Bir kesilmiş yaprak Testi ile Dikot Weeds Herbisit Metabolizma düşük Ölçme

Bu prosedürün genel amacı, eksize edilmiş bir yaprak tahlili kullanarak bir dichot yabani ottaki herbisit metabolizmasını ölçmektir. Bu, ilk olarak serada ve büyüme odasında su kenevir popülasyonlarının ekilmesi ve klonlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, eksize edilmiş su keneviri yapraklarını radyo etiketli herbisit ile inkübe etmek ve bir zaman kursu çalışması yapmaktır.

Daha sonra, herbisit ve metabolitleri inkübe edilmiş yapraklardan ekstrakte edilir. Son adım, herbisit ve metabolitlerinin ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile analizidir. Sonuç olarak, bu eksize edilmiş yaprak tahlili, farklı yabani ot popülasyonlarında veya türlerinde doğru herbisit metabolizması oranlarını belirlemek için kullanılır.

Bu tekniğin veya lekelenme radyosu, yaprak veya bütün bitki üzerinde etiketli herbisit gibi mevcut yöntemin temel avantajı, genetik olarak özdeş veya zararlı fidelerin bağımsız veya bütün bitki translokasyonunda analiz edilmesidir. Bu yöntem, yabani otlarda herbisit direnç mekanizmalarının veya mahsullerde herbisit tolerans mekanizmalarının belirlenmesi gibi bitki biyokimyası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. HPRC prosedürünün gösterilmesi değerlendirilecektir.

Laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan iskelet Hazırlık aşamasında, su kenevir tohumlarını sulu bir burgu ortamında toplayın ve askıya alın. Daha sonra tohumları, uyku halini kırmak ve böylece çimlenmelerini iyileştirmek için en az 30 gün boyunca dört santigrat derecede ortamda saklayın. Tohumlar hazır olduğunda, 16 sekiz fotoğraf periyodu, 28 santigrat derece gündüz sıcaklığı ve 22 santigrat derece gece sıcaklığı bitkisi ile serada çimlendirin.

12 x 12 santimetrelik tepsilerdeki tohumlar, saniyede metrekare başına 500 mikromollük bir foton akışı için cıva müttefik bir lambadan ek ışık sağlar. Kanopi düzeyinde, deneysel değişkenliği etkisiz hale getirmek için her popülasyondan altı fide klonlamaya hazırlanın. Fideler iki santimetre boyunda olduğunda, onları 80 CC saksıya nakledin.

Fideler dört santimetre boyunda olduğunda, üçe bire bire bir saksı karışımı hazırlayın. Toprağı, turbayı ve kumu karıştırın. Karışımı 950 cc'lik kaplara yükleyin ve her bir tencereye beş gram yavaş salınan gübre granülü ekleyin.

Daha sonra fideleri saksı başına bir fide olacak şekilde nakledin. Bitkiler yedi santimetre boyunda olduğunda, oluğu kesin ve çıkarın. Apikal baskınlığı ortadan kaldırmak ve klonlama amaçları için yeterli aksiller sürgünleri garanti etmek için en genç üç yaprağı içeren apikal Maris gövdesi.

Daha sonra, bitkiler 14 santimetreye ulaştığında, çalışmadaki her su keneviri popülasyonundan beş adet üç santimetre uzunluğunda aksiller sürgün çıkarın. Su kaybını en aza indirmek için, yaprakların çoğunu hasat edilen oluklardan çıkarın, ekimden sonra daha fazla büyümeye izin vermek için en genç iki yaprağı koruyun Daha sonra, her bir oluğu saksı ortamına sahip bir AD CCC saksısına nakledin, çimlenme için kullanılan aynı ortam, saksı ortamının büyüme odasında kökler oluşana kadar tamamen doymuş olduğundan emin olun. Üçüncüsü, bitkiler bu noktada çok hassastır ve strese sokulmamalıdır, bu nedenle saksı ortamı kökler oluşana kadar suya tamamen doyurulmalıdır.

Bitkileri, oradaki sera gibi çevresel ayarlara sahip bir büyüme odasına nazikçe aktarın. Toprağı yedi gün nemli tutun, böylece kökler yerleşir. Saniyede metrekare başına 550 mikro MO foton için bir ışık karışımı kullanın.

Kökler oluştuktan sonra ve bitkiler dört santimetre boyunda olduğunda, onları seraya aktarın. Daha sonra fideleri üçe bire bir karışım ve daha önce olduğu gibi hazırlanan yavaş salınan gübre granülleri ile 950 CC saksılara nakledin. Ardından, popülasyonları genişletmek için klonlama döngüsünü bir kez tekrarlayın.

