Name: Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Keşfedin, protein-hedefleme küçük molekül ilaç taraması için hızlı ve nicel florimetrik yöntemi. İlaç yüklü protein şablonunda floresan altın nanokümeleri sentezleyerek ilaç bağlanma afinitesini belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Y.N.T., JCO CDA hibesi 13302FG063 kapsamındaki mali destek için Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı'na (A*STAR) teşekkür eder.

Dikkat: Kullanmadan önce ilgili tüm kimyasalların güvenlik bilgi formları (SDS) danışın. Ilaç tarama deneyi kendi toplu meslektaşı ile karşılaştırıldığında ek tehlikeler olabilir nanomateryallerin sentezini ve taşıma kapsar. Emin olun, gerekli tüm kontrol önlemleri mühendislik kontrolleri (davlumbaz) ve kişisel koruyucu donanımlar (KKD, örneğin, emniyet uzunluğu pantolon, kapalı-toe ayakkabıları, kimyasala dayanıklı eldivenler ve emniyet gözlükleri) kullanımı da dahil olmak üzere, deney boyunca uygulanan edilecek. Uyuşturucu Tarama için Kimyasal Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> Au NC&#39;ler sentezi için öncüleri <ol><li> Altın (III) klorür çözeltisi 15 mM hazırlamak için ultra saf su 6,9 ml altın (III) klorür çözeltisi (% 99.99 zerre metaller temelinde, seyreltik HCI içinde 30 wt.%), 30 mg eritin. Dikkat: altın klorür solüsyonu aşındırıcı ve tahriş edicidir. Göz ve deri ile doğrudan teması engellemek için uygun KKE giyin. </li><li> Diultra saf su 1 ml HSA veya BSA&#39;nın ssolve 74 mg, 74 mg / protein stok çözeltisi ml hazırlamak. </li></ol></li><li> İlaç solüsyonları <ol><li> İstenilen ilaç miktarını, örneğin, (a) ibuprofen 1.9 mg, (b) warfarin 2,8 mg, (c) fenitoin 2.3 mg ve 450 mM hazırlamak için 20 ul DMSO (d) sülfanilamid 1.5 mg çözülür İlaç stoku çözümleri. Not: Bu ilaçlar, hidrofobik ve suda zayıf çözünürlüğe sahip olan, çünkü DMSO çözücüsü olarak seçilir. </li></ol></li><li> Diğer reaktifler <ol><li> NaOH çözeltisinin 1.5 M hazırlamak için ultra saf su 10 ml NaOH peleti 600 mg çözülür. Üre çözeltisi 20 M hazırlamak için ultra saf su, 2 ml üre 2.4 g çözündürülür. </li></ol></li></ol> Protein-Templated Au NC&#39;ler 2. sentezi <ol><li> HSA şablonu Au NC&#39;ler (HSA Au NC&#39;ler) <ol><li> İki ayrı sıcaklık kontrollü manyetik karıştırma ile iki cam şişeleri, içinde bir mikro manyetik karıştırma çubuğuna sahip, her biri koyunaradaki. </li><li> 60 ° C&#39;ye kadar bir manyetik karıştırıcı sıcaklığını ayarlamak ve &quot;60 ° C&quot; olarak bunun üstüne bir cam şişe etiket; Diğer manyetik karıştırıcı bunun üstüne cam şişe &quot;RT&quot; olarak etiketlenir, oda sıcaklığında (RT) tutulurken. </li><li> Protein şablon içinde Au iyonlarının kapsülleme izin vermek için HSA çözeltisi 200 ul ultra-saf su 200 ul ve (aksi belirtilmediği sürece 360 ​​rpm olarak ayarlanır) sabit karıştırma altında, her şişeye altın (III) klorür çözeltisi 200 ul ekle. </li><li> Au NCS oluşturulmasında HSA indirgeme yeteneği etkinleştirmek ve 0 dakika reaksiyon süresi kayıt başlamak üzere 2 dakika sonra, her şişeye NaOH çözeltisi 20 ul ekle. </li><li> Her 20 dakika, 384 oyuklu siyah plaka numunesinin her birinden çözeltilerinin 50 ul çeker ve bir mikro levha okuyucusu ile emisyon spektrumu ölçmek. Tipik tarama ayarları: - 850 nm λ ex = 370 nm, λ em 410 =. </li><li> 100 dakika sonra, manyetik karıştırıcı durdurun. </li><li> Bir lavaboya akan su altında cam şişeleri serinleyin. Dikkat: cam şişe sıcak. Yanmasını önlemek için ısıya dayanıklı eldiven giyin. </li><li> Her bir numune farklı sıcaklık koşullarında Au NC&#39;ler oluşum kinetiği elde etmek için her zaman fotoemisyon spektrumları çizilir. </li></ol></li><li> BSA-şablonu Au NC&#39;ler (BSA-Au NC&#39;ler) <ol><li> Bir manyetik karıştırıcı üzerine mikro manyetik karıştırma çubuğu içeren bir cam şişe yerleştirin. Oda sıcaklığında sıcaklığına bırakın. </li><li> BSA çözeltisi 200 ul, üre 200 ul ve sabit karıştırma altında bir cam şişe içinde, altın (III) klorür çözeltisi 200 ul karıştırın. </li><li> 2 dakika sonra, Au NCS oluşturmak için BSA azaltarak yeteneği etkinleştirmek ve 0 dk reaksiyon zamanını kaydetmek başlamak için NaOH solüsyonu 20 ul ekleyin. Saatlik reaksiyon karışımının fotoemisyon spektrumunu ölçün. Not: BSA-Au NCS fotoemisyon tayfı ölçülürdaha az BSA-Au NC&#39;ler oluşumu oranı nedeniyle ürenin daha az etkinlik, aynı sıcaklıkta, HSA Au daha yavaş olduğu için protein açığa. </li><li> 7 saat sonra, manyetik karıştırıcı durdurun. Üre denatürasyonu Au NC&#39;ler oluşum kinetiği görmek için her zaman en fotoemisyon spektrumları çizilir. </li></ol></li></ol> 3. Küçük Moleküler Uyuşturucu Madde Tarama <ol><li> HSA farklı küçük molekül ilaç ekran nispi bağlanma afinitesi <ol><li> Beş cam şişeye, bir sıcaklık kontrol çoklu manyetik karıştırıcı üzerine içinde manyetik karıştırma çubuğu ile, içeren her yerleştirin. A, b, c, bu şişeleri etiketleyin ve her bir ilaç, yani ibuprofen, warfarin, fenitoin ve sülfanilamid sırasıyla d. Kontrol olarak saf HSA ile bir etiketleyin. </li><li> Her şişeye HSA 200 ul ekle. Dört uygun şişelere ilaç çözeltisi 1 ul ekleyin. Kontrol DMSO 1 ul ekle. Karıştırıcı açın ve 360 ​​spin hızını ayarlamakrpm ve HSA bağlanma ilaç tamamlanmasına izin vermek için 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> 1 saat sonra, Milli-Q su içinde 200 ul ve sabit karıştırma altında, her şişeye altın (III) klorür çözeltisi 200 ul ilave edin. 10 dakika boyunca sabit karıştırma altında 60 ° C&#39;ye kadar sıcaklık ayarlayın. Her flakon 1.5 M NaOH 20 ul ekleyin ve 0 dk reaksiyon zamanını kaydetmek başlar. </li><li> Hızlı bir şekilde emisyon spektrumunu (sonuçlar 0 dakika olarak işaretlenmiş), bir 384-kuyucuklu siyah levha, her bir şişeden çözeltisi 50 ul çeker ve ölçün. Her bir örnek, her 10 dakika emisyon spektrumunu kaydetme. Dört farklı bir zamanda en az dört spektrumları toplamak, yani 0, 10, 20, ve 30 dk. </li><li> Tutarlı bir