP81A12+and+CYP81A21+are+associated+with+resistance+to+two+acetolactate+synthase+inhibitors+in+Echinochloa+phyllopogon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon.</a> Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada tarif edilen kesilmiş yaprak yöntemi, mısır yaprak 15 içinde primisülfüron metabolizma araştırma, daha önce kullanılmış olan, ancak sonuçlar, bu protokol, aynı zamanda, bir dikot zararlı bitki türleri 12 herbisid metabolizmasını ölçmek için, etkili, uygun ve tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Bütün bitki çalışmalarla karşılaştırıldığında kesilmiş yaprak tekniğin önemli bir avantajı, bir kesilmiş yaprak bütün bitki translokasyon toprak yüzeyine çıkma sonrası kalıpları, sistemik herbisit...

Otların herbisit direnci gıda ve lif 1,2 küresel üretim ciddi bir tehdit sunuyor. Şu anda yüzden fazla ot türünden dayanıklı nüfus ve biyotipten dünya çapında binlerce belgelenmiş ve 3 çalışılmıştır. Bitkilerde herbisit dayanıklılığı veren önemli bir mekanizma, herbisite protein bağlama kinetikleri veya hedef site gen 2 amplifikasyonu etkileyen genetik mutasyonlar da dahil olmak üzere herbisit hedef sitesi genler ve proteinler, değişikliktir. Sitokrom P450 monooksigenazı (P450) ya da glutation S -Transferase (GST) enzimlerin yüksek aktiviteleri ile metabolik detoksifikasyon hedef alan bazlı mekanizmalar 2 çeşitli şekillerde farklı olan bir yabani ot herbisid direnci kazandıran bir mekanizmadır. Metabolik tabanlı direnç (spor cezaları aka) bitki spor maliyetleri herbisit dayanıklılığı mekaniği kaynaklanabilecek olup önemli etkileri vardırm, hem de yabani popülasyonları 1,2,4 bölgesindeki çapraz veya birden fazla herbisit direnci vermek için, tek bir detoksifikasyon mekanizması potansiyeli açısından. Genel olarak, bitkilere herbisid metabolizması üç ayrı 5 ayrılabilir. Artan polarite ve kısmi herbisit detoksifikasyon 5,6 giden ya da O-dealkilasyon reaksiyonları - Faz I Bu aromatik halkaların ya da alkil gruplarının P450 aracılı hidroksilasyon, ya da N ile olduğu gibi, herbisit veya değiştiren aktivasyonunu içermektedir. Yeni ben GST&#39;lerin azaltılmış glutatyon konjugasyon için bağlantı siteleri sağlayabilir veya Faz II 5,7 UDP-bağımlı glikosiltransferazların tarafından glikoza Faz fonksiyonel gruplar tanıttı. Örneğin, mısırda primisulfuron-metil baştaki metaboliti hidroksi-primisulfuron-glukosite (Phase II) ve daha sonra metabolize uzun süreli depolama ya da daha fazla metabolik için vaküole nakledilebilir hidroksi-primisulfuron-metil 8, olduğu profesyonelcessing 5,6 (Phase III). Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) Birleşik Devletler mısır üretimini (Zea mays), soya fasulyesi (Glycine max) ve pamuk (Gossypium hirsutum) engelleyen bir zor kontrol, dikot yıllık yabancı ot türüdür. Waterhemp genetik çeşitliliğin yüksek derecede onun ikievcikli biyolojisi ve uzun mesafe rüzgar tozlaşma ile kolaylaştırılır ve bir tek kadın waterhemp bitki milyon tohumlar 9 kadar üretebilir. Bu tohumlar doğal olarak etkili bir dağılma mekanizmasına sahip waterhemp bağışlamak, hangi küçük ve kolayca yayılırlar. Waterhemp büyüyen sezon 9 boyunca sürekli çimlenme görüntüler ve tohumları uyuşukluk birkaç yıl sonra filizlenmeye edebiliyoruz. Waterhemp ekilebilir kırpma sistemlerinde 10 en geniş yapraklı yabancı otların daha yüksek büyüme oranını sahip bir C 4 bitkidir. Ayrıca, çok sayıda waterhemp popülasyonları birden fam dayanıklıdırherbisit 3 ilies. Illinois waterhemp (MCR adlandırılır) popülasyonu 4-hidroksi-fenilpiruvat dioksigenaz (HPPD) bu tür mezotrion olarak inhibe edici herbisitler 11, hem de atrazin ve asetolaktat sintazı (ALS) için, herbisit inhibe edici primisulfuron-metil içeren dayanıklı , hedef dışı site bazlı mekanizmalar 12,13 nedeniyle. Ve atrazin dirençli ancak mezotrion duyarlı ve primisülfüron-metil duyarlıdır DTH 14 olarak adlandırılan bir waterhemp popülasyon (nedeniyle ALS geninin mutasyona) primisülfüron-metil-dirençli ACR 14 belirlenen waterhemp farklı bir popülasyon, mezotrion ve atrazin, bizim daha önceki araştırmalar 12 ve mevcut deneylerde MCR ile karşılaştırıldığında kullanıldı (Tablo 1 &#39;de özetlenmiştir). İlk çalışmalar MCR içinde, HPPD gen dizisi veya ifade düzeylerinde