2.2: Morpholinos ile Gen Susturma

Gen susturma teknikleri, gelişim biyolojisi alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Morfolino tabanlı yıkım yaklaşımları rutin olarak araştırmacıların önemli hücresel süreçlerde yer alan genleri hem tanımlamasına hem de karakterize etmesine izin verir. Antisense morfolinolar, yüksek etkinlikleri, yüksek özgüllükleri ve düşük maliyetleri nedeniyle fareler, civcivler ve zebra balığı dahil olmak üzere birçok model sistemde artık yaygın olarak popülerdir.

Bu video, morfolino mekanizmalarına ve mikroenjeksiyon stratejilerine, temel deneysel kontrollere ve morfolinoların günümüzde omurgalı gelişimini araştırmak için laboratuvarlarda nasıl kullanıldığına genel bir bakış sağlayacaktır.

Morfolinolar ilk olarak canlı hücrelerde ve organizmalarda RNA transkriptlerinin translasyonunu engellemenin bir yolu olarak geliştirildi. Genel olarak morfolinolar, nötr yüklü bir omurga ile birbirine bağlanan 25 oligonükleotidden oluşan sentetik moleküllerdir.

Ancak morfolinler DNA'ya çok benzeseler de, fosfat şekeri omurgasında bulunan şeker gruplarının yerine morfolin halkaları içerirler. Bu basit dönüşüm, hücrelerdeki morfolino stabilitesini arttırır ve üretim maliyetlerini düşürür.

Hücrelerin içinde, morfolinolar, tamamlayıcı baz eşleşmesi ile ilgilenilen RNA'ya hedeflenir. Morfolino'nun RNA üzerinde melezleştiği konum, onun spesifik etki mekanizmasını belirler.

Ekleme bloke edici morfolinolar belirli bağlantılara bağlanır ve uygun transkript işlemeyi inhibe ederken, translasyonu bloke edici morfolinolar, translasyonel başlangıç bölgesinin yakınındaki genin 5' çevrilmemiş bölgesine bağlanır ve ribozom montajını önler. Her iki morfolino türü de fonksiyonel hedef proteinlerin ekspresyonunu azaltır.

Morpholinos kullanarak bir deney planlarken, akılda tutulması gereken birkaç önemli husus vardır. Morpholinos birkaç model sisteminde kullanılabilir, bu nedenle eldeki biyolojik soruyu ele alabilecek bir model seçmek önemlidir.

Morfolinolar ticari olarak sentezlenir ve araştırmacılara ücretsiz olarak profesyonel tasarım yardımı sağlanır, ancak diziye özgü oldukları için, tüm spesifik morfolino hedefleri için gen bilgileri tasarımdan önce elde edilmelidir.

Zebra balığı model sisteminde, zebra balığının evrimsel bir atasında meydana gelen tüm genom duplikasyonu olayı nedeniyle, diğer omurgalılarda bulunan tek genlerin genellikle iki kopyası vardır. Bu nedenle, insan gelişimindeki protein eksikliklerini başarılı bir şekilde modellemek için her iki zebra balığı geninin de yıkılması gerekli olabilir.

İyi deneysel kontroller tasarlamak, hedeflediğiniz morfolinoları tasarlamak kadar önemlidir. Herhangi bir morfolino, farklı genler üzerindeki belirli dizilere bağlanabilir. Gözlenen bir fenotipik değişikliğin, ilgilendiğiniz genin yıkılmasından kaynaklandığından emin olmak için, aynı geni tamamlayan bağımsız, örtüşmeyen morfolinoların kullanılması tavsiye edilir.

Artık morfolino deneysel tasarımını ele aldığımıza göre, morfolinoların zebra balıklarına nasıl tanıtıldığına bir göz atalım.

Burada, zebra balığına morfolino mikroenjeksiyonunu anlatacağız. Mikroenjeksiyonun ayrıntıları hakkında daha fazla bilgi ve talimat için lütfen "Zebra Balığı Mikroenjeksiyon Teknikleri" başlıklı JoVE Bilim Eğitimi videosuna bakın.

Morfolinler tipik olarak zebra balığı embriyolarına bir ila dört hücreli aşama arasında, yumurta sarısı veya hücre sitoplazmasına enjekte edilir. Embriyonik hücreler arasındaki sitoplazmik bağlantılar, organizma boyunca suda çözünür morfolinoların hızlı difüzyonuna ve her yerde verilmesine izin verir. Zebra balığı embriyosu 28.5°C'de büyütüldüğü için morfolinolar hücrelerde stabildir.

