2.3: Model Organizmaların Genetik Mühendisliği

Genetik mühendisliği, transgenez olarak bilinen bir süreçte model organizmaların genomlarını değiştirmek için kullanılan değerli bir araçtır. Gelişimsel biyolojide, bu yaklaşım genellikle canlı dokularda görselleştirilebilen değiştirilmiş genleri ifade etmek için kullanılır. Alternatif olarak, genetik mühendisliği, belirli genlerin gelişimsel işlevini incelemek için protein ekspresyonunu önlemek veya bozmak için kullanılabilir.

Bu video, bu teknolojinin arkasındaki ilkeleri özetleyecek, bazı genetik mühendisliği prosedürlerini gözden geçirecek ve bu tekniklerin laboratuvarda nasıl kullanıldığını vurgulayacaktır.

Başlamak için, transgenezin altında yatan bazı önemli kavramları inceleyelim. Bu, DNA'nın bir model organizmanın genomuna yerleştirilmesini içerir. Çalışma hedefine bağlı olarak bir dizi yaklaşım vardır.

İlk olarak, değiştirilmiş bir genin eklenmesi, bir mutasyona bağlı fonksiyonel veya morfolojik değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Başka bir yöntem, genellikle bir mutasyon kadar zararlı olabilen aşırı ekspresyonun etkilerini incelemek için değiştirilmemiş vahşi tip genin ek kopyalarını koymaktır. Farklı bir yaklaşım, canlı hayvanlarda gen ekspresyonunun yerini ve zamanlamasını izlemek için yeşil floresan proteini gibi görselleştirilebilir bir etiket içeren bir füzyon proteini eklemektir.

Genoma yerleştirilecek DNA segmenti, istenen ifade kalıplarını ve sonuçlarını üretmek için dikkatli bir şekilde tasarlanmalıdır. Bir genin ne zaman ve nerede ifade edileceğini belirleyen bir dizi elemanı olan promotör, çok önemli bir bileşendir. Bazı promotörler hemen hemen tüm dokularda her yerde eksprese edilirken, diğerleri sadece belirli dokularda aktiftir. Kimyasal uygulama veya yüksek sıcaklıklara maruz kalma ile aktive edilen indüklenebilir promotörler, gen ekspresyonunun zamanlamasını kontrol etmek için de kullanılabilir.

Dokularda kararlı bir şekilde ifade edilebilmesi için, bir transgenin önce genoma entegre olması gerekir. Bunu başarmak için, transgenler, organizmanın genomunun alanlarıyla eşleşen yan DNA dizilerini içerebilir. Bu, transgenin homolog rekombinasyon olarak bilinen bir süreçle konakçı DNA ile bütünleşmesine izin verir. Alternatif olarak, bazı türlerde transpozon adı verilen özel elementler, transgenin genoma rastgele yerleştirilmesini katalize eden transpozaz enzimi için tanıma bölgeleri dahil ederek transgenezi daha verimli hale getirebilir.

Artık transgen tasarımının bazı temellerini bildiğinize göre, transgenik bir hayvanın nasıl yapıldığını gözden geçirelim. Transgen yapısını yapmak için, PCR kullanarak ilgilenilen geni amplifiye ederek başlayın. Bu amplifiye edilmiş bölge daha sonra transgeni hücrelere taşıyabilen bir DNA parçası olan bir vektöre klonlanır. Vektörler tipik olarak, E. coli gibi bakteriler kullanılarak verimli transgen amplifikasyonuna izin veren elementler içerir. Bu amplifikasyon adımından sonra, vektör bakteri kültüründen saflaştırılır.

Transgenik hayvanlar, saflaştırılmış DNA'nın embriyolara enjekte edilmesiyle yapılır. Balıklarda ve kurbağalarda, yapılar genellikle doğrudan tek hücreli aşama embriyolarının yumurta sarısına veya sitoplazmasına enjekte edilir. Transpozon aracılı transgenez için, transpozaz enzimini kodlayan bir transkript enjeksiyon karışımına eklenir.

Farelerde transgenez, sperm ve yumurta pronükleuslarının henüz kaynaşmadığı yeni döllenmiş yumurtaların manipülasyonu ile gerçekleştirilebilir. Yapı doğrudan daha büyük pronükleusa enjekte edilir, burada hücre bölündükçe genoma entegre olabilir. Yumurtalar daha sonra gelişim için yalancı gebe bir dişinin rahmine nakledilmelidir.

Transgenez verimliliği değişir, bu nedenle yapının genoma başarılı bir şekilde entegre olduğu dölleri belirlemek için hayvanlar taranmalıdır. Bu, kolay tanımlama için yerleştirilmiş bir floresan etiketi arayarak veya küçük doku parçalarından izole edilen genomik DNA'nın PCR'si gibi moleküler analizler yoluyla yapılabilir.