değişikliklere, veya azaltılmış mezotrion alımını tespit etmediNüfus zaman mezotrion duyarlı nüfus 12 ile karşılaştırıldığında. Ancak, bütün bitkilerle metabolizma çalışmaları 11,12 mezotrion önceki fenotipik yanıtları ile ilişkili ACR ve WCS ile karşılaştırıldığında MCR ebeveyn mezotrion herbisit anlamlı derecede düşük düzeylerde gösterdi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp Nüfus </td><td> Kısaltma </td><td> Mezotrion için Fenotip </td><td> Mezotrion Direnç Mekanizması </td><td> Primisülfüron için Fenotip </td><td> Primisülfüron Direnç Mekanizması </td></tr><tr><td> McLean İlçe Dayanıklı </td><td> MCR </td><td> Dayanıklı </td><td> Metabolizma * </td><td> Dayanıklı </td><td> Metabolizma </td></tr><tr><td> Adams County Dayanıklı </td><td> ACR </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Dayanıklı </td><td> ALS 14 Hedef site mutasyonu </td></tr><tr><td> Wayne County Duyarlı </td><td> WCS </td><td> Duyarlı </td><td> - </td><td> Duyarlı </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Geliştirilmiş metabolizma dışında hedef olmayan site direnç mekanizmaları, aynı zamanda MCR nüfus 12 mezotrion direnci kazandırabilmektedir. Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Illinois&#39;den waterhemp popülasyonlarının tanımlanması. Sağlam waterhemp fide herbisid metabolizması hızlarının belirlenmesine ek olarak, farklı deneysel yaklaşım geliştirilmiştir ve kesilmiş waterhemp yaprak tahlil 12 yanı sıra çeşitli P450 inhibitörlerinin (ör tetcyclacis malathion) kullanarak, metabolizmayı incelemek için önceki çalışmada kullanılan. Bu yöntem, bir önceki yaklaşımlardan waterhemp için özel olarak uyarlanmıştıreksize yaprak tahlili henüz bir dikot bitkide herbisit metabolizması araştırma için rapor edilmemiştir beri eksize mısırda primisulfuron-metil metabolizması lı soruşturma, 15 bırakır. Organophophosate insektisit malation sıklıkla in vivo kullanılmıştır ve in vitro herbisite metabolizması araştırma P450 tutulumu 16 gösterir. Örneğin, tolerans ve mısırdaki mezotrion ve hızlı metabolizma malation mezotrion 17 mısır duyarlılığı arttıkça doğrulanmıştır P450 katalizlenen halka hidroksilasyon, kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, malation kesilmiş mısır ALS inhibitörü primisulfuron-metil 15 yaprak metabolizmasını inhibe etti. Bitkilerde sistemik olarak, topraktan çıkma herbisidlerin metabolizmasını değerlendirirken eksize yaprak tekniğin önemli bir avantajı, üretilen veriler bütün bitki translokasyon desen bağımsız olmasıdır, önemli bir faktör dikkate. Sonuç olarak, bu yöntem, niceliksel izin verir veNitel metabolik tedavi edilen tek bir yaprak 12 odaklanmak analizleri. Bir bitkisel klonlama stratejisi, eksize yaprak protokolü ile kombinasyon halinde, daha önce metabolizma çalışmaları 12 yapmak için waterhemp da kullanılmıştır. Nedeniyle waterhemp (ayrı erkek ve dişi bitkiler) ve ikievcikli amaranthus türlerinin 9 içindeki genetik çeşitliliğin büyük derecesi outcross doğası gereği, bu protokol genetik özdeş waterhemp fidanları zaman ders deneyler içinde analiz edildi sağlanmalıdır. Bu makalede, bir dikot ot (waterhemp) herbisid metabolizmasının oranlarını ölçmek için kesilmiş yaprak yöntemin kullanımını göstermektedir. Ana yabani ot öldürücü miktarı, (absorbe herbisitin% 50 indirgeme için zaman tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğrisi ile uygun olan doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile her bir zaman noktasında (Şekil 1) belirlendi ve geri kalan DT 50). Temsilciters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile ilgili kromatogramlar karşı ALS ve zaman-akışı çalışma sırasında ana yabani ot öldürücü ve kutupsal metabolit (ler) eşlik eden oluşumuyla kaybolması göstermektedir -duyarlı waterhemp popülasyonları (Şekil için gösterildi 2). Bizim derlemenin konusu düzgün olarak bir halka etiketli (URL- 14 ° C) herbisit kullanarak, tarif ve dikot bitkilerdeki herbisid metabolizmasının yeniden üretilebilir ve kesin hızını belirlemek için bitkisel klonlama yöntemi ile kombinasyon halinde kesilmiş yaprak testinin kullanılmasını göstermek için bunların bütün bitki yanıtlarında farklı üç waterhemp popülasyonları HPPD- ve ALS engelleyici herbisitler (Tablo 1).

