Name: İnsan Mezenkimal Kök Hücre İmmünomodüler Properties (MKH) değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Keşfedin insan mezenkimal kök hücrelerinin immünomodüler özelliklerini periferik kan lökositleriyle ko-kültür sistemi kullanarak. Bu yöntem, hücre proliferasyonunu ve tedavi potansiyelini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen NHRI'den (CS-104-PP-06'dan BLY'ye) alınan hibelerle desteklenmiştir.

Kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanan Hasta onam insan hücrelerinin kullanımı için alınması gerekir. İnsan Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 1. yoğunluk gradyan izolasyonu (PBMC) <ol><li> 25 ml&#39;lik bir pipetle 50 ml&#39;lik bir tüp içine tam kan heparinize 25 ml ilave edilir. <ol><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS), 25 ml hücreleri seyreltilir. </li></ol></li><li> Yeni 50 ml&#39;lik bir tüp içine Ficoll Paque yoğunluk gradyanı 15 ml ilave edilir, ve tüpü eğerken, tam kan herhangi bir karıştırma ile olduğu şekilde çok yavaş ve dikkatli bir şekilde yoğunluk gradyanı içinde seyreltilmiş hücre süspansiyonu, 25 ml eklemek yoğunluk gradyan, yani., kan-yoğunluk gradyan arayüzünün hiçbir rahatsızlık. </li><li> Santrifüj 20 ° C &#39;de fren olmayan 30 sıcaklık kontrollü bir sallanma-kepçeli rotor içinde 40 dakika için 400 x g&#39;de aşama 1,2 süspansiyon. Not: üç farklı tabakalar, santrifüj işleminden sonra belirgin olmalıdır: the üst katman varlık plazma; alt berrak tabaka Ficoll Paque yoğunluk gradyan olmak; ve ince, orta hücresel tabaka PBMC&#39;leri olmak </li><li> Aspire edin ve mononükleer hücrelerin (örneğin, lemfositler, monositler ve trombositler) interfaz tabakası bozmamaya dikkat sahip bir Pasteur pipeti ile emme ile üst tabaka atılır. </li><li> Dikkatli bir şekilde yeni bir 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne, 10 ml bir pipet ile bu tek çekirdekli hücre faz toplanır. </li><li> , 20 ml PBS ile tüp doldurun, iyice karıştırılmakta ve 20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje tabi tutun. Santrifüj sonra tamamen süpernatantı. </li><li> 20 ° C&#39;de 10-15 dakika boyunca 200 x g&#39;da hücre PBS, 20 ml pelet ve santrifüj yeniden süspanse edin. Santrifüj sonra tamamen süpernatantı. Not: Bu adım trombositler-istenmeyen-içinde PBMC&#39;ler vardır kaldırır; Bu adım, trombositlerin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için tekrar edilebilir. </li><li> Belirli nüfusun herhangi bir seçim isebir hücre sayımı 16 gerçekleştirdikten sonra kültür için arzu edilen lökosit tam bir ortam içinde tekrar süspansiyon hücre topağı (% 10 fetal bovin serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin / RPMI-1640 ortamı içinde streptomisin) içinde 1 ml askıya Bir sonraki adıma geçmeden önce 10 7 PBMC&#39;lerin başına ortam. </li></ol> Lökosit Populasyonlarının 2. Manyetik Etiketleme (Belirli popülasyonlarının hiçbir Seçim Gerekli ise 4. adıma atlayın) <ol><li> Tamamen 10 dakika ve aspirat süpernatant için 300 × g Santrifüj PBMC süspansiyon. </li><li> 10 7 toplam hücre başına PBS 80 ul süspanse hücre pelet. </li><li> 10 7, toplam hücre başına (T lenfositlerinin izolasyonu için monositler, CD4 manyetik boncuk izolasyonu için, yani, CD14 manyetik boncuklar) belirtilen manyetik boncuk 20 ul ekle. </li><li> İyice karıştırın ve buzdolabında 8 ° C&#39;de 2 ila 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Yıkamak için 10 7 hücre başına PBS 1-2 ml ekleyin ve santrifüj10 dakika boyunca 300 x g&#39;de. </li><li> Süpernatant aspire tam ve 500 ul PBS içinde 10 8 hücrelere kadar yeniden süspanse edin. </li></ol> Lökosit alt popülasyonlarının 3. Manyetik Seçimi Not: manyetik boncuk ayırıcılar ve sütun çeşitli üreticileri bir dizi hücre yüzeyi işaretleyicisi tarafından lökositlerin özel nüfus izolasyonu için kullanılabilir. İzolasyon, bir veya bir kaç olumlu belirteçleri üzerine veya istenmeyen popülasyonlarının tükenmesi sonrasında negatif seleksiyon tarafından temelli pozitif seçimi ile olabilir. (Yani, monositler için CD4 T yardımcı lenfositler için veya CD14), bir işaretleyici kullanılarak pozitif seçim gerçekleştirmek genel bir yaklaşım, aşağıda özetlenmiştir. <ol><li> Hazırlama ve birinci manyetik ayırıcı üreticinin talimatlarına uygun ayırma kolonu da dahil olmak üzere. </li><li> Etiketli PBMC&#39;lerin örneğini içeren tüp uygulayın. Olumlu etiketli ve unlabel toplanması için iki adet 15 ml santrifüj tüpleri sağlayınimalatçının talimatlarına uygun olarak ed hücre fraksiyonları,. </li><li> 10 7 hücre başına ortam 1 ​​ml kullanılarak hücre sayısı 15 sayın ve lökosit tam bir ortam içinde pozitif seçilen lökosit (örneğin, CD4 + T lenfositleri veya CD14 + hücreler) yeniden süspanse edin. </li></ol> Proliferasyonunun Değerlendirme lökosit 4. KAKE Boyama Not: KAKE yaygın in vivo ve in vitro çalışmalar hem immünolojik araştırmalarda kullanılmaktadır. Bizim protokol