Genetik mühendisliğine ikinci bir yaklaşım, gen fonksiyonunu bozmak için spesifik gen hedeflemesine odaklanır. Bu hedefe ulaşmak için birden fazla yaklaşım vardır. Genom düzenleme olarak bilinen nispeten yeni bir yöntem, DNA omurgasını kesen ve DNA onarılırken genlerde mutasyonlara neden olan nükleaz adı verilen diziye özgü enzimlerden yararlanır.

Başka bir hedefleme yöntemi, bir geni ya yabancı DNA ya da rekombinazlar olarak bilinen enzimler için tanıma dizileri ile çevrili genin bir kopyası ile değiştirmek için homolog rekombinasyonun kullanılmasını içerir. Rekombinazlar mevcut olduğunda, yan dizi genomdan çıkarılacaktır. Bu, koşullu nakavt olarak bilinir ve gen eksizyonunun kontrolü, enzimin belirli dokularda veya belirli zaman noktalarında eksprese edilmesiyle sağlanabilir.

Homolog rekombinasyon ile nakavt fareler oluşturmak için genel bir prosedürü gözden geçirelim. Burada, genomik DNA dizisinin bir kısmının yabancı DNA ile değiştirildiği bir yapı hazırlanmalıdır. Bu DNA genellikle antibiyotik direnci gibi başka bir geni kodlar ve bu da daha sonraki adımlarda başarılı bir şekilde değiştirilmiş hücreleri seçmek için bir yol sağlar.

Prosedüre başlamak için, embriyonik kök hücreler, blastosist olarak bilinen erken bir fare embriyosunun iç hücre kütlesinden toplanır. Doğrusallaştırılmış yapı daha sonra, elektrik darbelerinin hücre zarında geçici gözenekler oluşturduğu elektroporasyon yoluyla kök hücrelere iletilir. Hücrelerin daha sonra, transgen olmadan hücreleri ortadan kaldırmak için bir antibiyotik varlığında inkübe edilmesine izin verilir.

Bu seçim adımından sonra, kök hücreler blastosist aşamasında başka bir fare embriyosuna enjekte edilebilir. Embriyolar daha sonra gelişmeye devam etmek için dişi bir farenin rahmine transfer edilir. Ortaya çıkan yavrular, hem vahşi tip hem de nakavt hücrelerden oluşan kimeralar olacaktır. Bazı kimeralar, germ hatları içinde, yetiştirildiklerinde bozulmuş geni iletecek ve daha sonra yeni bir nakavt hattı oluşturacak olan nakavt hücrelere sahip olacaktır.

Gelişimsel modellerin genetik mühendisliğinin temellerini öğrendiniz, şimdi bazı pratik uygulamalara bakalım.

Gelişimsel çalışmalar, hücreleri tanımlamak ve gelişimlerini incelemek için genellikle floresan etiketli proteinleri kullanır. Dokuya özgü promotörler kullanılarak, transgenik organizmalar, nöral krest gibi belirli hücrelerde floresan proteinleri eksprese etmek için tasarlanabilir. Gelişmiş görüntüleme teknikleri kullanılarak, floresan hücreler gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve araştırmacıların karmaşık gelişimsel olayları doğrudan görselleştirmelerine olanak tanır.

Genetik mühendisliğinin bir diğer önemli kullanımı, belirli genleri ve bunların hastalık fenotiplerindeki rolünü incelemektir. Burada, hedeflenen mutasyonlar, TALEN'ler gibi nükleazlar kullanılarak spesifik bir fare genine sokulur. PCR, farenin mutasyona uğramış genin sıfır, bir veya iki kopyasına sahip olup olmadığını gösterir. İki mutant kopya taşıyan embriyolar artık genin gelişimsel işlevini belirlemek için ayrıntılı olarak incelenebilir.

Bilim adamları, koşullu nakavtları kullanarak, sınırlı bir hücre kümesi içindeki bir genin işlevini belirleyebilirler. Burada, tüm embriyo boyunca loxP ile çevrili bir gen eksprese edildi, ancak Cre sadece endotel hücrelerinde eksprese edildi ve bu da kalpte ve kan damarlarında bir gen silinmesine neden oldu. Bu dokuya özgü nakavt, embriyonik kalp atış hızında ölçülebilir bir değişiklikle sonuçlandı ve tüm organizmayı değiştirmeden bir genin lokalize rolünün nasıl test edileceğini gösteriyor.

JoVE'nin transgenik teknolojiyle tanışmasını izlediniz. Bu teknikler, genetik mühendisliğinin temellerini, ilgili bazı yöntemleri ve günlük bilimde nasıl uygulandığını anlamanıza yardımcı olur. Genetik mühendisliği birçok organizmada yaygın olarak uygulanabilir ve genetiğin gelişimsel hastalıklarda ve yetişkinlik döneminde ortaya çıkan hastalıklardaki rolünü incelemek ve anlamak için önemli bir araç olmaya devam edecektir. İzlediğiniz için teşekkürler!