β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Bu yöntemin genel amacı, kristalleşecek ve parçalanacak olan dış zar beta-fıçı proteinlerinin miligram miktarlarını elde etmektir. Bu yöntem, beta-varil proteinlerinin hücre zarlarına nasıl yerleştirildiği gibi, zar proteini katlanması ve taşınması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beta-varil proteinleri için sağlam olmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü saflaştırma, kristalizasyon ve ayrıştırma için deterjan seçimi zordur. Susan Buchanan'ın laboratuvarından bir doktora sonrası araştırmacı olan Jeremy Guerin, kendim ve laboratuvardaki meslektaşlarına ek olarak prosedürü gösterecek. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi zara in vivo ekspresyon için kodon optimize edilmiş hedef dış zar proteinini veya OMP genini içeren bir T7 ekspresyon vektörünün inşası ile başlayın.

Bir mikrolitre plazmidi 50 mikrolitre BL21 (DE3) kimyasal olarak yetkin hücrelere pipetleyerek yapıyı ifade etmek için bir bakteri ekspresyon suşuna dönüştürün ve yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın. İnkübasyonun ardından, bir su banyosu kullanarak 30 saniye boyunca 42 santigrat derecede ısı darbesi yapın ve ardından bir dakika boyunca tekrar buzun üzerine koyun.

Bir mililitre önceden ısıtılmış SOC ortamı ekleyin ve tezgah üstü çalkalayıcı inkübatörü kullanarak 37 RPM'de bir saat boyunca 1000 santigrat derecede çalkalayın. İnkübasyondan sonra, 100 mikrolitre hücreyi uygun bir antibiyotik içeren LB Agar plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede ters çevrilmiş olarak inkübe edin. Daha sonra, beş mililitre LB içeren antibiyotik kültürünü tek bir koloni ile aşılayarak küçük ölçekli ekspresyon testleri yapın.

Beş ila 10 koloni için tekrarlayın. Yaklaşık sıfır nokta altı'nın 600 nanometresinde optik yoğunluğa kadar sallayarak 37 santigrat derecede büyüyün. Her kültür tüpüne beş mikrolitre bir molar IPTG ekleyerek hedef OMP'nin ekspresyonunu indükleyin ve bir ila iki saat daha büyümesine izin verin.

Tüm koloniler için ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak için, bir mikrosantrifüj kullanarak her kültürün bir mililitresini 15.000 kez G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre 1X SDS-PAGE yükleme tamponunda yeniden askıya alın. Beş dakika boyunca 100 santigrat derecede ısıtın ve ardından beş dakika boyunca 15.000 kez G'de tekrar santrifüjleyin.

Numuneleri SDS-PAGE kullanarak, yüzde onluk bir jelin her bir oyuğuna 20 mikrolitre pipetleyerek analiz edin. Jeli sabit 200 voltta 35 dakika çalıştırın. Son olarak, hücreleri on dakika boyunca 6000 kez G'de santrifüjleme ile hasat edin.

Lizis tamponundaki hücreleri, hücre macununun gramı başına beş mililitre oranında yeniden süspanse edin. Hücreleri bir French press veya hücre homojenizatörü kullanarak parçalayın. Daha sonra, parçalanmamış hücreleri ve hücre kalıntılarını çıkarmak için parçalanmış hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 15.000 kez G'de döndürün.

Süpernatanı temiz bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede bir saat boyunca yüksek hızda tekrar santrifüjleyin. Elde edilen pelet, ilgilenilen proteini içeren zar fraksiyonudur. Bir Dounce homojenizatör kullanarak membran fraksiyonunu yeniden süspanse edin.

Önce membranları aktarın ve ardından deterjan olmadan 2X konsantrasyonda çözündürme tamponu ekleyin. Yeniden süspanse edilmiş membranları dereceli bir silindire dökün ve nihai 1X çözündürme tamponu konsantrasyonuna ulaşılana kadar su ekleyin. Numuneyi bir behere aktarın ve kritik misel konsantrasyonunun yaklaşık 10 katı olan nihai konsantrasyona kadar yavaşça deterjan ekleyin.

Daha sonra, hedef proteinin zarlardan ne kadar kolay ekstrakte edildiğine bağlı olarak dört santigrat derecede 0,5 ila 16 saat karıştırın. Son olarak, çözündürülmüş numuneyi dört santigrat derecede bir saat boyunca 300.000 kez G'de santrifüjleyin. Bir ila beş mililitrelik bir IMAC sütunu hazırlayın veya önceden paketlenmiş bir sütun kullanın.