<table><tbody><tr><td>Tohumların ön çimlenmesi için</td> <td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td></tr><tr><td>Saksı ortamı</td> Bitki <td>büyümesi için</td><td>Sun Gro Bahçecilik</td><td>49040233</td></tr><tr><td>Nutricote</td><td>Agrivert&nbsp;</td><td>TOPLAM KARIŞIM 13-13-13 T100</td><td>yavaş salınan gübre</td></tr><tr><td>Büyüme odası E15</td><td>Kontrollü Ortamlar Limited</td><td>20207</td><td>bitki kültürü</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>eksize edilmiş yapraklar için tampon</td></tr><tr><td>HCl (konsantre)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A144500</td> tampon Murashige ve Skoog (MS) tuzlarının <td>pH'ını ayarlar</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>eksize edilmiş yaprakların inkübasyonu</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>inkübasyon sonrası yaprak yıkama</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td>bitki ekstraksiyonları</td></tr><tr><td>Asetonitril (HPLC sınıfı)</td> <td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>MKH07610</td><td>HPLC mobil faz</td></tr><tr><td>Formik asit&nbsp;</td><td>Mallinckrodt Analitik</td><td>MK259205</td><td>asitleştirici mobil faz pH</td></tr><tr><td>Mikro santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>1.5 veya 2.0 ml tüpler</td></tr><tr><td>Santrifüj (sıcaklık kontrollü)</td> <td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>15 veya 50 ml tüpler</td></tr><tr><td>Polipropilen santrifüj tüpü</td><td>Corning Inc.</td><td>430790</td><td>15 ml, steril</td></tr><tr><td>Döner buharlaştırıcı</td><td>B&Uuml; CHI</td><td>R200</td><td>konsantre bitki örnekleri</td></tr><tr><td>Sıvı sintilasyon spektrometrisi (LSS)</td><td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>14C miktarını belirler</td></tr><tr><td>Yüksek performanslı sıvı kromatografisi</td><td>Perkin Elmer</td><td>N2910401</td><td>herbisit metabolitlerini çözer</td></tr><tr><td>Akış sintilasyon analizörü ve nbsp;</td><td></td><td>14C</td><td></td></tr> <tr><td>Hypersil Gold C18 sütununun HPLC</td> analizi için LabLogic System 1103303<td>Termo-Bilimsel</td><td>03-050-522&nbsp;</td><td>Ters faz</td></tr><tr><td>Ultima-Flo M kokteyli</td><td>Akış sintilasyon analizörü için</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td></tr><tr><td>Sintilasyon Kokteyli (ScintiVerse BD)</td>LSS için <td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>; biyolojik olarak parçalanabilen</td></tr><tr><td>Laboratuvar homojenizatörü</td><td>Kinematica</td><td>CH-6010&nbsp;</td><td>Yaprak örneklerini homojenize edin</td></tr></tbody></table>