Bu deney için, tüketime başlamak için 10 ila 12 santimetre boyunda klonlanmış su kenevir bitkileri kullanın. Üçüncü en genç yapraklar, iki ila üç santimetre uzunluğundadır. Ekli peolün yarım santimetresini ekleyin.

Daha sonra, su altında, her bir su kenevir bitkisinden yaprak saplarını ikinci kez kesin ve yaklaşık 0.3 santimetre peol bırakın. Şimdi kesilmiş yaprakları büyüme odasında bir saat boyunca ön inkübasyon tamponuna daldırın. İstenirse, bu noktada yapraklara metabolik bir inhibitör uygulayın.

Bir saat sonra, her bir yaprağı, radyo etiketli herbisit ile 200 mikrolitre inkübasyon tamponu içeren 1,5 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın. Yaprakları 28 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın, böylece tedaviyi tamamlamak için herbisiti emerler. Yaprakları deiyonize su ile yıkayın ve çeyrek mukavemetli MS içeren 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Tuz çözeltisi.

Tüpleri büyüme odasında tutun. Yaprakları, metabolizma hızlarını belirlemek için yeterli olan birkaç farklı süre boyunca kuluçkaya yatırın. Sonra. Her yaprak dokusunu 15 mililitre polipropilen tüpler ve cam tokmaklar kullanarak sıvı nitrojen içinde öğütün.

Daha sonra radyo etiketli herbisiti ve metabolitlerini her yapraktan çıkarın. Tüpe yedi mililitre% 90 aseton ekleyin ve bir doku kullanarak bir süspansiyon yapın. Homojenizatör, dokuyu tamamen toz haline gelene kadar homojenize eder.

Genellikle bu birkaç dakika sürer. Sonra dokuyu durulayın. Yedi mililitre aseton ile homojenizatör.

Daha fazla ekstraksiyon için homojenatı eksi dört santigrat derecede 16 saat saklayın. Ertesi gün, tüpleri 5.000 GS'de 10 dakika döndürün ve süpernatanları toplayın. Daha sonra süpernatantları, yarım mililitre çözelti kalana kadar 40 santigrat derecede bir rotovap kullanarak konsantre edin.

Bu hacmi 2.0 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın. Bire bir sedir nitril su çözeltisi ile hacmi 1.25 mililitreye yükseltin ve partikülleri çıkarmak için bunu 10.000 GS'de 10 dakika döndürün. Ardından, RP HPLC kullanarak toplam çıkarılabilir radyoaktiviteyi çözün.

Polar olmayan herbisitlerin çoğu için, dakikada bir mililitre akış hızında bir C 18 sütunu kullanın. LUNA için% 0.1 formik asit kullanın, LUNB için% 0.1 formik asit, HPLC sınıfı asetonitril kullanın. Bununla ilgili daha fazla ayrıntı ve istatistiksel bir analiz yöntemi için, açıklanan protokolü kullanan metin protokolüne bakın.

Üç su keneviri popülasyonu arasında mezo trion metabolizması oranlarında büyük farklılıklar tespit edildi. Örneğin, mezotrion metabolizması ve MCR, kısa DT 50 değeri ile gösterildiği gibi bir CR veya WCS'den önemli ölçüde daha hızlıydı. Verilerin spesifik bir örneği olarak, klonal beşinci satırdaki mistri metabolizması için zaman seyri burada görülmektedir.

Ayrı bir çalışma, bir LS inhibitörüne, metil üzerindeki primi sulur'a karşı direnç mekanizmasını araştırdı ve yaprakları tedavi etmek için sülfonilüre ailesinin LS inhibe edici bir herbisiti kullanıldı. Tipik olarak, MCR bitkilerinde metil üzerindeki primi sulur miktarı, çalışmadaki diğer popülasyonlardan daha düşüktü. Ek olarak, her üç popülasyondan eksize edilen yaprak ekstraktlarında metil üzerindeki primi sulurdan daha kısa tutma sürelerine sahip iki polar metabolit tespit edildi.

Formları, primi sulurun metil üzerindeki halka hidroksilasyonu ve ardından glikoz konjugasyonu ile tutarlıdır. Daha sonra, her bir zaman noktasında kalan ana herbisit miktarı ölçüldü ve primi kükürt için DT 50 değerlerini belirlemek için kullanıldı. MCR tesislerinde beklendiği gibi metil daha kısa değerler bulundu.

İlginç bir şekilde, diğer bitkilerdeki DT 50 değerleri de benzerdi. Her biri primi sülfür metile farklı bir yanıt göstermesine rağmen bu prosedürü takip edin. Bitkilerde herbisit detoksifikasyonunda yer alan genlerin tanımlanması ve ekspresyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için RNA dizilimi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, bitki fizyolojisi alanındaki araştırmacıların doğru nefes veya bitkisel metabolizmayı belirlemelerinin önünü açacaktır.