Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

Bu prosedürün genel amacı, gene özgü floresan nanopartiküller uygulanarak canlı hücrelerdeki hücre içi gen ifadesini doğrudan analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen gendeki uygun hedef dizilerin belirlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise spesifik yakalama ve raporlayıcı zincirlere sahip nanopartiküller üretmektir.

Ardından, nanoparçacıklar doğrudan canlı hücrenin kültür ortamına eklenir. Son adım, hücrelerin nanoparçacıklarla birlikte nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C ve %5 CO2 sıcaklık ve koşullarında gece boyunca inkübe edilmesidir. Nihayetinde, canlı hedef hücrelerdeki gene özgü floresans görüntülendiği için floresans mikroskobu, floresan hücrelerin sayısını belirlemek için ise akış sitometrisi analizi kullanılır.

Bu tekniğin immünohistokimya, moleküler beaconlar veya PCR analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, gen ekspresyonunun hücre kültürüne herhangi bir müdahalede bulunmadan canlı hücrelerde görsel olarak gözlemlenebilmesidir. Prosedürü laboratuvarımızdan biyolog ve doktora öğrencisi Martina Teresa ve akış sitometrisi kısmını Lynette Henkel gösterecektir. Hedef sekanslar belirlendikten sonra, ticari olarak mevcut kaynaklardan liyofilize altın nanopartiküller sipariş edin.

Bu partiküller, bir yakalama dizisine kovalent olarak bağlanmış merkezi bir altın partikülden ve bu yakalama dizisine bağlı bir raporlayıcı diziden oluşur. Hedef mRNA yakalama dizisine bağlandığında, raporlayıcı dizi ve ona bağlı florofor çözeltiye salınarak Fluor four'un floresans yaymasını sağlar. Yeniden oluşturma işleminden önce.

Nanoparçacıklar, dört °C'de, karanlıkta ve karton bir kutu içerisinde saklanmalıdır. Altın nanoparçacıkları yeniden çözmek için, nihai konsantrasyon 100 nM olacak şekilde 20 µL çift distile su ekleyin. Yeniden çözülen nanoparçacıklar, oda sıcaklığında, karanlıkta en az bir yıl boyunca saklanabilir.

Uygulama gününde, altın nanopartikül stok çözeltisini PBS içerisinde 20 x'lik bir çalışma çözeltisi olacak şekilde seyreltin; HEK 2 93 hücreleri içeren 24 kuyucuklu plakayı hücre kültürü inkübatöründen çıkarın, besiyerini aspire edin ve ardından 237.5 µL taze kültür besiyeri ekleyin, daha sonra hazırlanan her kuyucuğa 12.5 µL nanopartikül çalışma çözeltisi pipetleyin ve nanopartiküllerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı dairesel hareketlerle sallayın. Hücreleri nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C ve %5 CO2'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün.

Hücreleri akış sitometrisi için hazırlamak amacıyla, standart bir floresan mikroskobu kullanarak hücre kültürlerini gene özgü bölge üç floresansı açısından analiz edin. Bölge üç indüklemeli floresans gösteren HEK 2 9 3 hücrelerini bir kez PBS ile yıkayın ve bir mililitre %0,05 trypsin EDTA ekleyin; hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında üç dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 0,5 mililitre CO medium ekleyin ve pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın.

Ardından hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Üç mililitre kültür ortamı ekleyin ve tüpü 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 200 µL buz gibi soğuk FACS tamponu içerisinde resüspande edin. Hücreleri 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve analiz aşamasına kadar buz üzerinde, karanlıkta saklayın.

Faks analizinden önce, hücre agregasyonunu önlemek için hücreleri 30 µm'lik bir filtreden geçirin. Ardından, hücrelere final konsantrasyonu 2 µg/mL olacak şekilde propidyum iyodür ekleyip en az iki dakika bekletin, hücreleri akış sitometresine götürün ve örnek tüpünü cihaza yükleyin. SI üç pozitif hücreyi tespit etmek için.

Hücre döküntülerini ve tekil saçılan hücreleri dışlamak için; ileri saçılım (FSC) alanı ile yan saçılım (SSC) alanı alt kümesi, FSC yüksekliği ile alt küme FSC'si ve SSC yüksekliği ile alt küme SSC'si üzerindeki hiyerarşik kapıları ayarlamak amacıyla işlem görmemiş kontrol hücrelerini kullanın. PE kanalını PE Texas Red kanalına karşı görüntüleyerek, propidyum iyodür boyamasına dayanarak ölü hücreleri analizden çıkarın ve ardından üçüncü bölgedeki PE pozitif hücreler üzerinde final ayıklama kapısını uygulayın. GA dh tespiti.

Deneysel uygulanabilirliği doğrulamak için HEK 293 hücrelerinde konstitütif olarak eksprese edilen bir housekeeping geni kullanılmıştır. Scrambled negatif kontrol nanoparçacıklar çok az floresan gösterirken veya hiç göstermezken, kalıcı floresan gösteren pozitif alım grubu belirgin floresans sergilemiştir. Kontroller, gece boyu süren inkübasyonun ardından güçlü sinyal göstermektedir.

Bu nanoparçacıkların, insan ve porcine indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (IPC'lerin) yansıtılmasında pluripotent kök hücre belirteçleri olan nano ve GDF three gen ekspresyonunu spesifik olarak tespit ettiği gösterilmiştir. Önemli bir nokta olarak, bu belirteçler yalnızca IPC'lerde tespit edilmiş, IPS hücre kültürü sırasında besleyici tabaka olarak kullanılan fibroblast hücrelerinde tespit edilmemiştir. GA DH nanoparçacıklarının sıfırdan 1000'e kadar olan dereceli edisyonlarının etiketleme verimliliğini değerlendirmek için hem görsel analiz hem de akış sitometrisi yoluyla kantitatif analiz kullanılmıştır.

PICO molar, floresansta belirgin konsantrasyona bağlı artış gösteren HEK 2 93 hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. Ardından, 400 PICOMOLAR GA DH nanoparçacıklarının eklenmesini takiben yaklaşık %40 CY üç pozitif hücre sergileyen fare embriyonik kök hücrelerinde kantitatif analiz yapılmıştır. Pluripotentlik belirteçleri için benzer değerler elde edilmiştir.

Nano ve GDF three bir kez kavrandıktan sonra, bu teknik düzgün şekilde uygulandığında 16 saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan mikroskobu kullanarak canlı hücrelerde hücre içi gen ekspresyonunu doğrudan tespit etmek için gene özgü nanopartiküllerin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.