Name: Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Keşfedin, mühendislikle geliştirilmiş nisabı giderici laktonazlar kullanarak A.baumannii S1 patojen biyofilmlerinin parçalanmasını. Bu yöntem, antibakteriyel terapiler için direnç riskini azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Milli Eğitim Bakanlığı Akademik Araştırma Fonu ve Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi ve Singapur Ulusal Araştırma Vakfı'ndan alınan hibelerle desteklenmiştir.

A. Biyofilm Oluşumunun 1. Kristal Violet Kantifikasyonu baumannii S1 <ol><li> A. 5 ml&#39;lik bir kültür büyütün lizojeni suyu içinde baumannii S1 (LB) 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C&#39;de (tripton 10 g / L, bira mayası özütü 5 g / L). </li><li> A. kültürünü ayarlayın istenen OD 0.8 600 baumannii S1. Bir 96-yuvalı plaka kullanarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 10 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacim 100 ul olduğunu. </li><li> Hem de bir kontrol kültürü hazırlayın; Bu herhangi bir enzim içermez. Çoğaltır istenen sayıda elde etmek için benzer koşullar tekrarlayın. </li><li> Bir kapak ile plaka örtün ve sızdırmaz şekilde kapalı bir 10 litrelik plastik bir kap içine koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C &#39;de plaka inkübe edin. </li><li> Oyuk taze LB ortamı bir 100 ul ilave edin ve 30 ° C&#39;de 21 saat boyunca inkübe plaka. </li&gt; <li> Inkübasyon ikinci döneminden sonra, yavaşça tüm ortamı çıkarın. 200 ul steril su ile planktonik bakteri hücresini yıkayın. Yıkama sırasında hücrelere sadece minimal rahatsızlık olduğundan emin olun. </li><li> Her çukuruna% 1 kristal viyole çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 200 ul steril su ile kuyusunu yıkayarak kristal viyole çözüm çıkarın. Iki kez yıkama tekrarlayın. </li><li> Her çukuruna% 33 asetik asit, 100 ul eklenir ve yavaşça çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilir; Bu boya eriyecektir. </li><li> 600 nm &#39;de kristal viyole absorbansı ölçülerek oluşan biyofilm miktarının belirlenmesi. Kristal viyole miktarı oluşturulmuş, biyofilm miktarı ile orantılıdır. </li></ol> A. 2. konfokal lazer tarama mikroskobu baumannii S1 Biyofilm <ol><li> A. 5 ml&#39;lik bir kültür büyütün 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C&#39;de LB baumannii S1. </li><li> ReklamA. sadece kültür istenen OD 0.8 600 baumannii S1. 35 mm bir cam tabanlı μ-çanağı kullanılarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 30 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacmi 1 ml olmuştur. </li><li> Kapaklı μ-Dish Kapak ve mühürlü 10 litrelik plastik kaba koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C &#39;de μ-Bulaşık inkübe edin. 1 ml &#39;lik bir toplam hacme getiren saflaştırılmıştır GKL enzim ve taze ortam 30 ul ekle. 30 ° C&#39;de bir 21 saat daha inkübe edilir. </li><li> Adımı yineleyin 2.3 ve 30 ° C sıcaklıkta bir 24 saat μ-Dish kuluçkaya yatmaktadır. Sonra, yavaşça ortamı çıkarın. </li><li> Μ-çanağı Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde eritildi 5 ug / ml Alex Fluo 488-konjuge Buğday tohumu aglutinini (WGA) 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin; Bu oluşan biyofilm leke olacaktır. T boyama çözüm çıkarın ve yıkayınO u-Dish HBSS 2 ml. Yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> % 3.7 formaldehit HBSS içinde çözüldü ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe 500 ul ilave et; Bu μ-Dish üzerine biyofilm çözecektir. HBSS 2 ml ile bir kez μ-bulaşık yıkama ve daha sonra tamamen uzaklaştırın. Μ-Bulaşık biyofilm sabit önceden CLSM görüntüleme 4 ° C de karanlıkta tutulmuşlardır edilebilir. </li><li> CLSM görüntüleme ve analiz için yığının başına 0.21 mikron arayla görüntü başına 97 yığınlarının oluşturmak için 63 kat büyütme kullanın. </li></ol>