bir kesilmiş yaprak testi ile dikot weeds herbisit metabolizma düşük Ölçme

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Zorunlu bir dikot otu olan su kenevirinde (Amaranthus tuberculatus) herbisit metabolizması oranlarını izole etmek ve doğru bir şekilde belirlemek için, herbisit alımını normalleştirmek ve herbisite dirençli ( R ) ve duyarlı (S) su keneviri popülasyonlarında katkıda bulunan faktörler olarak translokasyonu ortadan kaldırmak için vejetatif bir klonlama stratejisi ile birleştirilmiş eksize edilmiş bir yaprak tahlili geliştirdik. Bitkilerdeki organik pestisitlerin biyokinetik analizleri tipik olarak alımın, translokasyonun (hedef bölgeye teslim), metabolik kaderin ve hedef bölge ile etkileşimlerin belirlenmesini içerir. Herbisit metabolizması, herbisite dirençli yabani otlarda ve herbisite toleranslı mahsullerde ölçülmesi gereken önemli bir parametredir ve tipik olarak radyoaktif işaretli herbisitler kullanılarak tüm bitki testleri ile gerçekleştirilir. Bununla birlikte, tüm bitki yöntemlerinden türetilen biyokinetik parametrelerin yorumlanmasındaki bir zorluk, translokasyonun genellikle herbisit metabolizması oranlarından etkilenmesidir, çünkü polar metabolitler genellikle herbisit detoksifikasyon reaksiyonlarını takiben bitki içinde hareketli değildir. Bu yazıda açıklanan protokolün avantajları arasında R ve S popülasyonlarında herbisit bozunma oranlarının tekrarlanabilir, doğru ve hızlı bir şekilde belirlenmesi, tüketilen radyoaktif işaretli herbisit miktarında önemli bir azalma, daha fazla işleme ve bertaraf gerektiren radyoaktif işaretli bitki materyallerinde büyük bir azalma ve sera yerine laboratuvarda veya büyüme odasında radyoaktif işaretli herbisit deneyleri gerçekleştirme yeteneği yer alır. Herbisit direnci dünya çapında dikot yabani ot popülasyonlarında gelişmeye ve yayılmaya devam ettikçe, burada geliştirilen ve açıklanan eksize edilmiş yaprak tahlili yöntemi, artan herbisit metabolizması ve detoksifikasyon oranları nedeniyle hedef olmayan bölge bazlı direnci araştırmak için paha biçilmez bir teknik sağlayacaktır.

Mezotrion metabolizma oranlarında büyük farklılıklar WCS veya ACR ve MCR (Şekil 1) ya arasında tespit edildi. Her zaman noktasında, MCR daha hızlı bir şekilde daha önceki bütün bitki fenotipik yanıtların 11 ile ilişkilidir, iki mezotrion-hassas grupların, WC&#39;ler ve ACR, daha mezotrion metabolize olan. Her nüfus tek bir ebeveyn bitkiden yeterince bitkiler klonlama yoluyla, herbisit metabolizması zaman ders analizleri nedeniyle her zaman ders 12 içindeki genetik değişkenlik eksik...

Bu el yazması, herbisit metabolizma hızlarının, bir dikot otundan eksize edilen yapraklarla nasıl etkili bir şekilde ölçülebileceğini, böylece değişkenliği nasıl azaltabileceğini ve tipik olarak tüm bitki tahlillerinde gözlemlenen herbisit alımının veya translokasyonunun olası kafa karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırabileceğini açıklamaktadır.

Bir kesilmiş yaprak Testi ile Dikot Weeds Herbisit Metabolizma düşük Ölçme

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Bu prosedürün genel amacı, eksize yaprak deneyi kullanarak bir dichot yabancı otunda herbisit metabolizmasını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle sera ve büyüme odasında su hemp popülasyonlarının dikilmesi ve klonlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise eksize edilmiş su hemp yapraklarının radyoetiketli herbisit ile inkübe edilmesi ve bir zaman seyri çalışmasının yürütülmesidir.Ardından, herbisit ve metabolitleri inkübe edilen yapraklardan ekstrakte edilir. Son adım, herbisit ve metabolitlerinin ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile analiz edilmesidir. Nihayetinde, bu eksize yaprak deneyi, farklı yabancı ot popülasyonlarında veya türlerinde herbisit metabolizmasının doğru oranlarını belirlemek için kullanılır.Bu tekniğin veya yapraklara ya da tüm bitkiye radyoaktif olarak işaretlenmiş herbisit damlatma gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı, genetik olarak özdeş veya benzer fidelerin bağımsız olarak veya tüm bitki translokasyonu şeklinde analiz edilebilmesidir. Bu yöntem, yabancı otlarda herbisit direnç mekanizmalarının veya kültür bitkilerinde herbisit tolerans mekanizmalarının belirlenmesi gibi bitki biyokimyası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı ola

