Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

Bu yeni florometrik ilaç tarama yönteminin genel amacı, ilaç yüklü protein şablonu içinde floresan altın nanokümeleri oluşturarak, küçük ilaç moleküllerinin bir hedef proteine bağlanma afinitesini belirlemektir. Bu yöntem, ilaç moleküllerinin bağlanma gücünün, proteinlerin açılmaya karşı stabilitesini nasıl etkilediği ve bunun sonucunda farklı yoğunluklarda floresan altın nanokümelerinin oluşumunu nasıl tetiklediği gibi, proteine hedefli ilaç keşifleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık cihazlara ve zahmetli etiketleme adımlarına gerek kalmadan, küçük moleküllü ilaçların hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için bir hedef proteini floresan bir biyosensöre dönüştürebilmemizdir.

Kendi bilgimin yanı sıra yardımcı yazarın keşiflerinin birleşimi, proteinin yüklenmesinin plazmonik üzerinde belirgin bir stabilizasyon etkisi olduğunu ortaya koymuştur. Bu yöntem için fikir, nanopartiküllerden alınmıştır. Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği üzere ilaç taraması için kimyasal reaktiflerin hazırlanmasıyla başlayın; insan serum albümini veya HSA şablonlu altın nano kümeleri hazırlamak için, her biri mikro manyetik karıştırma çubuğu içeren iki cam şişeyi iki ayrı sıcaklık kontrollü manyetik karıştırıcıya yerleştirin.

Bir manyetik karıştırıcının sıcaklığını 60 °C'ye ayarlayın. Ardından, altın iyonlarının protein şablonu içinde kapsüllenmesini sağlamak amacıyla, sabit karıştırma altında her bir viyale 200 µL insan serum albümin çözeltisi, 200 µL ultrapure su ve 200 µL altın klorür çözeltisi ekleyin; iki dakika sonra, altın nano kümeleri oluşturmak için insan serum albüminin indirgeme kapasitesini aktive etmek amacıyla her bir viyale 20 µL sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Reaksiyon süresini sıfırıncı dakikadan başlayarak her 20 dakikada bir kaydetmeye başlayın.

Her bir örnekten 50 µL çekin ve 384 kuyucuklu siyah bir plakaya aktarın. Emisyon spektrumunu bir mikroplaka okuyucu ile ölçün. 100 dakika sonra manyetik karıştırmayı durdurun.

Cam şişeleri bir lavaboda akan su altında soğutun. Farklı sıcaklık koşullarında altın nano kümelerin oluşum kinetiğini elde etmek için, her bir numune için fotoemisyon spektrumlarını sürekli olarak kaydedin. Sığır serum albümini veya BSA şablonlu altın nano kümeleri hazırlamak için, içinde mikro manyetik karıştırma çubuğu bulunan bir cam şişeyi manyetik karıştırıcının üzerine yerleştirin.

Sıcaklığı oda sıcaklığında bırakın. Cam viyol içerisinde sabit karıştırma altında 200 µL BSA çözeltisi, 200 µL üre ve 200 µL altın klorür çözeltisini karıştırın. İki dakika sonra 20 µL sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin.

BSA'nın altın nano kümeler oluşturma yönündeki indirgeme kapasitesini aktive etmek için reaksiyon süresini sıfır dakika olarak kaydetmeye başlayın. Reaksiyon karışımının foto emisyon spektrumunu saat başı ölçün. Her biri bir manyetik karıştırma çubuğu içeren ve üzerine bir ilaç veya saf HSA etiketi yapıştırılmış beş cam şişeyi, sıcaklık kontrollü çok noktalı manyetik karıştırıcının üzerine yerleştirin.

Her bir tüpe 200 µL HSA ekleyin. Ardından, önceden hazırlanmış her bir ilaç çözeltisinden bir µL'yi ilgili dört tüpe ekleyin. Ayrıca, kontrol grubu için karıştırıcı üzerindeki tüpe bir µL DMSO ekleyin.

Döndürme hızını 360 RPM olarak ayarlayın ve ilacın HSA'ya bağlanması için bir saat inkübe edin; bir saat sonra, sürekli karıştırma altında her tüpe 200 µL milli Q su ve 200 µL altın klorür çözeltisi ekleyin. Sürekli karıştırma altında sıcaklığı 60 °C'ye ayarlayın ve 10 dakika bekleyin. 10 dakika sonra, her tüpe 20 µL 1,5 M sodyum hidroksit ekleyin ve reaksiyon süresini sıfırıncı dakika olarak kaydetmeye başlayın.

Ölçüm için ortak reaksiyon çözeltileri, ilaç ekleme konusunda aynı sırayı takip etmeli ve zaman gecikmesi etkisini en aza indirmek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde uygulanmalıdır. Her flakondan hızla 50 µL çözelti çekin. Bunları 384 kuyucuklu siyah bir plakaya aktarın ve emisyon spektrumunu ölçün. Her örneğin emisyon spektrumunu her 10 dakikada bir kaydederek, dört farklı zamanda en az dört spektrum toplayın.

Tutarlı bir eğilime sahip sonuçlar elde etmek için bu adımları birkaç kez tekrarlayın. Her bir örnek için zamana bağlı fotoemisyon spektrumlarını çizin. Tüm örneklerin pik yoğunluğunu belirleyin ve farklı ilaç yüklü protein şablonlarında altın nano kümelerin oluşum kinetiğini karşılaştırmak ve her bir ilaç ile HSA arasındaki bağlanma sabitini ölçmek için bunları zamana karşı grafiğe dökün.

İlaç çözeltilerini dört farklı konsantrasyondaki ibuprofen çözeltileriyle değiştirin. 10 dakika sonra, cam şişeleri bir lavaboda akan su altında soğutun. Her şişeden yukarıdaki çözeltilerden 50 µL çekerek 384 kuyucuklu siyah bir plakaya aktarın ve emisyon spektrumunu ölçün.

Manyetik karıştırmayı durdurmadan önce, farklı ilaç konsantrasyonlarında iki set sonuç daha elde etmek için bu adımları iki kez daha tekrarlayın. Ardından, foto emisyon spektrumlarını çizin ve her bir bağımsız partide elde edilen ham sonuçları analiz edin. Her örneğin foto emisyon spektrumunu Origin Pro gibi bir yazılımda çizin ve pik yoğunluğunu belirleyin.

Bağıl floresans yoğunluğunu ilaç konsantrasyonuna karşı hesaplayın ve grafiğe dökün. Ardından, verileri tek bölge bağlanma modeline uydurarak bağlanma sabitini hesaplayın. Bunu yapmak için Origin Pro gibi bir yazılımda Mics cementin denklemini kullanın.

Menüden doğrusal olmayan eğri uydurma (non-linear curve fit) analizini seçin, ardından ayarlar fonksiyon seçimi sayfasındaki büyüme sigmoidal kategorisinden hail fonksiyonunu seçin. Görüntülemek için uydur (fit) düğmesine tıklayın. Burada gösterilen uydurma sonuçları, farklı protein denatürasyon koşullarında üretilen altın nano kümelerin zamana bağlı foto emisyon spektrumlarının temsili sonuçlarıdır.

Altın nano kümelerin daha yüksek sıcaklıkta daha hızlı oluştuğu gözlemlenebilir. Üre denatürasyon koşulları, şablon olarak BSA proteini kullanılarak altın nano kümelerin doğrudan sentezini de kolaylaştırabilir. Şablon olarak ilaç yüklü HSA kullanılarak altın nano kümelerin floresans yoğunluğuna dayalı hızlı florometrik ilaç taramasının tipik sonuçları burada gösterilmiştir.

Floresan yoğunluğu ne kadar yüksekse, bir ilaç molekülünün HSA'ya bağlanma gücü o kadar zayıftır. Bu spektrumlar, ibuprofen yüklü HSA içindeki floresan altın nanokümelerin oluşum hızı üzerinde ilaç yükleme konsantrasyonunun etkisini göstermektedir. İlaç konsantrasyonu ne kadar yüksekse, ortaya çıkan altın nanokümelerin floresan sinyali o kadar düşüktür; burada gösterilen, protein ilaç bağlanma sabitinin belirlenmesine yönelik temsili bir sonuçtur.

Çeşitli konsantrasyonlarda ibuprofen ilaçla önceden yüklenmiş HSA şablonunda sentezlenen altın nanokümelerin bağıl floresans yoğunluğu, MICUs cementin denklemi kullanılarak hesaplanır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde paralel çoklu ilaç taraması için 30 dakikada tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilaç yüklü protein içinde altın nanoküme sentezlemeyi ve ilaçların bir hedef proteine bağlanma afinitesini, sonuçta oluşan altın nanokümelerden yayılan floresan sinyali ile tespit etmeyi iyi derecede kavramış olmalısınız.