<ol><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+are+we+in+the+post-antibiotic+era%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li>
<li>Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+future+prospects+of+antivirulence+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biology and future prospects of antivirulence therapies.</a> Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).</li>
<li>LaSarre, B., Federle, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+quorum+sensing+to+confuse+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).</li>
<li>Waters, C. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).</li>
<li>Lazar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+in+biofilms--how+to+destroy+the+bacterial+citadels+or+their+cohesion%2Fpower%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?</a> Anaerobe. 17, 280-285 (2011).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Perez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+challenge+of+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).</li>
<li>Tay, S. B., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+quorum-based+anti-virulence+therapeutics+targeting+Gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens.</a> International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).</li>
<li>Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgarashi%2C+J+%22Quorum+Sensing%22">Quorum Sensing</a>. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).</li>
<li>Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phosphotriesterase-like+lactonase+from+Sulfolobus+solfataricus+and+its+immobilization+for+disruption+of+quorum+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).</li>
<li>Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+quorum+sensing+in+the+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+non-native+N-Acyl+homoserine+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones.</a> ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).</li>
<li>Chow, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+thermostable+quorum-quenching+lactonase+from+the+amidohydrolase+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).</li>
<li>Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+biofilm+formation+by+the+human+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+engineered+quorum-quenching+lactonases%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).</li>
<li>Pour, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Acinetobacter+baumannii+strains+isolated+from+urinary+tract+infection+and+urinary+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+immunology+and+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters.</a> FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Deney iki seti olarak, A. baumannii S1 bakteriler 15 tarafından oluşturulan biyofilm miktarını azaltabilir yüksek tuz konsantrasyonu olarak NaCl&#39;siz LB ortamında kültive edilmiştir. Bu tür eserin varlığı oluşturduğu biyofilm miktarını, hem de farklı tedavi koşulları arasında nisabı-söndürme enzimlerin etkisini hafife olabilir. Katalitik inaktif enzim kullanımı enzim sekestrasyonun olası etkilerini ortadan kaldırmak için bir negatif kontrol olarak önemlidir. Inaktif enzimler, çekirdek mol...

Bulaşıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri, antibiyotik ilaçlar 1 bir geniş bağışıklık çok ilaca dayanıklı bakterilerin hızlı artışın daha karmaşık bir. Dirençli bakteri kaynaklı enfeksiyonlardan yüksek morbidite ve mortalite oranları ile, ilaç geliştirme süreçlerini yükselmek ve / veya tedavi seçenekleri geliştirmek için daha iyi anti-bakteriyel alternatifleri keşfetmek için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, anti-virülans yaklaşımı dolayısıyla direnç mekanizmaları 2 risklerini azaltmaya olmayan bakteri yöntemlerle virülansını önlemede potansiyeli verilen faiz kazanıyor. Nisabı algılamalı bakteriyel virülans ve bu sinyal olgusunun bozulması bir &#39;ana şalteri&#39; patogenezinde 3 karşı vadeden bir anti-virülans yöntemdir olduğunu. Kritik bakteriyel nüfus yoğunluğu ulaşıldıktan sonra virülansına başlangıcı dışı ortamda nisabı moleküllerin birikimini gerektirir. As quoROM molekülleri, komşu reseptörlerine bağlanma hastalık oluşturma faktörlerinin aktivasyonu gibi antibiyotik direnci ve biyofilm 4 ile ilişkili genlerin yol açar, hücre içi matris geri yayılır. Genel, nisap algılama bozulması Birincil metabolik etkilemeden nisabı molekülü ve reseptör etkileşimi inhibe içerir. Bu nedenle, hücre büyümesi üzerinde doğrudan bir ima yoktur. Fitness tehlikeye olmadığından, gelişmeye ve bu tür tedaviler 5 karşı direnç kazanmak için bakteriler için en az seçim baskı var. Buna ek olarak, çekirdek-algılama bozulması, anti-bakteriyel maddeler karşı koruma sağlar ve immün yanıtları ana biyofilm, olduğu gibi, doğal bakteri koruyucu mekanizmaların engelleyebilir. Bu Dünya&#39;da mikropların% 99 th içinde yaşayan mikroorganizmalar için çok önemli hayatta kalma avantajı kazandıran, karmaşık biyofilm gibi matrisler var olduğu tahmin edilmektedirese yapılar 6. Daha da önemlisi, bu sesil etki oluşumu en kalıcı ve kronik hastane kökenli enfeksiyonların 7 nedenidir. Acinetobacter baumannii küresel hastane kökenli enfeksiyonlarla ilişkilidir ve virülans büyük ölçüde yeterli çoğunluk algılama atfedilir Belli başlı insan patojenleri biridir aracılı biyofilm oluşumu 8. Çekirdek giderici enzimler, Gram-negatif bakterilerin 9 tarafından üretilen N -asil homoserin laktonlar (AHL&#39;ler) olarak bilinen bir bileşikler grubu hedef, çekirdek-kaynaklı sinyal transdüksiyonunun bozulması başarıyla kullanılmıştır. Çeşitli çalışmalar da biyofilm 10,11 virülans faktörü ekspresyonu ve hücre sayılarının azaltılması yoluyla bakteriyel hastalık oluşumunun engellemek için bu enzimlerin kullanımına bağlı genişletmiştir. Ne yazık ki, bakteriyel patojenler tarafından biyofilm oluşumuna karşı nisabı-söndürme enzimlerin etkin kullanımı palpabl gösteri eksikliği kalır.Yeniden A. bozmaya, nisap inhibitörleri (AHL analogları), yerine nisabı giderici enzimler kullanmayı girişimleri olmuştur baumannii biyofilm oluşumu 12. Küçük moleküller inhibitörleri kullanılarak bu yöntem, geçerli bir yaklaşım olsa da, translasyon kullanımlarda, bio-mevcudiyetini sürdürülmesi zor olabilir. Enzimler terapötik etkileri için biyomedikal cihazların yüzeylerine immobilizasyon doğru daha uygundurlar Aksine, katalitik çekirdek giderici enzimlerin kullanılması biyolojik sorunu aşmak olabilir. Burada, kristal viyole boyama ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, Geobacillus kaustophilus (GKL) bakteriyel biyofilm oluşumu üzerinde 13&#39;ten mühendislik nisap-söndürme lactonases etkilerinin bir değerlendirmesini açıklar. Bu çalışma klinik olarak anlamlı A. biyofilm bozulması ilk başarılı gösteri nisap giderici enzimler kullanılarak baumannii S1 süzün. Yöntem tarifBu çalışmada, patojenik Gram-negatif bakterilere karşı sonraki terapötik geliştirme çabaları diğer çekirdek giderici enzimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>Tripton&nbsp;</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Menekşe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit Laboratuvar</td><td>Taraması</td><td>PLA00654X</td><td>Dikkat: Yanıcı</td></tr><tr><td>&-Çanak</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluo 488-konjuge WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Çile' S Dengeli Tuz Çözeltisi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Dikkat: Aşındırıcı&nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy HT Mikroplaka Okuyucu</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 Ters Floresan Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

engineered nisabı giderici lactonases kullanarak patojen biyofilmler anti-öldürücü bozulması