measuring-rates-herbicide-metabolism-dicot-weeds-with-an-excised-leaf

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Biz yaprak hidrolik iletkenlik eş zamanlı ölçümü için (nispeten hızlı (30 dakika) ve gerçekçi bir yöntem...

Evaporatif Akı Yöntemi (EFM) kullanarak Işınım ve Dehidrasyon için Yaprak Hidrolik İletkenlik ve Stoma İletkenlik ve Yanıtları Ölçümü

Bu videoda, küçük moleküllü nematisitlerin nematodlara karşı etkinliğini belirlemek için bir tarama testi gösteriyoruz. Nematisitler, maruziyetten sonra numunedeki mobil nematod sayısında bir azalmaya neden olurlarsa etkili kabul edilirler.

Küçük Moleküllü Nematisit Tarama Deneyi: Potansiyel Nematisitleri Ditylenchus dipsaci'ye Karşı Taramak İçin Orta Verimli Bir Yöntem

Yabancı ot popülasyonlarında herbisit direncini doğrulamak için sağlam ve esnek bir yaklaşım sunulmuştur. Bu protokol, herbisit direnç seviyelerinin çıkarılmasına ve küçük adaptasyonlarla çok çeşitli yabani ot türlerine ve herbisitlere uygulanmasına izin verir.

Farklı Ot Türlerinin Sağlam Herbisit Direnci Testi için Protokoller

Patojen büyümesinin niceliksel olarak belirlenmesi, çeşitli Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis olarak anılacaktır) bağışıklık tepkilerini karakterize etmek için güçlü bir araçtır. Burada açıklanan yöntem, Pseudomonas syringae pv'yi ölçmek için optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi sunar. maculicola ES4326 yetişkin Arabidopsis yapraklarında büyüme.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Yaprak sprey kütle spektrometresi numune hazırlama en aza indirir ve küçük moleküller bitki doku üzerinden hızlı tespiti için izin kromatografi, ortadan kaldırır bir doğrudan kimyasal analiz tekniğidir.

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Sunulan yöntem, Manduca Sexta larvası uygulama aracılığıyla doğal otobur hasarlı bitki dokusu oluşturur patates ayrılmış yaprakları. Bitki dokusu böcek herbivory erken tepkiler dahil altı transkripsiyon faktör homolog ifadesi için farklı teknik kullanılarak.

Müstakil yaprak özendirme, Çiğneme böcek Manduca Sexta tarafından Infestation sırasında patates gen Ifade çalışmaları basitleştirmek için

Bu çalışma, bir hücre süspansiyon kültürü çay (Camellia sinensis L.) bu böcek ilaçları gibi tüm bitki tarafından alınabilir dış bileşiklerin metabolizmasını incelemek için kullanılabilir yaprakları türetilen kurulması için bir protokol sunuyor.

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

Mevcut protokol, bitkilerde 2,4-dibromofenol metabolitlerinin tanımlanması için basit ve etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Bitkilerde 2,4-Dibromofenol Metabolizmasının Aydınlatılması

Protokol, bitkilerde triazol pestisitlerinin metabolitlerinin integral sitotoksisitesini değerlendirmek için yeni bir yöntemi açıklamaktadır.

Bitkilerde Tipik Triazol Pestisitlerin Metabolitlerinin Sitotoksisitesinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, aynı örnekte bitki iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal İkincil Metabolitlere Yaprak Yanıtlarının Yüksek Verimlilikli Bir Formatla Değerlendirilmesi

Öğrenin dikot yabani otlarda herbisit metabolizmasını kesilmiş yaprak testiyle hassas şekilde ölçme yöntemini. Bu teknik, varyasyonu azaltarak farklı popülasyonlarda metabolizma hızlarını güvenilir biçimde belirlemenizi sağlar.

Bir kesilmiş yaprak Testi ile Dikot Weeds Herbisit Metabolizma düşük Ölçme

Daha fazla video keşfet