MSC / PBMC (ya da diğer lökosit) etkileşimlerinin in vitro çalışma için optimize edilmiştir. KAKE in vitro etiketleme yürüten genel adımlar benzer olmakla birlikte, protokolün 14 özel doz ve zamanlama farklılıklar olabilir. Bu, bir dizi faktöre, örneğin kullanılan özel hücre tipi, hücre sayısı olabilir kullanılmış olan büyük olasılıkla CFSE floresan sinyalin şiddetini etkileyebilir. <ol&gt; <li> 10 uM (CFSE-çalışma çözeltisi), istenen bir çalışma yoğunluğuna PBS içinde CFSE stok solüsyonu (10 mM) ile seyreltilir. CFSE-çözelti ile etiketlenmesi için 10 7 hücreleri (örneğin, PBMC&#39;ler veya T hücreleri) hazırlayın. </li><li> 10 dakika için 300 × g Santrifüj hücre pelet elde etmek ve süpernatant aspire. </li><li> Yavaşça önceden ısıtılmış (37 ° C) CFSE-çalışma çözeltisi 1 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin. </li><li> Fazla CFSE yıkayın için, önceden soğutulmuş (4 ° C) RPMI ortamı,% 10 FBS ihtiva eden (hacim ile) 10x hücre süspansiyonu seyreltin. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj hücreleri tortu ve supernatant atın. Iki kere daha bu şekilde hücre pelletini yıkayın. </li><li> Santrifüj hücreleri yeniden pelet ve hücre sayısını 15 saymak. 1 ml yeni, önceden ısıtılmış lökosit tam bir ortamda 10 7 hücreleri (PBMC&#39;ler veya T hücreleri olarak) yeniden süspanse edin. </li></ol> M 5. Co-kültürLökosit ve lökosit Aktivasyonu ile SC&#39;ler <ol><li> En fazla 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;ye kadar ön-sıcak MSC komple ortam (optimum MSC büyümesi için önceden test% 10 FBS (),% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin / DMEM-düşük glikoz ortamında streptomisin). </li><li> 24 oyuklu plakalar içinde MSC tam orta 1 ml 50,000 hücre (MSC yoğunluğu: 25.000 hücre / cm2) de tohum erişkin 37 ° C kuluçka makinesi içinde ek olarak O / N, kök hücre için izin% 80 konfluansa ulaşmalarına. </li><li> Tohumlanmış MSC numaraları göre orta aspire ve, CFSE etiketli PBMC ekleme (daha önce işaretlenmiş lütfen yukarıda protokolü Adım 4&#39;e bakınız), bir lökosit tam orta 1 ml (24 oyuklu plakalar içinde bir önceki güne tohumlanmış) kültürlenmiş MSC&#39;Iere 01:10 (hücre oranı) PBMC&#39;lerden için MKH ko-kültür oranı. </li><li> 1 ml lökosit tam orta toplam hacim içinde 10 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar, mitojen fitohemaglutinin (PHA), spesifik olmayan bir lökosit etkinleştirici Oyuk başına. <ol><li> Alternatively, özellikle T lenfositlerin aktivasyonu için uyarmak için: α-CD3 / 28, mikro-boncuklar kullanımı ve 1 bir kordon T&#39;ye lenfosit oranını elde etmek için, iki hücre ortak-kültürünün eklemek: 1 arasındadır. </li></ol></li><li> 500.000 PBMC / Negatif kontrol, levha (hücre yoğunluğu ya da belirli bir efektör nüfusunun lökosit: 250.000 lökosit / cm2) için, sadece 1 ml lökosit ortamla, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, Pozitif kontrol için, ek olarak, iyi PBMC&#39;lerin / aynı sayıda kaplama için 10 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar PHA ekleyin. </li><li> 3 ve ko-kültür deney 5 gün, fluoresein için uygun 488 nm eksitasyon ve emisyon filtreleriyle akış sitometrik analizi 17 CFSE etiketli lökosit çoğalmasının (yuvarlak dipli tüplerine yerleştirilmiştir) değerlendirir. Not: Akış sitometri analizi için hücre içi sitokin boyaması da mo olarak lökosit sitokin ekspresyon profili değişiklikleri değerlendirmek için, bu noktada bu KAKE etiketli lökositlere gerçekleştirilebilirMKH tarafından dulated. KAKE fluoresein için bir filtre uygun değerlendirilmiştir olduğundan, antikorlar, çeşitli sitokinler floresein veya benzer yelpazenin dışındaki fluorochromes konjuge gereken değerlendirmek için seçilen (yani, fikoeritrin, klorofil protein kompleksinin (PerCP) peridinin). </li></ol> 6. Varyasyon: Efektör baskılama tahlili Manyetik Aktif CFSE etiketli Efektör CD4 + T hücreleri üzerinde bağışıklık ayarlayıcı Lökositler MSC ile indüklenen, Boncuk seçilen <ol><li> 6-yuvalı plakalar içinde MSC tam orta 3 ml 250,000 hücreler (MSC yoğunluğu: 25.000 hücre / cm2) de tohum erişkin 37 ° C kuluçka makinesi içinde ek olarak O / N, kök hücre için izin% 80 konfluansa ulaşmalarına. En az 3 ila 6 oyuklu plakalar alt popülasyonu seçimi için yeterli MSC-kültive PBMC&#39;ler sağlamak için gereklidir. </li><li> Kültür ortamı basınçla, ve Adım 1 &#39;deki gibi fakat / oyuk (hücre yoğunluğu 2.5 x 10 6 hücre 6 oyuklu plakalar içinde ayrılmış PBMC ekleyin: 250,000 leLökosit tam orta 3 ml ukocytes / cm2). 