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

Çoklu ilaca dirençli bakterilerin hızla ortaya çıkması, yaşamı tehdit eden enfeksiyonlara karşı koymak için yeni terapötik yaklaşımlara olan ihtiyacı hızlandırmıştır. Bakteriyel enfeksiyonun kalıcılığı genellikle çekirdek algılama aracılı biyofilm oluşumu ile ilişkilidir. Bu nedenle, bu sinyalizasyon devresinin bozulması, çekici bir virülans önleme stratejisi sunar. Çekirdek söndürücü laktonazların, çekirdek algılama devrelerinin etkili bozucuları olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu enzimlerin bakteriyel biyofilm oluşumunu bozmada etkili bir şekilde kullanıldığına dair çok az rapor bulunmaktadır. Bu protokol, klinik olarak anlamlı bir A. baumannii S1 suşunda, tasarlanmış bir çekirdek söndürücü laktonaz kullanımı yoluyla biyofilm oluşumunu bozmak için bir yöntemi açıklar. Acinetobacter baumannii, dünya çapında ciddi hastane kaynaklı enfeksiyonlarda rol oynayan önemli bir insan patojenidir ve virülansı ağırlıklı olarak biyofilminin dayanıklılığına atfedilir. Tasarlanmış laktonaz tedavisi, önemli ölçüde A. baumannii S1 biyofilm azalması sağladı. Bu çalışma aynı zamanda, biyofilm aracılı bakteriyel hastalıkların gelecekteki tedavisinde tasarlanmış çekirdek söndürme enzimlerinin kullanılma olasılığını da göstermiştir. Son olarak, yöntem, umut verici çekirdek söndürücü enzimlerin yeterliliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Doğal tipte GKL ve geliştirilmiş GKL çift mutant (E101G / R230C) kristal viyole niceleme deneyde, iki çekirdek giderici enzimler biyofilm oluşumunu kesintiye uygulanabilirliğini göstermek için kullanılmıştır. Her iki enzim karşı lactonase etkinliğini göstermek için gösterilmiştir 3-hidroksi-dekanoyil-L-homoserin lakton (3-OH-Cı 10 -HSL), A. kullandığı başlıca çekirdek molekülün baumannii S1 14. Biyofilm bozulma geçerli bir değerlendirme için, (daha...

Çekirdek giderici enzimler, antibiyotik direnci ve biyofilm oluşumu ile ilişkili virülans faktörlerinin ve genlerin ekspresyonunu önleyerek, direnç oluşma riski olmadan patogenezi hafifletebilen anti-virülan ve anti-bakteriyel seçeneklerdir. Bu çalışmada, bakteriyel biyofilm bozulmasında çekirdek söndürücü enzimlerin etkinliğini gösteren bir yöntem bildirilmiştir.

Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel biyofilm bozulmasında kuorum söndürme (quorum-quenching) enzimlerinin etkinliğini göstermektir. Bu yöntem, antibakteriyel terapötikler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına ve kuorum söndürücü laktonazların bir biyofilm ortamındaki patojenik bakteriler üzerindeki etkisinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, kuorum söndürücü laktonazların in vitro bir ortama doğrudan eklenebilmesidir.Böylece, biyofilm bozulması üzerindeki etkisi kolayca miktarlaştırılabilir. Bu prosedürü laboratuvarımızdaki teknisyen Terrence Tay uygulamaktadır. Başlamak için, 5 mililiter A.baumannii S1 kültürünü LB içerisinde, sallamalı bir inkübatörde 30 degrees Celsius sıcaklıkta 16 saat boyunca büyütün.Kültürü 0,8 OD 600 değerine ayarlayın. Ardından, kültürü 1:100 oranında seyreltmek için mililitre başına 4 mg saflaştırılmış GKL enzimi içeren taze LB kullanın. Ve 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 100 µL ekleyin.Plakaları kapatmak için kapakları kullanın ve plakaları 10 litrelik plastik bir kaba yerleştirin. Kabı sızdırmaz hale getirin ve besiyerini nazikçe uzaklaştırmadan önce 30 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Kuyucuklara 100 µL taze LB besiyeri ekleyin ve plağı 30 °C'de 21 saat boyunca inkübe edin.Besiyeri nazikçe uzaklaştırıldıktan sonra, planktonik bakteri hücrelerini nazikçe yıkamak için 200 µL steril su kullanın. Hava ve sıvı ara yüzeyindeki biyofilm tabakasına minimum müdahalede bulunmak için pipet ucunu kuyucuğun tabanına yerleştirin ve sıvı besiyerini dikkatlice çekin. Ardından her kuyucuğa 100 µL %1 kristal viyole çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.Kuyucukları üç kez 200 µL steril su ile yıkayarak kristal viyole çözeltisini uzaklaştırın. Boyayı çözmek için her kuyucuğa 100 µL %33 asetik asit ekleyin ve hafif sallayarak 15 dakika inkübe edin. Kristal viyolenin 600 nm'deki absorbansını ölçerek biyofilm miktarını belirleyin.Kristal viyole miktarı, oluşan biyofilm miktarı ile orantılıdır. A.baumannii S1 biyofilmlerinin konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) analizini gerçekleştirmek için, 5 mL A.baumannii S1 kültürünü LB içerisinde, çalkalamalı inkübatörde 30 °C'de 16 saat boyunca büyütün. A.baumannii S1 kültürünü 0,8 OD 600 değerine ayarlayın.Ardından, kültürü 1:100 oranında seyreltmek için 1,2 mg/mL saflaştırılmış GKL enzimi içeren taze LB kullanın ve 35 mL'lik cam tabanlı bir mikroçana bir mL ekleyin. Mikroçana bir kapak kapatın, 10 L'lik plastik bir kaba yerleştirin ve çana를 30 °C'de üç saat inkübe etmeden önce kabı mühürleyin. Besiyerini nazikçe uzaklaştırdıktan sonra, 30 µL saflaştırılmış GKL enzimi içeren bir mL taze besiyeri ekleyin ve ardından 30 °C'de 21 saat daha inkübe edin.Besiyerini ikinci kez nazikçe uzaklaştırın ve yerine taze besiyerinde hazırlanmış bir mililitre GKL enzimi ekleyin. 30 °C'de 24 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından besiyerini nazikçe uzaklaştırın ve HBSS içinde çözünmüş beş mikrogram/mL konsantrasyonunda 500 µL Alexa Fluor 488 konjuge buğday germi aglutinin ekleyin.Biyofilmleri boyamak için mikro kabı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Biyofilmleri sabitlemek için HBSS içinde çözünmüş 500 µL %3,7 formaldehit ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Mikro kabı bir kez yıkamak için 2 mL HBSS kullanın, ardından çözeltiyi tamamen uzaklaştırın.CLSM görüntülemesi öncesinde kabı dört derece Celsius'ta karanlıkta saklayın. CLSM görüntüleme ve analizi için, her görüntü başına 0,21 mikronluk stack aralığı ile 97 stack oluşturmak üzere 63X objektif kullanın. Kristal viyole miktar belirleme deneyinde, A.baumannii S1 tarafından kullanılan temel quorum molekülü olan üç hidroksidekanoil l homoserin lakton veya 3OHC10HSL'ye karşı laktonaz aktivitesi için Vahşi tip GKL ve geliştirilmiş bir GKL çift mutant quorum-quenching enzimi kullanılmıştır. Burada gösterildiği üzere, her iki enzim de ön işlem görmüş Vahşi tip A.baumannii S1'de biyofilm oluşumunu önemli ölçüde azaltabilmiştir. Her iki enzimin biyofilm yıkım derecesi, 3OHC10HSL'ye karşı etkinlikleri ile orantılı değildir.Bu tabloda görüldüğü üzere, mutant GKL'nin 3OHC10HSL'ye karşı turnover hızı, Yaban-tip GKL'den altı kat daha hızlıdır. Ancak, enzimler arasındaki biyofilm yıkım derecesindeki fark sadece iki katıdır. Bu deneyde, geliştirilmiş GKL mutant enzimi ve bu enzimin katekol inert formu karşılaştırma amacıyla kullanılmıştır.Bu DIC görüntüsü, geliştirilmiş GKL mutant enzimi ile yapılan tedavinin, inaktif enzimle karşılaştırıldığında biyofilm boyutunda bir azalmaya yol açtığını göstermektedir. Floresan görüntülerinin analizi, geliştirilmiş GKL mutant enzimi ile tedavi edildiğinde yüzey alanında, biyokütlede ve biyofilmlerin ortalama kalınlığında bir azalma olduğunu da ortaya koymuştur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülmesi durumunda inkübasyon süresi hariç üç ila dört saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, yıkama basamakları sırasında biyofilmin uzaklaştırılmasının ve bozulmasının minimize edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, hücre sayımı ve enzim stabilite analizleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu, biyofilm içindeki hücre popülasyonu üzerinde kuorum sönümleyici laktonazların etkeleri ve etki süreleri gibi ek sorulara yanıt verecektir.Bu teknik geliştirildikten sonra, enfeksiyon hastalıkları tedavisi alanındaki araştırmacıların, patojenik bakteriler tarafından üretilen biyofilmlerdeki potansiyel quorum-quenching laktonazların etkilerini araştırmalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kristal viyole boyama ile biyofilm yıkımının nasıl niceleneceği ve konfokal görüntüleme ile biyofilmlerdeki morfolojik değişikliklerin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenik materyallerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.Bu prosedür gerçekleştirilirken, uygun biyolojik riskle mücadele tesislerinin kullanılması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