Sonraki kromatografi adımlarını dört santigrat derecede gerçekleştirin. Koruyucu kalıntılarını gidermek için suyla yıkayın. Otomatik bir arıtma sistemi kullanıyorsanız, sütunu üreticinin talimatlarına göre kurun.

İmidizol içermeyen 500 mililitre IMAC tamponu A ve bir molar imidizol ile 250 mililitre IMAC tamponu B hazırlayın. IMAC kolonunu 10 kolon hacmi IMAC tamponu kullanarak dengeleyin A. Protein örneğine 25 milimolar nihai konsantrasyona kadar imidizole ekleyin ve karıştırın. Ardından, numuneyi dakikada iki mililitre hızla dengelenmiş IMAC sütununa yükleyin.

Akışı toplayın. Daha sonra, IMAC kolonunu, tampon B kullanarak, her biri artan imidizol konsantrasyonlarına sahip beş sütun hacmiyle yıkayın. Numuneyi beş kolon hacmi için 250 milimolar nihai konsantrasyonla elute edin ve ayrıştırılmış numuneyi iki mililitrelik fraksiyonlar halinde toplayın.

280 nanometredeki absorbanslarına dayalı SDS-PAGE analizini kullanarak akışı, yıkama fraksiyonlarını ve elüsyon fraksiyonlarını analiz edin. SDS-PAGE analizi tarafından doğrulanan hedef beta-varil OMP'yi içeren fraksiyonları birleştirin. Ardından, havuzlanan numuneye TEV proteaz ekleyerek ve hafif sallama ile gece boyunca dört santigrat derecede inkübe ederek 6X histadin etiketini çıkarın.

Hedef beta-varil OMP'yi bölünmüş etiketlerden ve herhangi bir ayrılmamış numuneden ayırmak için numune proteaz solüsyonunu tekrar bir IMAC sütununa yükleyin. Akış, etiketi olmayan bölünmüş numuneyi içerecektir. Kristalizasyona hazırlanmak için, numuneyi kristalizasyon için kullanılacak deterjanı içeren bir tampona bir jel filtrasyon kolonuna yükleyin.

Bir mililitrelik fraksiyonları toplayın ve 280 nanometredeki absorbanslarına dayalı olarak SDS-PAGE analizini kullanarak analiz edin. Hedef proteini içeren bu fraksiyonları bir araya getirin ve ardından mililitre başına yaklaşık 10 miligrama konsantre edin. Numuneleri hazırlamadan önce jel aparatını monte edin.

Önceden soğutulmuş jel çalıştırma tamponu kullanın veya jeli soğuk odada çalıştırın. Partikülleri ve yağışı gidermek için 0,22 mikronluk bir santrifüj filtre kullanarak numuneyi filtreleyin. Ardından, numunenin 0,25 mikrolitresini iki adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne pipetleyin.

Birini haşlanmış", diğerini RT olarak etiketleyin"Ardından, her tüpe 9.75 mikrolitre numune tamponu ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Her iki numuneye de 10 mikrolitre 2X SDS yükleme tamponu ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın. Haşlanmış "numuneyi 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın, RT" numunesini oda sıcaklığında bırakın.

Ardından, haşlanmış "numuneyi kısaca döndürün. Ardından, her iki numuneden 20 mikrolitre önceden monte edilmiş doğal jel üzerine yükleyin. Jeli sabit 150 voltta 60 dakika çalıştırdıktan sonra jeli çıkarın ve sonuçları görselleştirmek için boyama solüsyonuna batırın.

Daha önce yayınlanmış Jove yöntemlerini kullanarak deterjan, çift hücreli ve lipidik kübik fazda kristalizasyon denemelerine devam edin. Kristalizasyon başlıkları, kristallerin gerçekten protein olduğunu ve çözünmemiş, lipit veya deterjan olduğunu doğrulamak için bir UV mikroskobu altında görselleştirilir. Kurşun kristaller, kristallerin ayrılıp bozulmadığını görmek için bir ev kaynağı kullanılarak veya senkrotronda taranır.

İyi dağılan kristallerin veri toplanmasından sonra, verileri HKL2000 gibi işleme yazılımları kullanarak işleyin. Elde edilen dosyaları yapı belirleme için Phoenix Suit gibi bir yazılım paketine aktarın ve ilk aşamalandırma ve yapı belirleme için moleküler değiştirme gerçekleştirin. YIUR'un kristal yapısı, bu yöntem kullanılarak 2.6 Angstrom çözünürlükte belirlendi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki hafta içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, yapısal çalışmalar için bakteri dış zar proteinlerinin nasıl ifade edileceğini ve saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.