trend ile sonuçları elde etmek için 3.1.4 birkaç kez - Tekrar 3.1.1 adımlar. Manyetik karıştırıcı durdurun. </li><li> (- D, ve kontrol: a) her bir numune için zamana bağımlı fotoemisyon spektrumları çizilir. Di Au NC&#39;ler oluşum kinetiği karşılaştırmak için zamana karşı tüm numunelerin ve arsa zirve yoğunluğunu tespitfferent ilaç yüklü protein şablonları. </li></ol></li><li> HSA belirli bir ilacın bağlanması sabit ölçün <ol><li> 3.1.4 - yineleyin 3.1.1 adımlar. (Sadece ilaç yüklemesi olmadan HSA kullanılarak bir kontrol numunesi de dahil olmak üzere), dört farklı konsantrasyonda ibuprofen çözümlerle ilaç çözeltisi değiştirin. Buna ilaç konsantrasyonu göre cam şişe etiketleyin. </li><li> 10 dakika sonra, bir lavabo akan suyun altında cam şişeleri soğumasını. Dikkat: cam şişe sıcak. Yanmasını önlemek için ısıya dayanıklı eldiven giyin. </li><li> Bir 384-kuyucuklu siyah plaka her şişeye yukarıdaki çözeltilerin 50 ul çizin ve emisyon spektrumunu ölçmek. </li><li> Farklı ilaç konsantrasyonlarında sonuçların başka iki takım edinme 3.2.3 kez daha - Tekrar 3.2.1 adımlar. </li><li> Manyetik karıştırıcı durdurun. Fotoemisyon spektrumları arsa ve sonuçlarını analiz. <ol><li> Her parti elde edilen ham veriler için her fotoemisyon spektrumları arsaYazılımın örnek gibi OriginPro yazılımı gibi ve pik yoğunluğunu bulmak. </li><li> Göreceli floresan hesaplayın ve arsa [(I 0 - I) / I 0] I ve ben sırasıyla ilaç yüklü HSA ve saf HSA oluşan Au NC&#39;ler floresan yoğunluğu başvurmak 0 ilaç konsantrasyonu, karşı. </li><li> Michaelis-Menten denklemi kullanılarak tek bir site bağlanma modeline uyan verilerin bağlama sabiti hesaplanır: R max en yüksek yanıt sinyalini gösterir C / (Kd + C) x Y = R max, Cı ligandın konsantrasyonudur ve K, D bağlama sabitidir. Böyle OriginPro olarak yazılımda bu gerçekleştirin. Doğrusal Olmayan Eğri Fit takılması menü Analizi seçin, ardından Büyüme / Sigmoidal kategoriden Tepesi fonksiyonu seçin. Ayarlar: Fonksiyon Seçimi sayfasında, gömme sonuçlarını göstermek için Fit tıklayın. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Solution-Based+Medicinal+Library+Screening+against+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin.</a> Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).</li>
<li>Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Analytical+Strategy+to+Measure+Drug%E2%80%93Plasma+Protein+Interactions%3A+From+High-Throughput+to+In-Depth+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Toda%22%5BJournal%5D)">Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis.</a> Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).</li>
<li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdomain+Ib+Is+The+Third+Major+Drug+Binding+Region+of+Human+Serum+Albumin%3A+Toward+The+Three-Sites+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model.</a> Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).</li>
<li>Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorine-NMR+Experiments+for+High-Throughput+Screening%3A+Theoretical+Aspects%2C+Practical+Considerations%2C+and+Range+of+Applicability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).</li>
<li>Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).</li>
<li>Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Design+of+Diflunisal+Analogues+with+Reduced+Affinity+for+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin.</a> J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).</li>
<li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+NMR-Based+Screening+with+Competition+Binding+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).</li>
<li>Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correspondence+of+Fatty+Acid+and+Drug+Binding+Sites+on+Human+Serum+Albumin%3A+A+Two-Dimensional+Nuclear+Magnetic+Resonance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistr%22%5BJournal%5D)">Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study.</a> Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).</li>
<li>Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+of+Hyperpolarized+Fluorine+for+Characterization+of+Protein%E2%80%93Ligand+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).</li>
<li>Salvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+the+Sensitivity+of+Ligand%E2%80%93Protein+Screening+by+NMR+of+Long-Lived+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).</li>
<li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+Dichroism+Spectroscopic+Detection+of+Ligand+Binding+Induced+Subdomain+IB+Specific+Structural+Adjustment+of+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).</li>
<li>Navratilova, I., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment+Screening+by+Surface+Plasmon+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance.</a> ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Phase+SPR+Biosensor+for+Efficient+Targeted+Drug+Screening+with+High+Sensitivity+and+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Che%22%5BJournal%5D)">Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability.</a> Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).</li>
<li>Lu, Y., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-Nanometre+Sized+Metal+Clusters%3A+From+Synthetic+Challenges+to+The+Unique+Property+Discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).</li>
<li>Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor+Engineering+and+Controlled+Conversion+for+The+Synthesis+of+Monodisperse+Thiolate-Protected+Metal+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters.</a> Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).</li>
<li>Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Sized%2C+Thiolate-Protected+Gold+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters.</a> Nanoscal. 2, 343-362 (2010).</li>