37 ° C kuluçka makinesi içinde 48-72 saat boyunca Co-kültür. </li><li> Manyetik Bölüm 2-3 uyarınca MSC kaynaklı immünomodülatör lökositlerin (yani, CD14 + hücreler) spesifik nüfusu boncuk seçin. Notlar: akış sitometri analizi için hücre içi sitokin boyaması lökosit sitokin ekspresyon profili, yani ekspresyonunda değişiklikler için değerlendirmek üzere bu noktada gerçekleştirilebilir interlökin-10-as MSC tarafından modüle. </li><li> 24 oyuklu plakalar içinde Bölüm 2-4 uyarınca üretilen allojenik CD4 + T hücrelerinin CFSE etiketli ekle 1 lökosit komple ortam (T hücre yoğunluğu: 250.000 hücre / cm2) arasında mi çeşitli oranlarda Boncuk seçilen MSC kaynaklı lökosit örneğin, 1:10, 1: 5, 1: 2 ve 1: 1 oranları (hücre hücre). </li><li> CD4 + T hücreleri teşvik etmek, 1 bir kordon-hücre oranı elde etmek α-CD3 / 28 konjuge mikroboncukları ekleyin: 1. </li><li> Negatif kontrol için, 5 plaka00.000 CD4 + T hücre / oyuk, 24 gözenekli bir plaka (T hücre yoğunluğu: 250.000 hücre / cm2) &#39;de, sadece 1 ml lökosit tam orta; Pozitif kontrol için, ek olarak 1, bir kordon-hücre oranını elde etmek için α-CD3 / 28 konjuge mikroboncukları eklemek / oyuk, CD4 + T hücreleri aynı sayıda kaplama: 1 arasındadır. </li><li> Eş-kültür 3. gününde, fluoresein için uygun 488 nm eksitasyon ve emisyon filtreleriyle akış sitometrik analizi ile 16 (yuvarlak tabanlı tüp içine yerleştirilmişlerdir) CFSE etiketli CD4 + T hücrelerinin proliferasyonunu değerlendirmek. </li></ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor+cells+of+mechanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Precursor cells of mechanocytes.</a> Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+stromal+cells+as+stem+cells+for+nonhematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.</a> Science. 276, 71-74 (1997).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Yen, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+cells+from+human+term+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent cells from human term placenta.</a> Stem Cells. 23, 3-9 (2005).</li>
<li>Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitor+cells+in+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.</a> Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).</li>
<li>Chang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placenta-derived+multipotent+cells+exhibit+immunosuppressive+properties+that+are+enhanced+in+the+presence+of+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma.</a> Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).</li>
<li>Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+properties+of+human+adult+and+fetal+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).</li>
<li>Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMuul%2C+LM+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Chen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+immunomodulatory+monocytes+by+human+mesenchymal+stem+cell-derived+hepatocyte+growth+factor+through+ERK1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2.</a> J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).</li>
<li>Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOughton%2C+JA+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).</li>
<li>Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhelan%2C+MC+%22Curr+Protoc+Cytom%22">Curr Protoc Cytom</a>. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).</li>
<li>Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+capacity+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells.</a> Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).</li>
<li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+treatment+of+steroid-resistant%2C+severe%2C+acute+graft-versus-host+disease%3A+a+phase+II+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study.</a> Lancet. 371, 1579-1586 (2008).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307, 1169-1177 (2012).</li>
<li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+inhibit+and+stimulate+mixed+lymphocyte+cultures+and+mitogenic+responses+independently+of+the+major+histocompatibility+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex.</a> Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+in+vitro+impairs+the+immunosuppressive+activity+of+mesenchymal+stem+cells+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells.</a> Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).</li>
<li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties?</a> Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).</li>
<li>Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+accumulation+mediates+differentiation+capacity+alteration%2C+but+not+proliferative+decline%2C+in+senescent+human+fetal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Giderek artan bir şekilde, MKH'lerin immünomodülatör özellikleri, bu kök hücrelerin18-20 çok soylu kapasitesinden daha hızlı bir şekilde klinik kullanıma çevrilmektedir. Bu nedenle, MSC'lerin lökositlerle birlikte kültür teknikleri ve bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmek için yapılan tahliller, etkili terapötik uygulamayı optimize etmek için bu özelliklerde yer alan spesifik mekanizmaları daha fazla tanımlamak için önemlidir. 
Bu tahlillerde başarı için en kritik teknik yönlerden ...

