Fare Embriyonik Kök Hücre Agregaların Üretimi Simetri Kırma, Polarizasyon ve Acil Toplu Davranış göster o

Bu protokolün genel amacı, süspansiyon kültüründe kendi kendine organize olan ve aksiyel uzamaya uğrayan, tek tip fare embriyonik kök hücre agregatları üretmektir. Bu yöntem, gastrulasyon gibi süreçlerde doku etkileşimlerinin aks belirlemedeki ve kendi kendine organizasyondaki rolü gibi, gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gelişimsel olayların, agregasyondan önce embriyonun dışında, yeni ve yapısökümcü bir perspektiften incelenmesine olanak sağlamasıdır.

Agregat oluşumu için fare embriyonik hücrelerini veya M MEC'leri, jelatin kaplı 25 santimetrekare doku kültürü işlemeli flasklarda ES.Lift medyumunda sürdürün. Hücrelerin %40 ila %60 konfluensa ulaştığı doku kültürü flaskı ile başlayın; medyumu aspire edin ve flaskı iki kez durulayın. PBS ile, 1 mL %0,25 tripsin EDTA ekleyin ve hücrelerin flasktan ayrılması için yaklaşık beş dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.

Ardından, ayrılmış hücre süspansiyonuna beş mililitre Es.Lift besiyeri ekleyin ve iyice karıştırın. Hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri saymak için bir mililitrelik bir alikot alın. Beş x 10⁴ hücreyi beş mililitre sıcak PBS'ye ekleyin ve hücreleri 170 x g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Peletten kaçınarak çözeltiyi aspire edin. Ardından beş mililitre PBS'yi nazikçe ekleyin ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Hücre peletini bozmadan maksimum hacmi aspire ederek çıkarın.

PBS kalıntısını önlemek için hücre peletini bir mililitre ılık N2B27 ortamında yeniden süspande edin. Homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için P1000 pipet ile iyice karıştırın.

Ardından, dört mililitre daha N two B 27 medium ile seyreltin. Hücre süspansiyonunu çok kanallı bir pipet kullanarak steril bir rezervuara aktarın. Hücreleri iyice karıştırın ve rezervuardan 40 µL hücre süspansiyonunu, ubo non doku kültürü işlem görmemiş her bir kuyucuğuna aktarın.

96 kuyucuklu plaka. Hücrelerin plakaya yapışmasını en aza indirmek için özellikle doku kültürü için uygun olmayan bir plaka kullanılır. Hücre agregasyonunun gerçekleşmesi için plakayı, %5 karbondioksit içeren, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin.

Plakayı inkübatörden çıkarın, hücreleri ters mikroskop altında gözlemleyin ve agregatların varlığını doğrulayın. Final konsantrasyonu 3 µM olacak şekilde, ılık N2B27 ortamına 10 mM CHI 9 9 0 2 1 stok çözeltisinden uygun hacimde ekleyin. Bu, hücre stimülasyonu için kullanılan ikincil ortamdır.

Çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğa 150 µL sekonder medyum dağıtın. Yapışık agregatları yerinden çıkaracak yeterli kuvveti uygulayın. İnkübasyondan sonra plakayı 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.

Hücre agregatını aspire etmeden medyumu dikkatlice uzaklaştırın. Her bir kuyucuğa, yapışık agregatları yerinden çıkaracak yeterli güçte 150 µL taze N two B 27 ekleyin. Bu işlemi, toplam yaklaşık beş günlük bir inkübasyon süresi boyunca her 24 saatte bir tekrarlayın.

Agregatları fiksasyon için hazırlamak için, öncelikle pipeti 30 derecelik bir açıyla tutarak her kuyucuktaki inkübasyon solüsyonunu nazikçe aspire edin. Hücre agregatının aspire edilmesini önlemek için her birine 150 µL PBS ekleyin. Agregatın dibe çökmesi için birkaç dakika bekleyin ve ardından PBS'yi aspire edin.

Steril makaslar kullanarak bu yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Bir P 1000 pipet ucunu, uç kısmının yaklaşık üç milimetre üzerinden kesin. Bu uçla, sıvıyı çekip küçük bir hacmi kuyucuğa boşaltarak işlemi tamamlayın.

agregatı karıştırmak ve kuyucuk tabanından ayırmak için. Ardından agregatı uçla çekin ve aynı prosedürü kullanarak agregatı cam bir drosophila diseksiyon kuyucuğuna aktarın. Aynı immünboyama prosedürlerine tabi tutulacak tüm agregatları tek bir diseksiyonda toplayın.

Diseksiyon kabını mikroskop altına yerleştirin ve agregatlar merkezi konuma getirmek için hafifçe çalkalayın. Ardından, herhangi bir agregatı çıkarmamaya dikkat ederek, PPS'yi kabın kenarından dikkatlice aspire edin.