<li>Jiang, D. -e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Expanding+Universe+of+Thiolated+Gold+Nanoclusters+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond.</a> Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).</li>
<li>Aikens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+Structure+of+Ligand-Passivated+Gold+and+Silver+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters.</a> J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).</li>
<li>Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+Activities+of+Subnanometer+Gold+Clusters+%28Au16%E2%80%93Au18%2C+Au20%2C+and+Au27%E2%80%93Au35%29+for+CO+Oxidation.+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS.</a> ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).</li>
<li>Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-Protected+Gold+Clusters+Revisited%3A+Bridging+the+Gap+between+Gold%28I%29%E2%88%92Thiolate+Complexes+and+Thiolate-Protected+Gold+Nanocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).</li>
<li>Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+the+Crystal+Structure+of+A+Thiol-Protected+Au25+Cluster+and+Optical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Highly+Luminescent+Au22%28SG%2918+Nanocluster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster.</a> J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+at+the+Core%E2%80%93Ligand+Interface+of+Au+Lipoic+Acid+Nanoclusters+That+Enhances+the+Near-IR+Luminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence.</a> J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).</li>
<li>Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atomic-Level+Strategy+for+Unraveling+Gold+Nanocatalysis+from+the+Perspective+of+Aun%28SR%29m+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters.</a> Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).</li>
<li>Niesen, B., Rand, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+Film+Metal+Nanocluster+Light-Emitting+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices.</a> Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).</li>
<li>Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-Small+Fluorescent+Metal+Nanoclusters%3A+Synthesis+and+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Toda%22%5BJournal%5D)">Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications.</a> Nano Toda. 6, 401-418 (2011).</li>
<li>Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasmall+Near-Infrared+Gold+Nanoclusters+for+Tumor+Fluorescence+Imaging+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo.</a> Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).</li>
<li>Archana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-Receptor-Specific%2C+Non-Toxic%2C+Near-Infrared-Emitting+Au+Cluster-Protein+Nanoconjugates+for+Targeted+Cancer+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnolog%22%5BJournal%5D)">Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging.</a> Nanotechnolog. 21, 055103(2010).</li>
<li>Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Synthesis+of+BSA-Protected+Small+Gold+Nanoclusters+and+Their+Fluorescence-Enhanced+Sensing+of+Silver%28I%29+Ions%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions.</a> Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).</li>
<li>Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanocluster+Based+Fluorescent+Sensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Cyanide+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water.</a> 20, 951-1907 (2010).</li>
<li>Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+Tumor+Targeting+of+Renal-Clearable+Luminescent+Gold+Nanoparticles%3A+Long+Tumor+Retention+and+Fast+Normal+Tissue+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).</li>
<li>Negishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Loading+of+Small+Aun+Clusters+%28n+%3D+10%E2%80%9339%29+onto+BaLa4Ti4O15+Photocatalysts%3A+Toward+an+Understanding+of+Size+Effect+of+Co-Catalyst+on+Water+Splitting+Photocatalytic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity.</a> J. Phys. Chem. C. , (2015).</li>
<li>Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Directed+Synthesis+of+Highly+Fluorescent+Gold+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).</li>
<li>Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Stability+Induced+by+Ligand+Binding+Correlates+with+Changes+in+Protein+Flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility.</a> Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Analysis+of+Ligand-Induced+Changes+in+Protein+Thermal+Unfolding+Applied+to+High-Throughput+Determination+of+Ligand+Affinities+with+Extrinsic+Fluorescent+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistr%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes.</a> Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).</li>
<li>Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Based+Fluorescent+Metal+Nanoclusters+for+Small+Molecular+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening.</a> Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).</li>
<li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nuclear+Magnetic+Resonance+Affinity+Screening+Methods+for+Functional+Annotation+of+Proteins+and+Drug+Discover%22">Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover</a>. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yöntemde vurgulanan gereken birkaç kritik adımlar vardır. Farklı küçük molekül ilaçların göreceli bağlanma afinitesi tarama protokolü Adımlar 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 ve nispi bağlanma gücü için tutarlı eğilimi gösteren iyi sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu adımlarda, ölçüm için reaksiyon çözümleri ekleyerek kimyasallar ve çizim eylemleri gecikme etkisi ve tutarlılığı sağlamak için uygulanmalıdır ölçümü için reaksiyon çözümleri ekleyerek kimyasallar ve çizim aynı sırasını en aza indirmek için mümkün olduğ...