İnsan mezenkimal kök hücreler (MKH) bir kaç extramesodermal soy 5 yanı sıra, kemik, kıkırdak ve yağ dokusunda 1-4 paraxial mezodermal soy içine ayırt edebilirsiniz somatik atalarıdır. İlk erişkin kemik iliğinden izole, bu mültilineaj atalarıdır artık klinik uygulama 9-12 için son derece müsait görünen güçlü bağışıklık düzenleyici özelliklere sahip oldukları gösterilmiştir, beklenmedik, çok sayıda dokularda 6-8 bulunabilir ve oylandı. Immünomodülatör etkileri katılan Detaylı mekanizmalar aktif spesifik hastalık varlıklar üzerinde etkili uygulama için araştırılmaktadır. Immünmodülasyonu değerlendirmek için en basit yollarından biri efektör lökosit çoğalması 13 bastırılması için değerlendirilmesi gereğidir. Uyarılmış ya da aktive olduğunda örneğin T lenfositler ve monositler gibi çoğu efektör lökositler müthiş eğlenir çoğalırlar. İmmünomodülatuar fonksiyonu değerlendirilebilir zaman bastırmaçoğalması kanıtlanmıştır. Geleneksel olarak, efektör lökosit proliferasyonu DNA içine [3H] timidin eklenmesi saptanması ile değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, radyasyon ve kullanım sonrası imha endişelerine önemli dezavantajları, hem de gereken karmaşık bir ekipmana sahiptir. Hücre çoğalmasını değerlendirmek için radyoaktif olmayan tahliller olmakla birlikte, carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) deneyi gibi birçok hücre tipini içeren ko-kültür deneyleri özellikle yararlı olan, özel hücresel popülasyonlar, tanımlanması için izin verilmesi gibi başka avantajlara da sahiptir. CFSE, akış sitometrik analizi ile tespit edilebilir bir flüoresan hücre boyadır. Hücre bölünmeleri gibi, bu hücresel etiketin yoğunluğu orantılı azalır; Bu sadece genel hücre çoğalmasının tespitine imkan değil, aynı zamanda floresan det zorlaşır önce 8 tümen kadar hücre bölünmeleri sayısına değerlendirilmesi için izin verirEKT arka plan sinyali karşı. Ayrıca, flüoresan CFSE stabilitesi hücreleri aylarca 14 kadar görselleştirilebilir şekilde etiketlenmiş hücrelerin in vivo izlenmesi için izin verir. Bu deney de efektör lökosit veya spesifik popülasyonlarının bağışıklık fonksiyonunun belirli türde değerlendirmek için değişik olabilir ve manyetik boncuk yüzey işaretleyici seçimi gerçekleştirerek bağışıklık lökosit-interlökin-10 (IL-10) üretilmesi, CD14 + monositleri 15 olarak MSC-kaynaklı önce veya uygun bir şekilde eş-kültür sonrası ilgi hücre popülasyonları. Bizim protokol (akış şeması gösterilmiştir (akış şeması Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi) efektör lökositler üzerinde MSC immünomodülatör etkileri belirlemek temel deneyi ve allojenik CD4 + efektör T lemfositlerinin MSC-uyarılan lökosit immünomodülasyon değerlendirilmesi için bu temel tahlilinde bir değişik biçimi tarif edilmiştir Şekil 4&#39;te).

