Name: β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Öğrenin β-varil dış membran proteinlerinin kristalleşmesi ve yapı tayini için sağlam bir ekspresyon ve saflaştırma yöntemini. Bu teknik, membran protein katlanması ve taşınması araştırmalarında yeni bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UV görüntülerini sağladıkları için CNRS'den Herve Celia'ya ve SONICC görüntülerini sağladıkları için Purdue Üniversitesi Kimya Bölümü'nden Chris Dettmar ve Garth Simpson'a teşekkür ederiz. Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Intramural Araştırma Programı'ndan sağlanan fonları kabul etmek isteriz. Ek olarak, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (AMS ve CJ), Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (N.N. 1K22AI113078-01) ve Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden (N.N.) ek finansman sağlamak isteriz.

<ol><li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes%3A+evolutionary+conservation+and+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li>
<li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bam+machine%3A+A+molecular+cooper%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li>
<li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li>
<li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+YaeT%3A+conformational+flexibility+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li>
<li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li>
<li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li>
<li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li>
<li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins%3A+a+summary+of+recent+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
<li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+transferrin+bound+iron%3A+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
<li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchanan%2C+SK+%22Comprehensive+Biophysics%22">Comprehensive Biophysics</a>. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia%3A+implications+for+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li>
<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li>
<li>Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnard%2C+TJ+%22Curr+Prot+in+Prot+Science%22">Curr Prot in Prot Science</a>. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).</li>
<li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> JoVE. , e3383(2012).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , e4000(2012).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+refolding+of+an+80-kDa+iron+transporter+from+the+outer+membrane+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli.</a> Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-barrel+proteins+from+bacterial+outer+membranes%3A+structure%2C+function+and+refolding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding.</a> Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).</li>
<li>Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+folding+proteins+into+membranes%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+of+Biochem+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The process of folding proteins into membranes: challenges and progress.</a> Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).</li>
<li>Pautsch, A., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+protein+A+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain.</a> Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).</li>
<li>Cowan, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+OmpF+porin+in+a+tetragonal+crystal+form%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form.</a> Structure. 3, 1041-1050 (1995).</li>
<li>Ujwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+A+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> PNAS. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377(2006).</li>
<li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?</a> BMC Genomics. 13, 510(2012).</li>
<li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li>
<li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li>
<li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li>
<li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

β-varil OMP bakteri, mitokondri ve kloroplastların Gram-negatif temel rolleri hizmet ve bu ilgili organellerin dış zarlarında da temel moleküler mekanizmaları hakkında bilgi hazinesi sunan yapısal analiz için önemli hedeflerdir. Ancak, yapısal analiz için yeterli örnek üreten her zaman kolay değildir ve bu nedenle, genel bir boru hattı detaylı kristallerine yapılardan sürecini anlatan, yapı tayini için hedef β-varil OMPlerin yeterli miktarda üretimi için sunulmuştur. Bu protokoller, test edilmiş ve gram-negatif bakteril...

β-varil OMP sadece mitokondri, kloroplast dış zarlarında bulunan ve Gram-negatif bakteriler 1-3 edilebilir. bunlar α-helikal proteinleri olarak benzer rolleri hizmet ederken, her şerit içten iki komşu şeritlerin bağlı olmak üzere 8-26 adet anti-paralel β-ip kolları arasında değişen bir merkezi doku, gömülü β-barrel alanından oluşan çok farklı kıvrım (Şekil 1 ve 2). β-barrel alan ilk ve son şeritler daha sonra yakın ve çevresindeki membrandan β-barrel alan mühür (mitokondriyal SSVD hariç), bir anti-paralel bir şekilde hemen hemen tamamen birbiriyle etkileşime girer. Tüm β-barrel OMPlerdir Bu döngüler bazen Neisseria transferrin bulunan Pro bağlayıcı 75 kalıntı, kadar büyük olması ile, ligand etkileşimleri ve / veya protein-protein temasları önemli bir rol oynar farklı sekanslarda ve uzunluklarda hücre dışı ilmiklitein A (TbpA) 4. β-varil OMP da proteinin fonksiyonel bir amaç için ek etki hizmet N-terminal ya da C-terminal periplazmik uzantılarına sahip (örneğin, Bama 5-7, Fadl 10 8,9, FimD). Β-varil OMPlerin birçok çeşit 11 bulunmakla birlikte, daha yaygın türlerinden iki alanda, (1) TonB bağımlı nakliyeciler ve (2) autotransporters daha az aşina olanlar için örnekler olarak aşağıda açıklanmıştır. TonB bağımlı taşıyıcılar (örneğin, FEPA, TbpA, BtuB, Cir, vs.) besin alma için gerekli olan ve bir C-ucu β- 22 bükümlü içinde sıkışmış bulunmuş ~ 150 kalıntısından oluşan bir N-terminal fiş alanı içermektedir varil alanı dış zar 12 (Şekil 3) içine gömülü. Bu fiş alanı serbest kovan alanı üzerinden geçen substratın engellerken, alt-tabaka bağlanma fiş etki th içinde yapısal bir değişikliği indüklerpotansiyel olarak (fiş düzenlenmesi veya fişin kısmi / tam fırlatma yoluyla) daha sonra periplazmaya dış zarından substrat taşımacılığının kolaylaştırılması için oluşumunu gözenek. TonB bağımlı taşıyıcıları örneğin insan konak proteinler 4,13,14 şirketinden demir gibi besin kaçırmak özel taşıyıcılar geliştiğini Neisseria meningitidis gibi gram-negatif bakterilere, bazı patojen soylarının hayatta kalmak için özellikle önemlidir. Autotransporters olarak salgılanan veya sunulmuştur ya β-barrel alan (ESTA ve EspP gibi, tipik olarak 12-ip kolları) oluşmaktadır olan B-bloğu OMPlerdir ve bir yolcu alan Gram-negatif bakteri türü V salgılama sistemine ait olan olan hücre 15,16 (Şekil 3) yüzeyi. Bu β-barrel OMPlerdir genellikle hizmet yolcu etki hücre hayatta kalma ve virülans önemli roller hizmet ya proteaz adezin, ve / veya diğer EFfector bu patogenezi aracılık eder. X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopi ve elektron mikroskobu (EM) bize sırayla onlar dış zarının içinde işlev tam olarak nasıl deşifre etmek için kullanılabilir atomik çözünürlükte OMPlerin modelleri belirlemek için izin olarak yapısal yöntemler. Bu paha biçilmez bilgiler daha sonra varsa ilaç ve aşı geliştirilmesi için kullanılabilir. Örneğin, transferin bağlanma proteini A (TbpA) Neisseria yüzeyi üzerinde bulunan ve doğrudan insan transferin bağlanır ve daha sonra özü ve kendi hayatta kalma demir alır, çünkü patogenezi için gereklidir. TbpA olmadan, Neisseria, insan ev sahibi demir temizlemek edemez ve patojenik olmayan bir hale getirilmektedir. TbpA 4 bağlı insan transferin kristal yapısı çözüldü sonra, iki protein ilişkili ne kadar net oldu TbpA ne bölgeleri etkileşimini aracılık, TbpA demir çıkarılması için önemli ne vardı artıkları venasıl bir TbpA hedefleyen Neisseria karşı ilaçlar geliştirebilmek olabilir. Bu nedenle, hayatta kalma ve patogenezinde Gram-negatif bakterilerde β-barrel OMPlerin önemi göz önüne alındığında, aynı zamanda mitokondri ve kloroplast fonksiyonu ve ek yapısal zar proteinlerinin bu eşsiz sınıfı hakkında bilgi ve bunların işlevi de sistemleri için ihtiyaç genel protokoller ifade ve yapısal yöntemlerle karakterizasyonu için yüksek seviyelerde hedef OMPS saflaştırılması genel amacı ile sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Kristalizasyon Robotu</td><td>TTP Labtech, Art Robbins-Any</td><td></td><td>, LCP kristalizasyon</td></tr><tr><td>PCR termodöngüleyici</td><td>Eppendorf, BioRad-Media</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick, Infors HT-UV-vis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>spektrometresi</td><td>Eppendorf-SDS-PAGE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cihazı</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td> <td>dışında burada çalışmalıdır</td></tr><tr><td>SDS-PAGE ve doğal jeller</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE Healthcare-AkTA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Purifier</td><td>GE Healthcare-Microcentrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr>Eppendorf-Centrifuge<td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(düşük-orta hız)</td><td>Beckman-Coulter-Ultracentrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(yüksek hız)</td> <td>Beckman-Coulter-SS34</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rotor</td><td>Sorvall-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>45 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter-Dounce</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>homojenizatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin-Diyaliz</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tüpü</td><td>Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP araçları</td><td>Hamilton, TTP</td> <td>Labtech-VDX</td><td></td></tr> <tr><td>24 kuyulu plakalar</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Sandviç tabaklar</td><td>Hampton Research, Moleküler Boyutlar</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Grace Kristalizasyon</td><td>levhaları Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR sütunu</td><td>GE Sağlık</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Q-Sefaroz sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>Kristalizasyon ekranları</td><td>Hampton Research, Qiagen, Moleküler</td> <td>Boyutlar-Gaz</td><td></td></tr> <tr><td>geçirmez şırınga (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