Agregatları sabitlemek için bir mililitre taze hazırlanmış %4'lük formaldehit çözeltisi ekleyin ve kapları orbital sarsıcıda dört derece santigrat sıcaklıkta iki saat boyunca inkübe edin. Düşük hıza ayarlayın. Herhangi bir agregatın vakumlanmasını önlemek için formaldehit çözeltisini dikkatlice aspire edin ve ardından kuyuya bir mililitre PBS ekleyin.

Plakayı 10 dakika boyunca orbital çalkalayıcıya geri yerleştirin. Kuyucuktaki PBS'yi uzaklaştırın ve bu yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Ardından, bir mililitre P-B-S-F-T çözeltisi ekleyin ve plağı 10 dakika boyunca orbital çalkalayıcıya yerleştirin.

Çözeltiyi aspire edin ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Agregatları spesifik olmayan immünreaktiviteye karşı bloke etmek için her kuyucuğa bir mililitre P-B-S-F-T ekleyin. Plakayı orbital sallayıcıda, dört santigrat derecede, düşük hızda bir saat boyunca bekletin.

İnkübasyonun ardından, bloklama çözeltisini kuyucuklardan dikkatlice aspire edin ve P-B-S-F-T içinde dilüye edilmiş 500 µL primer antikor ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için plakayı paraform ile kapatın ve düşük hızda orbital sallayıcıda, dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, primer antikor çözeltisini önceden soğutulmuş P-B-S-F-T ile değiştirin.

Plakayı orbital sarsıcıya yerleştirerek agregatları yıkayın. Düşük hızda, dört santigrat derecede beş dakika boyunca ayarlayın. Yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.

Orbital sarsıcıda düşük hızda ve dört santigrat derecede P-B-S-F-T ile iki ek yıkama döngüsü gerçekleştirin. Metin protokolünde belirtildiği gibi, yıkama solüsyonunu uzaklaştırın ve P-B-S-F-T içinde seyreltilmiş 500 µL sekonder antikor ile inkübe edin. Çekirdekleri görselleştirmek için mililitre başına bir µg herst ekleyin ve ışıktan koruyarak dört santigrat derecede, jiro rotator üzerinde gece boyunca inkübe edin.

Folyo ile sarılmış bir kutu içerisinde, ışık koruması altında, dört derece santigrat sıcaklıkta PBS FT ile başka bir yıkama döngüsü gerçekleştirin. Oda sıcaklığında, %0,2 FBS ve %0,2 Triton X 100 içeren PBS veya PBT tamponu ile ek yıkamalar yapın. Çözeltiyi dikkatlice aspire ettikten sonra, agregatları bir mililitre bire bir gliserol-PBT karışımı ile oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edin.

Ardından, bunları 30 dakika boyunca bir mililitre %7:3 gliserol içeren PBT ile inkübe edin. Örnekleri konfokal görüntüleme için hazırlamak üzere, gliserol içeren PBT çözeltisini aspire edin ve yerine bir mililitre bağlama medyumu ekleyin. Daha sonra agregatları, bir lam üzerine 17 µL'lik damlacıklar halinde yerleştirin.

Bir pipet ucu kullanarak, çift taraflı bir bandı kendi üzerine dört kez katlayarak bir ara parça hazırlayın. Ardından, lam üzerindeki agregatların her iki yanına birer ara parça yerleştirin, kapatma camını ters çevirip ara parçaların üzerine kaydırın ve konfokal mikroskopi kullanarak agregatları görüntüleyin. Ekimden 48 saat sonra, düzgün sınırlara sahip, yaklaşık 150 µm çapında agregatlar oluşur.

Öte yandan, düşük besiyeri kalitesi, optimal olmayan hücre sayısı ekimi veya hücre adezyonu, düzgün agregasyon oluşmamasına neden olabilir. Bir glikojen sentaz kinaz üç inhibitörü olan CHI 9 9 0 2 1 ile 120 saatlik sürekli işlem, küresel agregatın uzamasına yol açar. Ayrıca, işlem sonrası agregatın bir ucunda SOX GFP pozitif hücrelerin belirgin bir lokalizasyonu görülür; farklı işlemler, tek bir agregatın morfolojisinde ve floresan işaretleyicisinde farklı morfolojik değişiklikler meydana getirir.

Agregat içindeki lokalizasyon zaman içinde takip edilebilir. Yöntem kavrandığında, araştırmacı, işlem uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık 45 dakika içinde agregatlar oluşturabilecektir. Agregatlar oluştuktan sonra, agregatlar içindeki gen ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için immün boyama yerine Q-R-T-P-C-R gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, MEC'lerden agregatlar oluşturmayı, spesifik stimülasyonlar uygulamayı ve agregatları immün boyama ile konfokal mikroskopi analizi için hazırlamayı iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.