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AG</td><td>Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) izolasyonu için büyük yoğunluk</td></tr> <tr><td>canlıCanlı CFDA-SE Hücre İzleyici Kiti (CFSE)</td><td>Life Technologies</td><td>V12883</td><td>Hücre bölünmesinin tespiti için hücresel etiket</td></tr><tr><td>Fitoaglütininin (PHA)</td> <td>Sigma</td><td>L8902</td><td>İnsan PBMC'lerinin</td></tr><tr><td>aktivasyonu Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3 / 28</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>111.32D</td><td>İnsan T lenfositlerinin aktivasyonu, örn. CD4+ T hücreleri, CD8+ T hücreleri, etc.</td></tr><tr><td>autoMACS&trade; Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>autoMACS & trade; Ayırıcı</td><td>Manyetik tabanlı hücre ayırıcı</td></tr><tr><td>autoMACS&reg; Sütunlar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td>ayırma sütunları</td></tr><tr><td>CD14 mikro boncuklar, insan&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>PBMC'lerin CD4 mikroboncuklarından CD14+ insan monositleri ve makrofajlarının pozitif seçimi için</td></tr><tr><td>, insan&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>PBMC'lerden CD4+ insan T lenfositlerinin pozitif seçimi için</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>11875</td><td>İnsan PBMC / lökosit kültürü ortamı</td></tr><tr><td>DMEM, Düşük glikoz, piruvat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11885</td><td>İnsan mezenkimal kök hücre (MSC) kültür ortamı</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-081</td><td>MSC tam besiyeri</td></tr><tr><td>için takviye Penisilin / Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15070-063</td><td>PBMC / lökosit ve MSC tam orta Fetal</td></tr><tr><td>sığır serumu (FBS)</td> için takviye1<td>) MSC kültürü için hiklon&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2) Yaşam Teknolojileri, diğer tüm hücreler için (yani PBMC'ler, spesifik lökosit popülasyonları)</td><td>1) SH30070.03M 2) 10091-148</td><td>MSC in vitro kültürünün desteklenmesi için ön test lotları</td></tr><tr><td>24 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Corning</td><td>COR3524</td><td>Ko-kültür plakası</td></tr><tr><td>50 ml santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>Ficoll-Paque PLUS ile tam kandan PBMC'lerin</td></tr> izolasyonu <tr><td>15 ml santrifüj tüpü&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430766</td><td>Etiketli ve etiketsiz hücre fraksiyonlarının toplanması</td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td>352008</td><td>Akış sitometrik analizi için hücrelerin toplanması</td></tr></tbody></table>