anti-virulent-disruption-pathogenic-biofilms-using-engineered-quorum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Tay, S. B. ve diğerleri. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması.  J. Vis. Exp. (2016)Video, patojenik bir bakteride biyofilm biyokütlesini nicelendirme yöntemini gösteriyor; tedavi edilmemiş kontroller ve yeterli güç söndürme enzimiyle işlenmiş örnekler karşılaştırılıyor. Bu enzim, erken kuluçka sırasında bakteriyel sinyalleri bozarak hücre yapışmasını azaltır. Yıkama ve daha fazla kuluçkadan sonra, kontrol kuyuları...

Patojenik Bakterilerde Enzim Kaynaklı Biyofilm Bastırmanın Nicelendirilmesi

Kaynak: Tay, S. B., et.al. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması.  J. Vis. Exp. (2016)Bu video, bakteriyel hücre sinyalini bozan bir enzimin eklenmesiyle biyofilm oluşumunu inhibre etme sürecini göstermektedir. Bu enzim, bakterilerin hücre dışı polimerik maddeler üretmesini engeller ve böylece cam tabanlı mikro tabak üzerinde biyofilm gelişimini azaltır. Son olarak, biyofilm yapısı floresan lektinler ve konfokal lazer tarama...

Biyofilm oluşumunun enzim aracılı inhibisyonunun mikroskobik değerlendirmesi

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

Biyofilm enfeksiyonları kemoterapiye karşı yüksek tolerans gösterir. Tek bir tahlil biyofilmlerin karmaşıklığını yakalayamaz. Bunun yerine, tamamlayıcı tahlillere ihtiyaç vardır. Canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi tahlillerini birleştiren bir tarama platformu (S. aureus için geliştirilmiş) sunuyoruz. Uzun vadeli kemoterapötik etkilerin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere anti-biyofilm ilaç keşfine izin verir.

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Bu protokol, yüksek verimli 96 kuyulu sabitlenmiş kapak statik biyofilm taraması için kendinden montajlı derin kuyu PCR plakalı cihazları kullanarak biyofilm büyümesi ve biyokütle ölçümleri yapmak için metodoloji sunar.

PCR-Plate Deep Well Microplate Cihazları Kullanılarak Daha Büyük Bakteriyel Biyofilm Biyokütlesinin Oluşturulması

Bu protokol, süt endüstrisinde biyofilmlerin eradikasyonunda organik peroksiasitlerin etkinliğini değerlendirmek için statik ve dinamik yöntemleri birleştiren bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, biyofilmleri kontrol etmek için yeni biyolojik veya kimyasal formülasyonların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.

Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

Tiyofensülfonamid bileşikleri, aktivitelerini in vivo olarak bloke eden ve böylece virülans, motilite ve biyofilmler için genlerin transkripsiyonunu önleyen Vibrio çekirdek algılama düzenleyicileri LuxR/HapR'nin güçlü ve spesifik inhibitörleridir. Bu protokol, bu bileşiklerin nasıl sentezlendiğini, in silico olarak nasıl modellendiğini ve LuxR/HapR'ye karşı aktivite için in vivo olarak nasıl test edildiğini detaylandırır.

Vibrio Quorum Algılama İnhibitörlerinin Sentezi ve Testi

Bu protokolün amacı, biyoaktif bileşikler tarafından çekirdek algılama inhibisyonunu değerlendirmek için bir vekil olarak Chromobacterium violaceum ATCC 12472 tarafından violacein üretimini ölçmektir.

Chromobacterium violaceum'da violacein miktarının belirlenmesi ve biyoaktif bileşikler tarafından inhibisyonu

Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol...

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Keşfedin, mühendislikle geliştirilmiş nisabı giderici laktonazlar kullanarak A.baumannii S1 patojen biyofilmlerinin parçalanmasını. Bu yöntem, antibakteriyel terapiler için direnç riskini azaltır.

Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması

Daha fazla video keşfet