β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Bu yöntemin genel amacı, kristalleşecek ve kırınım verecek miligram miktarlarda dış membran beta-varil proteinleri elde etmektir. Bu yöntem, beta-varil proteinlerinin hücre membranlarına nasıl yerleştirildiği gibi, membran proteini katlanması ve taşınması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beta-varil proteinleri için sağlam olmasıdır.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, saflaştırma, kristalleştirme ve defraksiyon için deterjan seçimi zorlayıcı olduğundan güçlük çekeceklerdir. Laboratuvardaki meslektaşlarım ve benim yanı sıra, Susan Buchanan'ın laboratuvarından postdoktora öğrencisi Jeremy Guerin prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı üzere, in vivo ekspresyonla membrana aktarılacak, kodon optimizasyonu yapılmış hedef dış membran proteini veya OMP genini içeren bir T7 ekspresyon vektörünün oluşturulmasıyla başlayın.

Konstrüktü, 1 µL plazmidi 50 µL BL21(DE3) kimyasal kompetan hücreye pipetleyerek ve pipetle yukarı aşağı çekerek nazikçe karıştırıp ekspresyon için bir bakteri ekspresyon suşuna dönüştürün. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir su banyosu kullanarak 42 °C'de 30 saniye boyunca ısı şoku uygulayın ve ardından bir dakika boyunca tekrar buz üzerine yerleştirin.

Bir mililitre önceden ısıtılmış SOC medyumu ekleyin ve masaüstü çalkalayıcı inkübatör kullanarak 37 °C'de, 1000 RPM hızda bir saat boyunca çalkalayın. İnkübasyonun ardından, 100 µL hücreyi uygun bir antibiyotik içeren LB Agar plaklarına ekin ve ters çevrilmiş halde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, antibiyotikli 5 mL LB kültürüne tek bir koloni inoküle ederek küçük ölçekli ekspresyon testlerini gerçekleştirin.

İşlemi beş ila 10 koloni için tekrarlayın. 600 nanometrede yaklaşık 0,6 optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 degrees Celsius'de çalkalayarak büyütün. Her bir kültür tüpüne 5 µL 1 M IPTG ekleyerek hedef OMP'nin ekspresyonunu indükleyin ve bir ila iki saat daha büyümesine izin verin.

Tüm kolonilerin ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak için, her bir kültürden bir mililitreyi bir mikrosantrifüj kullanarak 15,000 ×g hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 200 µL 1X SDS-PAGE yükleme tamponunda yeniden süspande edin. 100 °C'de beş dakika boyunca ısıtın ve ardından 15,000 ×g hızında beş dakika daha santrifüjleyin.

Yüzde on'luk bir jelin her bir kuyucuğuna 20 µL pipetleyerek örnekleri SDS-PAGE ile analiz edin. Jeli, sabit 200 V'da 35 dakika boyunca çalıştırın. Son olarak, hücreleri 6000 ×g'de on dakika santrifüj ederek toplayın.

Hücreleri, gram başına beş mililitre olacak şekilde lizis tamponu ile yeniden süspande edin. Hücreleri bir French presi veya hücre homojenizatörü kullanarak lize edin. Ardından, lize edilmemiş hücreleri ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için lize edilen hücreleri 4 °C'de, 15.000 ×g hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı temiz bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede bir saat boyunca tekrar yüksek hızda santrifüjleyin. Elde edilen pelet, ilgilenilen proteini içeren membran fraksiyonudur. Membran fraksiyonunu bir Dounce homojenizatörü kullanarak yeniden süspande edin.

Öncelikle membranları aktarın ve ardından deterjansız, 2X konsantrasyonda solubilizasyon tamponu ekleyin. Resüspande edilen membranları dereceli bir silindire boşaltın ve 1X nihai solubilizasyon tamponu konsantrasyonuna ulaşana kadar su ekleyin. Numuneyi bir behere aktarın ve kritik misel konsantrasyonun yaklaşık 10 katı olacak nihai bir konsantrasyona ulaşana kadar deterjanı yavaşça ekleyin.

Ardından, hedef proteinin membranlardan ne kadar kolay ekstrakte edildiğine bağlı olarak, 4 °C'de 0,5 ila 16 saat boyunca karıştırın. Son olarak, solubilize edilmiş örneği 4 °C'de, 300.000 ×g hızda bir saat boyunca santrifüjleyin. Bir ila beş mililitrelik bir IMAC kolonu hazırlayın veya önceden doldurulmuş bir kolon kullanın.

Sonraki kromatografi adımlarını dört santigrat derecede gerçekleştirin. Koruyucu madde kalıntılarını gidermek için su ile yıkayın. Otomatik bir saflaştırma sistemi kullanılıyorsa, kolonu üretici talimatlarına göre kurun.

İmidazol içermeyen 500 mililitre IMAC tampon A ve bir molar imidazol içeren 250 mililitre IMAC tampon B hazırlayın. IMAC kolonunu 10 kolon hacmi IMAC tampon A kullanarak dengeleyin. Protein örneğine final konsantrasyonu 25 milimolar olacak şekilde imidazol ekleyin ve karıştırın. Ardından, örneği dengelenmiş IMAC kolonuna dakikada iki mililitre hızla yükleyin.

Akış sıvısını toplayın. Ardından, IMAC kolonunu tampon B kullanarak, artan imidazol konsantrasyonları ile beş kolon hacmi şeklinde yıkayın. Yıkama sıvılarını iki mililitrelik fraksiyonlar halinde toplayın. Numuneyi, beş kolon hacmi boyunca 250 milimolar nihai konsantrasyon ile elüe edin ve elüe edilen numuneyi iki mililitrelik fraksiyonlar halinde toplayın.

Akış hızı, yıkama fraksiyonları ve elüsyon fraksiyonlarını, 280 nanometredeki absorbanslarına göre SDS-PAGE analizi kullanarak analiz edin. SDS-PAGE analizi ile doğrulanan, hedef beta-varil OMP içeren fraksiyonları birleştirin. Ardından, birleştirilmiş örneğe TEV proteaz ekleyiple dört santigrat derecede, hafif sallama ile gece boyunca inkübe ederek 6X histidin etiketini uzaklaştırın.

Hedef beta-varil OMP'yi kesilmiş etiketlerden ve kesilmemiş örneklerden ayırmak için örnek proteaz çözeltisini tekrar bir IMAC kolonuna yükleyin. Akış yolu (flow-through), etiketten yoksun kesilmiş örneği içerecektir. Kristalleşme hazırlığı için örneği, kristalleşmede kullanılacak deterjanı içeren bir tampon çözeltisi ile jel filtrasyon kolonuna yükleyin.

Bir mililitrelik fraksiyonlar toplayın ve 280 nanometredeki absorbanslarına dayanarak SDS-PAGE analizi ile analiz edin. Hedef proteini içeren fraksiyonları birleştirin ve ardından yaklaşık 10 miligram/mililitre olacak şekilde konsantre edin. Numuneleri hazırlamadan önce jel düzeneğini kurun.

Ön soğutmalı jel yürütme tamponu kullanın veya jeli soğuk odada yürütün. Partikülleri ve çökelekleri uzaklaştırmak için örneği 0,22 micron'luk bir santrifüj filtresinden geçirin. Ardından, örnekten 0,25 microliter alarak iki adet 1,5 milliliter'lık mikro santrifüj tüpüne pipetleyin.

Birini "kaynatılmış" ve diğerini "RT" (oda sıcaklığı) olarak etiketleyin. Ardından, her tüpe 9,75 µL örnek tamponu ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Her iki örneğe ayrıca 10 µL 2X SDS yükleme tamponu ekleyin ve pipetleyerek nazikçe karıştırın. "Kaynatılmış" örneği 95 °C'de beş dakika boyunca kaynatın, "RT" örneğini ise oda sıcaklığında bırakın.

Ardından, kaynatılmış örneği kısa süreliğine santrifüjleyin. Daha sonra, her iki örnekten 20 µL'lik miktarları önceden hazırlanmış native jelle yükleyin. Jeli sabit 150 V'da 60 dakika boyunca çalıştırdıktan sonra jeli çıkarın ve sonuçları görselleştirmek için boyama çözeltisinde bekletin.

Daha önce yayınlanmış Jove yöntemlerini kullanarak deterjan, bi-hücreler ve lipidik kübik fazda kristalleşme denemelerini gerçekleştirin. Kristallerin gerçekten protein olduğunu; çözünmüş, lipid veya deterjan olmadığını doğrulamak için kristalleşme başlıkları bir UV mikroskop altında incelenir. Kristallerin kırınım yapıp yapmadığını görmek için öncü kristaller, laboratuvar içi bir kaynakla veya sinkrotronla taranır.

İyi kırınım veren kristallerin veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, verileri HKL2000 gibi bir veri işleme yazılımı kullanarak işleyin. Elde edilen dosyaları Phoenix Suit gibi bir yapı belirleme yazılım paketine aktarın ve başlangıç fazlama ile yapı belirleme için moleküler yerleştirme işlemini gerçekleştirin. YIUR'un kristal yapısı, bu yöntem kullanılarak 2,6 Angstrom çözünürlükte belirlenmiştir.

Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığı takdirde iki hafta içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, yapısal çalışmalar için bakteriyel dış membran proteinlerinin nasıl eksprese edileceği ve saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.