Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel biyofilm bozulmasında çekirdek söndürücü enzimlerin etkinliğini göstermektir. Bu yöntem, anti-bakteriyel terapötikler alanındaki temel soruları yanıtlamaya ve çekirdek söndürücü laktonazların bir biyofilm ortamındaki patojenik bakteriler üzerindeki etkisini anlamaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin ana avantajı, çekirdek söndürücü laktonazların in vitro bir ortamda doğrudan eklenebilmesidir.

Böylece, biyofilm bozulması üzerindeki etkisi kolayca ölçülebilir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımızda bir teknisyen olan Terrence Tay'dır. Başlamak için, 16 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde 30 santigrat derecede LB'de 5 mililitrelik bir A.baumannii S1 kültürü büyütün.

Kültürü 0,8'lik bir OD 600'e ayarlayın. Daha sonra, kültürü bir ila 100 arasında seyreltmek için mililitre saflaştırılmış GKL enzimi başına 4 miligram içeren taze LB kullanın. Ve 96 oyuklu bir plakanın kuyularına 100 mikrolitre ekleyin.

Plakaları kapatmak için kapakları kullanın ve 10 litrelik plastik bir kaba koyun. Kabı kapatın ve ortamı nazikçe çıkarmadan önce üç saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Kuyucuklara 100 mikrolitre daha taze LB ortamı ekleyin ve plakayı 21 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Ortamı nazikçe çıkardıktan sonra, planktonik bakteri hücrelerini nazikçe yıkamak için 200 mikrolitre steril su kullanın. Pipet ucunu kuyunun dibine yerleştirin ve hava ile sıvı arayüzü arasındaki biyofilm yabancısı üzerinde minimum bozulma olmasını sağlamak için sıvı ortamı dikkatlice çıkarın. Daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre% 1 kristal viyole çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Kuyuları üç kez yıkamak için 200 mikrolitre steril su kullanarak kristal viyole çözeltisini çıkarın. Her oyuğa 100 mikrolitre% 33 asetik asit ekleyin ve boyayı çözmek için 15 dakika hafifçe çalkalayarak inkübe edin. 600 nanometrede kristal viyole emilimini ölçerek biyofilm miktarını ölçün.

Kristal viyole miktarı, oluşan biyofilm miktarı ile orantılıdır. A.baumannii S1 biyofilmlerinin konfokal lazer tarama mikroskobunu veya CLSM'yi gerçekleştirmek için, 16 saat boyunca çalkalama inkübatöründe 30 santigrat derecede LB'de beş mililitrelik bir A.baumannii S1 kültürü büyütün. A.baumannii S1'in kültürünü 0,8'lik bir OD 600'e ayarlayın.

Daha sonra, kültürü bir ila 100 arasında seyreltmek için saflaştırılmış GKL enziminin milileter başına 1.2 miligram içeren taze LB kullanın ve 35 mililitrelik cam tabanlı bir mikro tabağa bir mililitre ekleyin. Mikroçanağı bir kapakla örtün ve 10 litrelik plastik bir kaba koyun ve tabağı üç saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe etmeden önce kapatın. Ortamı nazikçe çıkardıktan sonra, 30 mikrolitre saflaştırılmış GKL enzimi içeren bir mililitre taze ortam ekleyin ve ardından 30 santigrat derecede 21 saat daha inkübe edin.

Ortamı ikinci kez yavaşça çıkarın ve taze ortamda başka bir mililitre GKL enzimi ile değiştirin. 24 saat boyunca 30 santigrat derece inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı nazikçe çıkarın ve HBSS'de çözünmüş Alexa Fluor 488 konjuge buğday tohumu aglütininin mililitresi başına 500 mikrolitre beş mikrogram ekleyin.

Biyofilmleri lekelemek için mikroçanağı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Biyofilmleri sabitlemek için, HBSS'de çözünmüş 500 mikrolitre% 3.7 formaldehit ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Mikroçanağı bir kez yıkamak için iki mililitre HBSS kullanın, ardından çözeltiyi tamamen çıkarın.

CLSM görüntülemeden önce çanağı karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. CLSM görüntüleme ve analizi için, yığın başına 0,21 mikronluk bir aralıkla görüntü başına 97 yığın oluşturmak için 63X hedefi kullanın. Kristal viyole kantitasyon deneyinde, A.baumanii tarafından kullanılan ana çekirdek molekülü olan üç hidroksidekanoil l homoserin lakton veya 3OHC10HSL'ye karşı laktonaz aktivitesi için Wild tipi GKL ve geliştirilmiş bir GKL çift mutant çekirdek söndürme enzimi kullanıldı S1.As burada gösterildiği gibi, her iki enzim de önceden işlenmiş Vahşi tip A.baumanii S1'de biyofilm oluşumunu önemli ölçüde azaltabildi. Her iki enzim tarafından biyofilmlerin bozulma derecesi, 3OHC10HSL'ye karşı etkinlikleri ile orantılı değildir.

Bu tabloda görüldüğü gibi, mutant GKL'nin devir hızı, 3OHC10HSL'ye karşı Vahşi tip GKL'den altı kat daha hızlıdır. Bununla birlikte, enzimler arasındaki biyofilm bozulma derecesindeki fark sadece iki yönlüdür. Bu deneyde, karşılaştırma için geliştirilmiş GKL mutant enzimi ve katekoli inaktif enzimi kullanıldı.

Bu DIC görüntüsü, geliştirilmiş GKL mutant enzimi ile yapılan muamelenin, inaktif enzime kıyasla biyofilm boyutunda bir azalmaya yol açtığını göstermektedir. Floresan görüntülerin analizi, geliştirilmiş GKL mutant enzimi ile muamele edildiğinde yüzey alanında, biyokütlede ve biyofilmlerin ortalama kalınlığında bir azalma olduğunu da ortaya koydu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa kuluçka süresi hariç üç ila dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, yıkama adımları sırasında biyofilmin çıkarılmasını ve bozulmasını en aza indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre sayımı ve enzim stabilite testleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu, çekirdek söndürücü laktonazların biyofilm içindeki hücre popülasyonu üzerindeki etkileri ve etki süreleri gibi ek soruları cevaplayacaktır.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bulaşıcı hastalık tedavisi alanındaki araştırmacıların, patojenik bakteriler tarafından üretilen biyofilmdeki potansiyel çekirdek söndürücü laktonazların etkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, kristal viyole boyama ile biyofilm bozulmasının nasıl ölçüleceği ve konfokal görüntüleme ile biyofilmdeki morfolojik değişikliklerin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenik materyalle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman uygun biyolojik risk sınırlama tesislerinin kullanılması gibi önlemler alınmalıdır.