Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

Bu yeni florometrik ilaç tarama yönteminin genel amacı, ilaç yüklü protein şablonu içinde floresan altın nano kümeleri oluşturarak küçük ilaç moleküllerinin bir hedef proteine bağlanma afinitesini belirlemektir. Bu yöntem, ilaç moleküllerinin vidding gücünün, proteinlerin açılımını nasıl etkileyebileceği ve farklı yoğunluklarda floresan altın nano kümelerinin def oluşumuna yol açabileceği gibi, protein hedefleme ilaç keşifleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tenix'in ana avantajı, karmaşık aletlere ve sıkıcı etiketleme adımlarına ihtiyaç duymadan küçük moleküler ilaçların hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için bir protein hedefini floresan biyosensöre dönüştürebilmemizdir.

Kendi bilgimin yanı sıra ortak yazarın birleşimi, proteini yüklediğini keşfetti, plazmonik üzerinde belirgin bir stabilizasyon etkisine sahip. Nanopartikül bu yöntem fikrine ilham verdi. Bu prosedüre, insan serum albümini veya HSA şablonlu altın nano kümelerini hazırlamak için metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ilaç taraması için kimyasal reaktiflerin hazırlanmasıyla başlayın, her biri iki ayrı sıcaklık kontrol edilebilir manyetik karıştırma çubuğu içeren iki cam şişe yerleştirilir.

Bir manyetik karışımın sıcaklığını 60 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra, 200 mikrolitre insan serum albümin çözeltisi, 200 mikrolitre ultra saf su ve 200 mikrolitre altın klorür çözeltisi ekleyin, altın iyonlarının protein şablonu içinde kapsüllenmesini sağlamak için sürekli karıştırma altında her şişeye, iki dakika sonra, insan serum albümininin altın nano kümelerini bilgilendiren azaltma kabiliyetini aktive etmek için her şişeye 20 mikrolitre sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Reaksiyon süresini her 20 dakikada bir sıfır dakikada bir kaydetmeye başlayın.

Her numuneden 50 mikrolitre çekin ve 384 kuyulu siyah bir plakaya aktarın. Emisyon spektrumunu bir mikroplaka okuyucu ile ölçün. 100 dakika sonra manyetik karıştırmayı durdurun.

Cam şişeleri bir lavaboda akan su altında soğutun. Farklı sıcaklık koşullarında altın nano kümelerin oluşum kinetiğini elde etmek için her numune için her zaman foto emisyon spektrumlarını çizin. Sığır serum albüminini veya BSA şablonlu altın nano kümelerini hazırlamak için, manyetik bir karıştırmanın üstüne mikro manyetik karıştırma çubuğu içeren bir cam şişe yerleştirin.

Sıcaklığı oda sıcaklığı olarak bırakın. 200 mikrolitre BSA çözeltisi, 200 mikrolitre üre ve 200 mikrolitre altın klorür çözeltisini cam şişede sürekli karıştırarak karıştırın. İki dakika sonra 20 mikrolitre sodyum hidroksit çözeltisinde.

BSA'nın altın nano kümeler oluşturmak için indirgeme yeteneğini etkinleştirmek ve reaksiyon süresini sıfır dakika olarak kaydetmeye başlamak. Reaksiyon karışımının foto emisyon spektrumunu saatlik olarak ölçün. Her biri manyetik bir karıştırma çubuğu içeren ve sıcaklık kontrol edilebilir çok noktalı manyetik karıştırmanın üzerine bir ilaç veya saf HSA ile önceden etiketlenmiş beş cam şişe yerleştirin.

Her şişeye 200 mikrolitre HSA ekleyin. Daha sonra, karşılık gelen dört dosyaya önceden hazırlanmış her bir ilaç çözeltisinden bir mikrolitre ekleyin. Ayrıca, karıştırma üzerindeki kontrol anahtarına bir mikrolitre DMSO ekleyin.

Sıkma hızını 360 RPM'ye ayarlayın ve ilacın bir saat sonra HSA'ya bağlanmasına izin vermek için bir saat boyunca inkübe edin, 200 mikrolitre mili Q su ve 200 mikrolitre altın klorür çözeltisi sürekli karıştırılır. 10 dakika boyunca sürekli karıştırarak sıcaklığı 60 santigrat dereceye ayarlayın. Her dosyaya 20 mikrolitre 1.5 molar sodyum hidroksitten 10 dakika sonra ve reaksiyon süresini sıfır dakikada kaydetmeye başlayın.

Ölçüm için eklem reaksiyon çözeltileri, aynı ilaç ekleme sırasını takip etmeli ve zaman gecikmesi etkisini en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk uygulanmalıdır: Her şişeden hızlı bir şekilde 50 mikrolitre çözelti çekin. 384 kuyulu bir siyah plakaya aktarın ve emisyon spektrumunu ölçün. Her numunenin emisyon spektrumlarını her 10 dakikada bir kaydedin ve dört farklı zamanda en az dört spektrum toplayın.

Tutarlı bir eğilime sahip sonuçlar elde etmek için bu adımları birkaç kez tekrarlayın. Her numune için zaman çözümlü foto emisyon spektrumlarını çizin. Tüm numunelerin tepe yoğunluğunu belirleyin ve her bir ilaç ile HSA arasındaki bağlanma sabitini ölçmek için farklı ilaç yüklü protein şablonlarındaki altın nano kümelerinin oluşum kinetiğini karşılaştırmak için zamana karşı çizin.

İlaç çözeltilerini dört farklı konsantrasyonda ibuprofen çözeltileri ile değiştirin. 10 dakika sonra, cam şişeleri bir lavaboda akan su altında soğutun. Yukarıdaki çözeltilerden 50 mikrolitreyi her flakondan 384 oyuklu siyah bir plakaya çekin ve emisyon spektrumunu ölçün.

Manyetik karıştırmayı durdurmadan önce farklı ilaç konsantrasyonlarında iki set sonuç elde etmek için bu adımları iki kez daha tekrarlayın. Ardından foto emisyon spektrumlarını çizin ve her bir partide elde edilen ham için sonuçları analiz edin. Origin Pro gibi bir yazılımda her bir numunenin fotoğraf emisyon spektrumlarını çizin ve en yüksek yoğunluğu belirleyin.

İlaç konsantrasyonuna karşı bağıl floresan yoğunluğunu hesaplayın ve çizin. Ardından, verileri tek bir site bağlama modeline sığdırarak bağlama sabitini hesaplayın. Bunu Origin Pro gibi yazılımlarda yapmak için Mics cementin denklemini kullanma.

Doğrusal olmayan eğri uyumuna uyan menü analizini seçin, ardından ayarlar işlevi seçim sayfasındaki büyüme sigmoidal kategorisinden dolu işlevini seçin. Görüntülemek için sığdır'ı tıklayın. Burada gösterilen uygun sonuçlar, farklı protein denatürasyon koşullarında üretilen altın nano kümelerinin zamanla çözülmüş foto emisyon spektrumlarının temsili sonuçlarıdır.

Altın nano kümelerin daha yüksek sıcaklıkta daha hızlı oluştuğu gözlemlenebilir. Üre denatüre etme koşulu, şablon olarak BSA proteini kullanılarak altın nano kümelerinin doğrudan sentezini de kolaylaştırabilir. Şablon olarak ilaç yüklü HSA kullanılarak altın nano kümelerin floresan yoğunluğuna dayalı hızlı florometrik ilaç taramasının tipik sonuçları burada gösterilmektedir.

Floresan yoğunluğu ne kadar yüksek olursa, bir ilaç molekülünün HSA'ya bağlanma gücü o kadar zayıf olur. Bu spektrumlar, ilaç yükleme konsantrasyonunun ibuprofen yüklü HSA içindeki floresan altın nano kümelerinin oluşum hızı üzerindeki etkisini göstermektedir. İlaç konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, burada gösterilen elde edilen altın nano kümelerinin floresan sinyali o kadar düşük olur, protein ilaç bağlanma sabiti belirlemesinin temsili bir sonucudur.

MICU'ların çimentin denklemi kullanılarak çeşitli konsantrasyonlarda ibuprofen ilacı ile önceden yüklenmiş HSA şablonunda sentezlenen altın nano kümelerin nispi floresan yoğunluğunun uydurulmasıyla hesaplanır Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse paralel olarak çoklu ilaç taraması için 30 dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, artık dizginlerin nasıl sentezleneceğini, ilaç yüklü proteinde nano kümelenmenin nasıl yapılacağını ve elde edilen altın nano kümelerden yayılan floresan sinyali ile tespit edilebilen ilaçların bir hedef proteine bağlanma afinitesini nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.