Optimum enjeksiyon konsantrasyonları ve hacimleri her morfolino için ampirik olarak test edilmelidir. Tipik olarak, enjekte edilen embriyoların en az% 50-75'inde tanımlanmış güvenilir bir fenotipin bulunduğu en düşük doz, embriyonik ölümcüllüğü veya istenmeyen hedef dışı etkileri önlemek için kullanılır.

Çoğu morfolino zebra balığı fenotipi, döllenmeden sonraki ilk üç gün içinde tanımlanır ve gen susturma genellikle beşinci güne kadar etkilidir. Ekleme bloke edici morfolinolar söz konusu olduğunda, RT-PCR, doğal ve değiştirilmiş transkriptlerin nispi miktarlarını tanımlamak için kullanılabilir. Translasyonu bloke eden morfolinolar için, gen yıkım seviyeleri Western blot ile değerlendirilebilir.

Zebra balığı embriyolarının hızlı dış gelişimi ve şeffaflığı, birçok erken biyolojik sürecin kolayca gözlemlenmesini sağlar. Morfolino fenotipleri genellikle parlak alan veya floresan mikroskobu kullanılarak morfolojinin analiz edilmesinin yanı sıra davranışın değerlendirilmesiyle puanlanabilir.

Morfolino fenotipi tanımlandıktan sonra, hedef özgüllüğünü göstermek için RNA kurtarma işlemi gerçekleştirilebilir. Endojen mRNA'nın morfolino yıkımını takiben, aynı proteini kodlayan, ancak morfolino hedef dizisini içermeyen sentetik mRNA enjekte edilir. Eğer bu enjekte edilen RNA, organizmanın vahşi tip fenotipini eski haline getirebiliyorsa, o zaman gözlenen morfolino fenotipinin özellikle hedef genin yere serilmesinden kaynaklandığı sonucuna varabiliriz.

Artık morfolinoların ne olduğu ve kontrollü morfolino deneylerinin nasıl yapılabileceği hakkında bir fikriniz olduğuna göre, bugün morfolinoların biyolojik laboratuvarlarda nasıl uygulandığına bakalım.

Hücre biyolojisinde, morfolinolar erken gelişimsel süreçleri anlamak için kullanılır. Kupffer'in vezikülünde kirpikler tarafından oluşturulan sıvı akışı, zebra balıklarında sol-sağ desenlemeyi kontrol eden bir örnektir. Kontrol enjeksiyonu yapılan embriyolarda sıvı akışı saat yönünün tersine ilerlerken, siliyer hücre organizasyonunu düzenleyen bir genin susturulması sıvı hızını ve yönünü bozar.

Morfolinolar ayrıca insan genetik hastalıklarını hızlı ve güvenilir bir şekilde modellemek için çok uygundur. Fonksiyon kaybı fenotipleri, böbrek kistleri, perikardiyal ödem ve kıvrılmış bir kuyruk gösteren bir zebra balığı insan displazisi modelinde görüldüğü gibi, protein ekspresyonunu manipüle ederek kolayca çoğaltılabilir. Ek olarak, patojenik mutasyonlar, morfolino hastalığı fenotiplerini kurtarmak için vahşi tip veya mutant mRNA kullanılarak in vivo olarak hızlı bir şekilde test edilebilir.

Morfolinolar canlı hücrelere farklı şekillerde sokulabildiğinden, organ yenilenmesi ve gelişimi üzerinde oldukça değerlidirler. Mikroenjeksiyon ve ardından morfolinosların belirli dokulara elektriksel olarak uyarılması, araştırmacıların yetişkin zebra balıklarında yüzgeç büyümesini ve retina oluşumunu incelemelerine izin vermiştir.

Az önce JoVE'nin morfolinolarla gen susturma ile tanışmasını izlediniz. Bu videoda, morfolinoların yapısını ve mekanizmasını, yaygın kullanım uygulamalarını ve hedeflenen gen susturmanın etkinliğini ve etkilerini değerlendirmenin önemli yollarını tartıştık. Tasarımı kolay, son derece spesifik ve uygun maliyetli oldukları için, morfolinos, ters genetik alanında önemli bir oyuncu olmaya devam edecek ve hastalık ve gelişimde yer alan genleri işlevsel olarak analiz etmeye yardımcı olacaktır. İzlediğiniz için teşekkürler!