β-varil dış membran proteinleri yapı tayini doğru - yapıların itibaren crystals

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membran proteinleri, hücrelerde besin taşınması, hareketlilik, sinyalleşme, hayatta kalma ve virülans gibi önemli işlevlere hizmet eder, ancak bilinen yapıların yalnızca ~%1'ini oluşturur. α sarmal ve β namlu olmak üzere iki tür zar proteini vardır. α sarmal zar proteinleri hemen hemen tüm hücre zarlarında bulunabilirken, β varil zar proteinleri yalnızca mitokondri, kloroplastlar ve Gram negatif bakterilerin dış zarlarında bulunabilir. Genel olarak zar proteinlerinin yapısal çalışmalarında yaygın bir darboğaz, analiz için yeterli saf numune almaktır. En sevdikleri β-namlulu dış zar proteininin (OMP) yapısını çözmekle ilgilenenlere yardımcı olma umuduyla, X-ışını kristalografisi ve / veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yararlı seviyelerde hedef β namlulu OMP'lerin üretimi için genel protokoller sunulmaktadır. Burada, hem doğal ifade hem de inklüzyon cisimlerine ifade için yapı tasarımını, bir afinite etiketi kullanarak saflaştırmayı ve deterjan eleme, bicelle ve lipidik kübik faz tekniklerini kullanarak kristalleştirmeyi özetliyoruz. Bu protokoller test edilmiş ve Gram-negatif bakterilerden elde edilen çoğu OMP için işe yaradığı bulunmuştur; Bununla birlikte, özellikle mitokondri ve kloroplastlar için, ekspresyon ve saflaştırma için başka yöntemler gerektirebilecek bazı hedefler vardır. Bu nedenle, buradaki yöntemler, Gram-negatif bakterilerden OMP'leri içeren çoğu proje için geçerli olmalıdır, ancak saflaştırılmış numunenin ifade seviyeleri ve miktarı, hedef OMP'ye bağlı olarak değişecektir.

YiuR Yersinia pestis karşı olası bir aşı hedefi olan bir TonB bağımlı demir taşıyıcıdır. Bu orjinal mikro-dizi analizi kullanılarak belirlenmiştir. Burada, X-ışını kristalografisi kullanarak YiuR yapısını belirlemek için alınmıştır adımlar (Şekil 9) özetlenmiştir. Klonlama için YiuR DNA sekansı (eksi N-terminal sinyal sekansı) PCR genomik DNA&#39;dan kuvvetlendirildi ve TEV proteaz sitesi ardından bir N-terminali pelB sinyal sekansı ve 10x-histidin afin...

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Bu yöntemin genel amacı, kristalleşecek ve kırınım verecek miligram miktarlarda dış membran beta-varil proteinleri elde etmektir. Bu yöntem, beta-varil proteinlerinin hücre membranlarına nasıl yerleştirildiği gibi, membran proteini katlanması ve taşınması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beta-varil proteinleri için sağlam olmasıdır.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, saflaştırma, kristalleştirme ve defraksiyon için deterjan seçimi zorlayıcı olduğundan güçlük çekeceklerdir. Laboratuvardaki meslektaşlarım ve benim yanı sıra, Susan Buchanan'ın laboratuvarından postdoktora öğrencisi Jeremy Guerin prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı üzere, in vivo ekspresyonla membrana aktarılacak, kodon optimizasyonu yapılmış hedef dış membran proteini veya OMP genini içeren bir T7 ekspresyon vektörünün oluşturulmasıyla başlayın.Konstrüktü, 1 µL plazmidi 50 µL BL21(DE3) kimyasal kompetan hücreye pipetleyerek ve pipetle yukarı aşağı çekerek nazikçe karıştırıp ekspresyon için bir bakteri ekspresyon suşuna dönüştürün. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir su

from-constructs-to-crystals-towards-structure-determination-barrel

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa - Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik kübik ve sünger aşamalarında büyüdü hasat ve kriyo-serin membran proteini kristaller Yapısal ve İşlevsel Biyoloji Grup Caffrey Membran uygulanan prosedürler açıklanmıştır.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Büyük sarmal bobin alanlarının karakterizasyonuna ve kristalizasyonuna rehberlik etmek için basit biyokimyasal ve hesaplamalı analizi içeren bir çerçeve tanımlıyoruz. Bu çerçeve, küresel proteinler için uyarlanabilir veya çeşitli yüksek verimli teknikleri içerecek şekilde genişletilebilir.

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Bu yöntem klonlama, ifade ve yapısal tayini için rekombinant Nsa1 arınma x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS) tarafından açıklar ve diğer proteinlerin hibrid yapısal analiz için geçerlidir her ikisi de içeren düzenli ve düzensiz etki alanları.

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050'nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Öğrenin β-varil dış membran proteinlerinin kristalleşmesi ve yapı tayini için sağlam bir ekspresyon ve saflaştırma yöntemini. Bu teknik, membran protein katlanması ve taşınması araştırmalarında yeni bilgiler sunar.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Daha fazla video keşfet