İnsan mezenkimal kök hücre İmmünomodüler properties (mkh) değerlendirilmesi

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Çok soylu insan mezenkimal kök hücrelerinin (MSC'ler) immünomodülatör özellikleri, çok çeşitli bağışıklıkla ilişkili hastalıklara yönelik klinik kullanım için oldukça ilgili görünmektedir. İlgili mekanizmalar giderek daha fazla aydınlatılmaktadır ve bu makalede, efektör lökosit proliferasyonunun baskılanması için test yaparak MSC immünomodülasyonunu değerlendirmek için temel deneyi tanımladık. Aktivasyonu temsil eden lökosit proliferasyonu bir dizi teknikle değerlendirilebilir ve bu protokolde, müteakip akış sitometrik analizleriyle lökositleri etiketlemek için floresan hücresel boya karboksifloresein süksinimidil esterin (CFSE) kullanımını açıklıyoruz. Bu teknik sadece radyoaktivite olmadan proliferasyonu değerlendirmekle kalmaz, aynı zamanda meydana gelen hücre bölünmelerinin sayısını da değerlendirebilir ve aynı zamanda çoğalan hücrelerin spesifik popülasyonunun ve hücre içi sitokin / faktör ekspresyonunun tanımlanmasına izin verir. Ayrıca, tahlil, MSC'lerle ko-kültürden önce tek periferik kan mononükleer hücre popülasyonlarının manyetik boncuk yüzey işaretleyici seçimi ile efektör lökositlerin spesifik popülasyonlarını değerlendirmek için uyarlanabilir. Bu ko-kültür testinin esnekliği, MSC'ler ve lökositler arasındaki hücresel etkileşimleri araştırmak için yararlıdır.

Şekil 1, deney genel şema gösterir, ve Şekil 2, faz-kontrast ters mikroskobu ile gösterildiği gibi çeşitli hücre kültürü koşullarının görünümünü göstermektedir. PBMC&#39;ler ve lökositlerin küçük yuvarlak yapışmayan hücreler iken erişkin bir fibroblastik, iğ şeklinde morfolojiye sahip yapışmayan hücreler bulunmaktadır. Bu iki morfolojik olarak farklı hücre tipleri açık bir şekilde ko-kültür görülebilir. Testin sonunda, PBMC&#39;ler (veya leuckotyes) Akış sitometrik için aspire edildiğinde yapışık MKH yanlış...

İnsan mezenkimal kök hücrelerin (MSC) immünomodülatör özellikleri, klinik uygulama için giderek daha önemli görünmektedir. Floresan boya carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) ile ön-lekeli MSC ve periferal kan lökositlerinin bir ko-kültür sistemi kullanılarak, efektör lökosit çoğalmasının ve spesifik alt popülasyonları MSC immünomodülasyon in vitro değerlendirme tarif eder.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İmmünomodüler Properties (MKH) değerlendirilmesi