Insan serum albümini (HSA) ve sığır serum albümini (BSA) gibi serum albüminler, plazmada en fazla protein vardır ve kan bölmesi osmotik basıncının sağlanmasında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca, steroidler gibi, suda düşük çözünürlüklü, küçük moleküller, yağ asitleri, tiroid hormonları ve ilaçlar çok çeşitli taşıyıcı proteinler olarak kabul edilmektedir. Bağlama özelliği albüminler serum, bu moleküllerin (örneğin, afinite ya da bağlanma kuvvetinin, bağlanma yerleri) farmakokinetik önemli bir konu teşkil etmektedir. 1-4 Çeşitli analitik yöntemler gibi albüminler serum farklı ilaçların bağlanma özelliklerini incelemek için geliştirilmiştir X-ışını kristalografisi, 5,6 nükleer manyetik rezonans (NMR), 7-11 ve yüzey plazmon rezonans (SPR), 12,13 vs. Bununla birlikte, bu yöntemler, bir sıkıcı ve zaman alıcı bir analiz işlemi (ya da tarafından kısıtlanır, örneğin, X-ışını Crystallo tek kristal büyümeGrafik çalışması), özel ve pahalı ekipman gerekliliği (SPR), veya tespiti için pahalı izotop etiketleme (NMR) muhtaç. Bu, hızlı bir düz ileri ve maliyet-etkin bir şekilde, küçük molekül ilaç taraması için alternatif yollar oluşturmak çok arzu edilen bir durumdur. Altın nanokümeler (Au ​​NC&#39;ler), nedeniyle ayrık ve boyut bağımlı elektronik yapıya, 18 Onlar kapsamlı araştırma alanları çekmiştir 2 nm. 14-17 daha küçük boyutları ile metal atomları onlarca birkaç ihtiva nanomaterial özel bir tip vardır 20-23 Bu özel malzeme özellikleri, özellikle de güçlü bir floresan gibi biyolojik sistemlerde algılama ve görüntüleme. 24-32 ultrasmall floresan Au NC&#39;ler işlevsel proteinleri kullanılarak sentezlenebilir gibi çeşitli uygulama alanı bulmaktadır. 19 ve moleküler benzeri bir emişe ve emisyon, Böyle bir şablon olarak serum albüminleri olarak. 33 tipik bir protein şablonu sentezinde<html> Au NC&#39;ler Au tuzları bir miktar birinci protein sarmalanır ve daha sonra proteinin kendisinin azaltılır. Protein indirgeme yeteneği alkalin çözüm artan pH ile aktive edilebilir fonksiyonel amino asit kalıntılarını (örneğin, tirosin) oluşturucu atfedilir. Protein yapısının Unfolding Au NC&#39;ler oluşumu için kritik bir aşama olarak kabul edilir. Katlanmamış protein, daha fazla indirgeyici fonksiyonel gruplar kapsüllenmiş Au tuzları maruz olmasıdır. Protein denatüre edici maddelere karşı, ısı tedavisi veya maruz kalma ile elde edilebilir açılma. Küçük molekül ilaçların tanıtımı da orta denatürasyon sıcaklığı ve açılımı entalpilerini değiştirerek yani açılımı sürecini etkileyebilir. 34,35 Tüm bu faktörlerin etkisi, sırayla floresan Au NC&#39;ler oluşum kinetiği ile yansıtılabilir ve tecelli Elde edilen Au NC&#39;ler floresans yoğunluğu. 36 e_content &quot;&gt; Bu video daha yüksek bir sıcaklığa (60 ° C) &#39;de ilaç yüklü albümin proteinleri Au NCS sentezlenmesiyle, doğallık bozucu maddeler (örneğin, ürea) elde edilen Au NCS. floresan yoğunluğunun varlığında ilaç taraması yöntemini göstermektedir sinyal değerini göstermektedir. Birincisi, Au, Au NC&#39;ler NC&#39;ler. İkinci oluşumu kinetiklerini proteini (ısı işlemi veya denatüranlar ile yol açılan) açılma göstermek için 60 ° C ya da üre mevcudiyetinde muamele HSA ve BSA şablonlarında sentezlenir, Au NC&#39;ler farklı ilaçlar ile önceden yüklenmiş bir protein şablonları sentezlenir, ve elde edilen Au NC&#39;ler nispi floresan yoğunlukları ile ilaç yüklemesi etkisi nispi bağlanma mukavemeti ölçüsü sağlayan, incelenmiştir. Sonuç olarak, Au NC-ilaç tarama programı için değiştirilir sabit bir konsantrasyon protein yüklenmiş ilaç içeriğini değiştirerek, ilaç-protein bağlayıcı sabiti (KD) kantitatif ölçümü.

<table><tbody><tr><td>Altın (III) klorür çözeltisi, %30</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>484385</td><td>Aşındırıcı, tahriş edici</td></tr><tr><td>İnsan serum albümini, %96</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1887</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum albümini, %96</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>İbuprofen, %98</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I4883&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>warfarin, %98</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2250</td><td></td></tr><tr><td>fenitoin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1139</td><td></td></tr><tr><td>sülfanilamid, %99</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>221465</tr><tr><td>Manyetik karıştırıcı</td><td>IKA</td><td>RT5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml hava deplasmanlı pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; l hava deplasmanlı pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 & # 956; l hava deplasmanlı pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.000 & # 956; l Eppendorf ipuçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &# 956; l Eppendorf ipuçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 & # 956; l Eppendorf uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml mikro tüp</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml vidalı kapaklı</td><td></td><td></td><td></td>cam şişe</tr><tr><td>4 ml vidalı kapaklı</td><td></td><td></td><td></td> cam şişe</tr></tbody></table>

protein-hedefleme küçük molekül İlaç tarama için hızlı ve nicel florimetrik yöntemi

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Biz Au NC&#39;ler tarafından yayılan farklı flüoresans sinyaline dayalı ilaç yüklü protein içinde flüoresan altın nanoyığınlar (Au NCS) oluşturan bir hedef proteine, küçük ilaç moleküllerinin bağlanma afinitesini belirlemek için yeni bir ilaç tarama yöntemi göstermektedir. Insan serum albümini (HSA) ve sığır serum albümini (BSA) gibi albümin proteinleri modeli proteinler olarak seçilir. Dört adet küçük molekül ilaç albümin proteinleri, farklı bağlanma afiniteleri (ör ibuprofen, varfarin, fenitoin ve sülfanilamid) test edilir. Bu denatüre edici koşullar (örneğin, 60 ° C veya üre varlığında) altındaki ilaç yüklü albumin protein içindeki fluoresan Au NC&#39;ler oluşumu oranı (ilaç olmadan) bozulmamış proteininde oluşmuş daha yavaş olduğu bulunmuştur. Dahası, şekillendirilmiş NC&#39;ler floresan yoğunluğu ile ters albümin proteinleri bu ilaçların bağlanma ilgisi ilişkili olduğu bulunmuştur. Özel olarak,Au NC&#39;ler oluşum hızı daha yavaş ilaç-protein bağlanma afinitesi daha yüksektir ve bu şekilde elde edilen Au NC&#39;ler daha düşük bir floresans yoğunluğu görülmektedir. Elde edilen Au NC&#39;ler floresan yoğunluğu dolayısıyla test farklı ilaçların göreceli bağlanma gücü basit bir ölçümünü sağlar. Bu yöntem aynı zamanda, sadece sabit bir protein konsantrasyonunda protein yüklenmiş ilaç içeriğini değiştirerek spesifik ilaç-protein bağlayıcı sabiti (KD) ölçmek üzere genişletilebilir. Ölçülen sonuçlar, diğer itibar ama daha karmaşık yöntemler kullanılarak elde edilen değerlerle iyi uyum sağlar.

Bir proteinin fazla reaktif fonksiyonel gruplar (örneğin, tirosin kalıntıları) kapsüllenmiş Au iyonları azaltmak ve böylece Au NC&#39;ler oluşumu oranını hızlandırmak için maruz çünkü açılma protein, protein-şablonu Au NC&#39;ler oluşumu için önemli bir işlemdir. Isıtma ve dış denatüre maddeleri protein açılımı sürecini teşvik için iki ortak araçlardır. 1 model protein olarak HSA kullanarak, Au NC&#39;ler oluşum kinetiği üzerinde ısıtma etkisi ve ekleme dış denatüre ajanları gösteriyor ...

İlaç yüklü proteini şablon olarak kullanan ultra küçük floresan altın nanokümelerinin (Au NC'ler) yerinde sentezine dayanan küçük moleküler ilaç taraması için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, protein şablonlu Au NC'lerden yayılan görünür bir floresan sinyali ile ilaçların bir hedef proteine bağlanma afinitesini belirlemek için basittir.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Bu yeni florometrik ilaç tarama yönteminin genel amacı, ilaç yüklü protein şablonu içinde floresan altın nanokümeleri oluşturarak, küçük ilaç moleküllerinin bir hedef proteine bağlanma afinitesini belirlemektir. Bu yöntem, ilaç moleküllerinin bağlanma gücünün, proteinlerin açılmaya karşı stabilitesini nasıl etkilediği ve bunun sonucunda farklı yoğunluklarda floresan altın nanokümelerinin oluşumunu nasıl tetiklediği gibi, proteine hedefli ilaç keşifleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık cihazlara ve zahmetli etiketleme adımlarına gerek kalmadan, küçük moleküllü ilaçların hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için bir hedef proteini floresan bir biyosensöre dönüştürebilmemizdir.Kendi bilgimin yanı sıra yardımcı yazarın keşiflerinin birleşimi, proteinin yüklenmesinin plazmonik üzerinde belirgin bir stabilizasyon etkisi olduğunu ortaya koymuştur. Bu yöntem için fikir, nanopartiküllerden alınmıştır. Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği üzere ilaç taraması için kimyasal reaktiflerin hazırlanmasıyla başlayın; insan serum albümini veya HSA şablonlu altın nano kümeleri hazırlamak için, her biri mikro manyetik karıştırma çubuğu içeren iki cam şişeyi iki ayrı sıcaklık kontrollü manyetik karıştırıcıya yerleştirin.Bir manyetik karıştırıcının sıcaklığını 60 °C'ye ayarlayın. Ardından, altın iyonlarının protein şablonu içinde kapsüllenmesini sağlamak amacıyla, sabit karıştırma altında her bir viyale 200 µL insan serum albümin çözeltisi, 200 µL ultrapure su ve 200 µL altın klorür çözeltisi ekleyin; iki dakika sonra, altın nano kümeleri oluşturmak için insan serum albüminin indirgeme kapasitesini aktive etmek amacıyla her bir viyale 20 µL sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Reaksiyon süresini sıfırıncı dakikadan başlayarak her 20 dakikada bir kaydetmeye başlayın.Her bir örnekten 50 µL çekin ve 384 kuyucuklu siyah bir plakaya aktarın. Emisyon spektrumunu bir mikroplaka okuyucu ile ölçün. 100 dakika sonra manyetik karıştırmayı durdurun.Cam şişeleri bir lavaboda akan su altında soğutun. Farklı sıcaklık koşullarında altın nano kümelerin oluşum kinetiğini elde etmek için, her bir numune için fotoemisyon spektrumlarını sürekli olarak kaydedin. Sığır serum albümini veya BSA şablonlu altın nano kümeleri hazırlamak için, içinde mikro manyetik karıştırma çubuğu bulunan bir cam şişeyi manyetik karıştırıcının üzerine yerleştirin.Sıcaklığı oda sıcaklığında bırakın. Cam viyol içerisinde sabit karıştırma altında 200 µL BSA çözeltisi, 200 µL üre ve 200 µL altın klorür çözeltisini karıştırın. İki dakika sonra 20 µL sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin.BSA'nın altın nano kümeler oluşturma yönündeki indirgeme kapasitesini aktive etmek için reaksiyon süresini sıfır dakika olarak kaydetmeye başlayın. Reaksiyon karışımının foto emisyon spektrumunu saat başı ölçün. Her biri bir manyetik karıştırma çubuğu içeren ve üzerine bir ilaç veya saf HSA etiketi yapıştırılmış beş cam şişeyi, sıcaklık kontrollü çok noktalı manyetik karıştırıcının üzerine yerleştirin.Her bir tüpe 200 µL HSA ekleyin. Ardından, önceden hazırlanmış her bir ilaç çözeltisinden bir µL'yi ilgili dört tüpe ekleyin. Ayrıca, kontrol grubu için karıştırıcı üzerindeki tüpe bir µL DMSO ekleyin.Döndürme hızını 360 RPM olarak ayarlayın ve ilacın HSA'ya bağlanması için bir saat inkübe edin; bir saat sonra, sürekli karıştırma altında her tüpe 200 µL milli Q su ve 200 µL altın klorür çözeltisi ekleyin. Sürekli karıştırma altında sıcaklığı 60 °C'ye ayarlayın ve 10 dakika bekleyin. 10 dakika sonra, her tüpe 20 µL 1,5 M sodyum hidroksit ekleyin ve reaksiyon süresini sıfırıncı dakika olarak kaydetmeye başlayın.Ölçüm için ortak reaksiyon çözeltileri, ilaç ekleme konusunda aynı sırayı takip etmeli ve zaman gecikmesi etkisini en aza indirmek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde uygulanmalıdır. Her flakondan hızla 50 µL çözelti çekin. Bunları 384 kuyucuklu siyah bir plakaya aktarın ve emisyon spektrumunu ölçün. Her örneğin emisyon spektrumunu her 10 dakikada bir kaydederek, dört farklı zamanda en az dört spektrum toplayın.Tutarlı bir eğilime sahip sonuçlar elde etmek için bu adımları birkaç kez tekrarlayın. Her bir örnek için zamana bağlı fotoemisyon spektrumlarını çizin. Tüm örneklerin pik yoğunluğunu belirleyin ve farklı ilaç yüklü protein şablonlarında altın nano kümelerin oluşum kinetiğini karşılaştırmak ve her bir ilaç ile HSA arasındaki bağlanma sabitini ölçmek için bunları zamana karşı grafiğe dökün.İlaç çözeltilerini dört farklı konsantrasyondaki ibuprofen çözeltileriyle değiştirin. 10 dakika sonra, cam şişeleri bir lavaboda akan su altında soğutun. Her şişeden yukarıdaki çözeltilerden 50 µL çekerek 384 kuyucuklu siyah bir plakaya aktarın ve emisyon spektrumunu ölçün.Manyetik karıştırmayı durdurmadan önce, farklı ilaç konsantrasyonlarında iki set sonuç daha elde etmek için bu adımları iki kez daha tekrarlayın. Ardından, foto emisyon spektrumlarını çizin ve her bir bağımsız partide elde edilen ham sonuçları analiz edin. Her örneğin foto emisyon spektrumunu Origin Pro gibi bir yazılımda çizin ve pik yoğunluğunu belirleyin.Bağıl floresans yoğunluğunu ilaç konsantrasyonuna karşı hesaplayın ve grafiğe dökün. Ardından, verileri tek bölge bağlanma modeline uydurarak bağlanma sabitini hesaplayın. Bunu yapmak için Origin Pro gibi bir yazılımda Mics cementin denklemini kullanın.Menüden doğrusal olmayan eğri uydurma (non-linear curve fit) analizini seçin, ardından ayarlar fonksiyon seçimi sayfasındaki büyüme sigmoidal kategorisinden hail fonksiyonunu seçin. Görüntülemek için uydur (fit) düğmesine tıklayın. Burada gösterilen uydurma sonuçları, farklı protein denatürasyon koşullarında üretilen altın nano kümelerin zamana bağlı foto emisyon spektrumlarının temsili sonuçlarıdır.Altın nano kümelerin daha yüksek sıcaklıkta daha hızlı oluştuğu gözlemlenebilir. Üre denatürasyon koşulları, şablon olarak BSA proteini kullanılarak altın nano kümelerin doğrudan sentezini de kolaylaştırabilir. Şablon olarak ilaç yüklü HSA kullanılarak altın nano kümelerin floresans yoğunluğuna dayalı hızlı florometrik ilaç taramasının tipik sonuçları burada gösterilmiştir.Floresan yoğunluğu ne kadar yüksekse, bir ilaç molekülünün HSA'ya bağlanma gücü o kadar zayıftır. Bu spektrumlar, ibuprofen yüklü HSA içindeki floresan altın nanokümelerin oluşum hızı üzerinde ilaç yükleme konsantrasyonunun etkisini göstermektedir. İlaç konsantrasyonu ne kadar yüksekse, ortaya çıkan altın nanokümelerin floresan sinyali o kadar düşüktür; burada gösterilen, protein ilaç bağlanma sabitinin belirlenmesine yönelik temsili bir sonuçtur.Çeşitli konsantrasyonlarda ibuprofen ilaçla önceden yüklenmiş HSA şablonunda sentezlenen altın nanokümelerin bağıl floresans yoğunluğu, MICUs cementin denklemi kullanılarak hesaplanır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde paralel çoklu ilaç taraması için 30 dakikada tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilaç yüklü protein içinde altın nanoküme sentezlemeyi ve ilaçların bir hedef proteine bağlanma afinitesini, sonuçta oluşan altın nanokümelerden yayılan floresan sinyali ile tespit etmeyi iyi derecede kavramış olmalısınız.

a-rapid-quantitative-fluorimetric-method-for-protein-targeting-small

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, florofor etiketli Shwachman-elmas sendromu (SBDS) proteini ile uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimleri incelemek için floresan anizotropi tekniğini açıklıyoruz. SBDS proteinlerinin kademeli olarak artan EFL1 konsantrasyonları ile inkübe edilmesinde, iki protein arasında başarılı bir etkileşime işaret eden anizotropide sabit bir artış gözlenir.

Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini geliştirdik. Etkileşimler iki eğriye çizilebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini örnek bir vaka olarak kullandık.

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Hedef proteinin erime sıcaklığındaki değişiklikleri izlemek(yani,termal kayma tahlili, TSA), birkaç yüz bileşik parça kütüphanelerini taramak için etkili bir yöntemdir. İç triptofan floresanını ve parça taraması için hafif geri saçılmaları izlemek için robotik destekli nano-Diferansiyel Tarama Florüreti (nano-DSF) uygulayan bir TSA protokolü sunuyoruz.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Bu protokol, aşağı akış fonksiyonel ve yapısal analizi için kalitelerini değerlendirmek üzere membran proteinleri üzerinde floresan boyut dışlama kromatografisi (FSEC) gerçekleştirmeye yönelik bir prosedürü açıklamaktadır. Deterjanda çözünür ve deterjansız koşullar altında çeşitli G-protein kuplajlı reseptörler (GPCR'ler) için toplanan temsili FSEC sonuçları sunulmuştur.

Floresan Boyut Dışlama Kromatografisi ile Membran Protein Kalitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Burada kullanılan deney, küçük moleküller ve protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için hücresel termal kayma testi ile birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Küçük moleküllü bileşiğin protein hedef tahmini ve validasyonu

Kantitatif geri dönüşümsüz bağlama (qIT) testi, bir hedef proteinle seçici olarak etkileşime giren kovalent fragmanları tanımlamak için floresan tabanlı bir yöntemdir. Burada, qIT testini tanımlamak için örnek sonuçlar dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir.

Kantitatif Tersinmez Tethering Testi Kullanılarak Kovalent Fragman Taraması

Bu protokol, protein sentezinin doğal ürün/küçük molekül inhibitörlerini belirlemek için optimize edilmiş bir florometrik tarama metodolojisi tanıtmaktadır. Pratikliği, hem ilaç keşif teknikleri lisans eğitimi için hem de tıbbi kimya kampanyalarında uygulanması için uygun hale getirir.

Doğal Kaynaklardan Protein Sentezi İnhibitörlerinin Ön Taraması için Flüoresans Tabanlı Protokol

Keşfedin, protein-hedefleme küçük molekül ilaç taraması için hızlı ve nicel florimetrik yöntemi. İlaç yüklü protein şablonunda floresan altın nanokümeleri sentezleyerek ilaç bağlanma afinitesini belirleyin.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

Daha fazla video keşfet