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Bu deneyin genel amacı, insan mezenkimal kök hücrelerinin veya msc'lerin immünomodülatör özelliklerini değerlendirmektir. Bu yöntem, terapötik öneme sahip olabilecek bir süreç olan insan mezenkimal kök hücre immünomodülasyonunda yer alan mekanizmaların aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem efektör lökosit proliferasyonunun gerçekleşmesinin hem de hücre bölünme sayısının değerlendirilebilmesiyle prosedürün per shoe olarak kanıtlanabilmesidir.Laboratuvarımdan bir teknisyen; PBMC'leri izole etmek için, 25 ml heparinli tam kan örneğini 50 ml'lik konik bir tüp içinde 25 ml PBS ile seyrelterek başlayın. Ardından, yeni bir 50 ml'lik tüpe 15 ml Ficoll-Paque yoğunluk gradyanı ekleyin. Daha sonra, tüpü eğik tutarak, seyreltilmiş hücre süspansiyonunu yoğunluk gradyanının üzerine yavaşça katmanlandırın.Buna dikkat edildiğinde, katmanların birbirine karışması önlenir. Bu deneydeki en kritik adımlardan biri, yoğunluk gradyanını bozmadan kanın katmanlar halinde eklenmesidir. Bu işlem, izole edilen pbmc'lerin yüksek saflıkta olması ve düşük eritrosit kontaminasyonu içermesini sağlamak içindir.Şimdi, hücreleri santrifüjasyon yoluyla ayırın. Üç belirgin tabaka görülmeli

assessment-immunomodulatory-properties-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) efektör T hücresi proliferasyonu üzerindeki immünomodülatör etkisini araştırmak için bir in vitro testi göstermektedir. Test, monosit popülasyonunu immünomodülatör bir fenotip kazanmaya teşvik etmek için MSC'lerin PBMC'lerle birlikte kültürlenmesini içerir ve bu da interlökin-10'un (IL-10) salgılanmasına yol açar. Aktive edilmiş CD4 + T hücreleri ile inkübasyonun ardından, indüklenen monositler T hücresi proliferasyonunu etkili bir şekilde baskılar.

Monositlerin Lökosit Proliferasyonu Üzerindeki İmmünomodülatör Etkisini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

Burada, Mezodermal Progenitör Hücreleri (MPC'ler) insan kemik iliğinden (hBM) izole etmek için optimize edilmiş, yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü açıklıyoruz. MPC'ler akım sitometrisi ve nestin ekspresyonu ile karakterize edildi. Anjiyojenik potansiyellerini korurken katlanarak büyüyen MSC benzeri hücre kültürlerine yol açma yeteneğini gösterdiler.

İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

Mezenkimal kök/stromal hücrelerin (MSC'ler) terapötik potansiyeli iyi belgelenmiştir, ancak hücreleri hastalar için hazırlamanın en iyi yöntemi tartışmalıdır. Burada, deneysel ve klinik uygulamalar için kseno içermeyen koşullar altında hazırlanmış MSC'lerin terapötik küresel agregalarını veya 'sferoidlerini' verimli bir şekilde oluşturmak ve yönetmek için protokoller iletiyoruz.

Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı

Fare modelleri kolon iltihabı çalışmalarda Mezenkimal Kök hücre (MSC) küçük bir yüzdesi (% 1-5) intravenöz enjekte veya intraperitoneally iltihaplı kolon1,2için ev gösterdi. Bu çalışmada ultrason destekli MSCs İntrakardiyak enjeksiyonlari bağırsak için artan yerelleştirme neden gösterir.

Ultrason destekli İntrakardiyak enjeksiyon bağırsak için giriş için deneysel iltihabi bağırsak hastalıkları fare modellerinde kullanım artırmak için insan Mezenkimal Kök hücre

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Heterojen insan UC-MSC'lerini oluşturan üç ana alt gruptan biri olan BAMBIyüksekMFGE8yüksek MSC'lerin izolasyonu, belirli hastalıklarda klinik etkinliği artırmak için gelecekteki uygulaması için bu alt tipin özelliklerinin ve işlevlerinin tam olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Burada, BAMBIyüksekMFGE8yüksek UC-MSC'leri sıralamak için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan BAMBIyüksekMFGE8yüksek Göbek Kordonu Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücrelerin İzolasyonu

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Keşfedin insan mezenkimal kök hücrelerinin immünomodüler özelliklerini periferik kan lökositleriyle ko-kültür sistemi kullanarak. Bu yöntem, hücre proliferasyonunu ve tedavi potansiyelini değerlendirir.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İmmünomodüler Properties (MKH) değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet