Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, Aselüler üç boyutlu kemirgen böbrek hücre dışı matris iskelelerini insan renal epitel hücreleri ile yeniden çoğaltmaktır. Bu, ilk olarak, 26 saatlik bir süre boyunca renal arterden perfüze edilen bir dizi deterjan çözeltisi ile bir haw sıçan böbreğinin hücreden arındırılmasıyla gerçekleştirilir. Böbrek daha sonra sterilize edilir ve aselüler renal hücre dışı matris iskelelerine, özel olarak tasarlanmış bir Biore reaktör sistemi içinde sürekli antegrad arteriyel perfüzyon altında 40 milyon insan renal kortikal tübüler epitel veya RCTE hücresi enjekte edilir.

Sonuç olarak, RCTE hücrelerinin böbrek iskelesini yeniden doldurma yeteneği, ER ve perfüzyon testi ve immünohistokimyasal analiz ile değerlendirilebilir. Bu 3D hücre kültürü tekniği, araştırmacıların tüm organ hücre dışı matrisi yeniden çoğaltmasına izin verir. İskele hücreleri, hücre büyümesini, farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkileyen faktörlerin araştırılmasına ve bağlanmasına izin vermek için hücre dışı matris içindeki peritübüler boşluk içinde biriktirilir.

Bu tekniğin sentetik polimer iskelelerin imalatı gibi alternatif yöntemlere göre ana avantajı, renal hücre dışı matrisin, perfüze hücrelerin doğal yapısal proteinler, büyüme faktörleri ve diğer biyolojik bileşenlerden oluşan karmaşık bir ağ içinde yapışmasını, çoğalmasını ve olgunlaşmasını kolaylaştırmasıdır. Çözülen her böbreğin renal arter kateterini pompanın aşağısındaki perfüzyon devresi borusunun ucuna bağlayarak hücre çözme prosedürüne başlayın ve kateterde hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun. Kateterde hava kabarcıkları varsa, kabarcıkları çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir mikro pipet kullanın ve kateteri sıvıyla doldurun.

Böbreği beş litrelik boş bir beherin iç duvarı boyunca asın, böylece renal arter bükülmez veya kıvrılmaz ve pompa tahrikini dakikada beş mililitreye ayarlayın. Ardından, her bir böbreğin perfüze olduğunu onayladıktan sonra, organın altından solüsyonların damlamasını gözlemleyerek ve her bir böbrek, perfüzyonun sonundaki akış şemasında belirtildiği gibi uygun solüsyonlarla perfüze olduğunu onayladıktan sonra, hücrelerden arındırılmış böbrekleri PBS'de 50 mililitrelik konik bir tüpte dört santigrat derecede veya en fazla iki derecede saklayın. Perfüzyon devresini monte ettikten sonra, biyoreaktör kafasındaki kırmızı vidalı kapağı çıkarın ve asetik asit başına% 0.1, % 4'lük etanol çözeltisini% 50 mililitre açıklıktan orta rezervuara pipetleyin.

Büyük bir pompa kartuşu kullanarak peristaltik pompa hortumu segmentini pompa kafasına bağlayın. Ardından akış hızını dakikada beş mililitreye ayarlayın. Başlat'a basın ve sıvı füzyon hattını doldurduğunda ve üç yollu durdurma musluğunun kalan açık portuna ulaştığında devrenin dolmasına izin verin.

Bağlantı noktasını takmak için bir erkek yem tapası kullanın. Perfüzyon devresi borusunda veya girişin iç kısmında hava görülmeyene kadar devrenin tamamen dolmasına izin verin. Yem alıcısı, pompanın akış hızını geçici olarak artırarak kabarcıkları perfüzyon devresinden dışarı atar.

Sistem tamamen dolduğunda, pompa tahrikini durdurun ve altı inçlik forsepsleri sterilize edin. Renal arter kateterinin dişi yem ucunu erkek girişine dikkatlice tıkamak için, bağlantının sıkı olduğundan ve kateterde hava kalmadığından emin olarak biyoreaktör kafasının iç yüzeyine yem alıcısı yerleştirin. Renal arterin bükülmemesi veya bükülmemesi için böbreğin renal arter kateterinden nazikçe sarkmasına izin verin.

Ardından, biyoreaktör rezervuarının sıkıca kapatılması için biyoreaktör kafasını ve gövdesini bir arada tutan metalik kelepçeyi sıkın ve vidalı kapağı kapatın. Şimdi böbrekleri, dakikada beş mililitre asetik asit etanol çözeltisinin oda sıcaklığında perfüzyonu ile sterilize edin. Bir saat sonra pompayı durdurun ve kırmızı vidalı kapağı açın.

Steril bir haşere kullanarak, pipetiniz biyoreaktör rezervuarındaki tüm çözeltiyi dikkatlice aspire eder. Ardından biyoreaktör rezervuarına 50 mililitre taze PBS pipetleyin. Vidalı kapağı kapatın ve pompayı oda sıcaklığında dakikada beş mililitre olmak üzere üç ardışık bir saatlik perfüzyon için çalıştırın.

Son PBS durulamasından sonra, tuzlu suyu rezervuardan aspire edin ve vidalı bir kapak kapalıyken rezervuara 50 mililitre ortam ekleyin. Bağlı perfüzyon devresi ile biyoreaktörü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte büyük kapasiteli bir inkübatöre aktarın. Daha sonra biyoreaktör perfüzyon devresini pompaya bağlayın ve böbrekleri tohumlamadan en az bir saat önce dakikada dört mililitre perfüze edin.

Hücreselleştirmek için böbrekler, istenen oturma konsantrasyonu için yeterli sayıda kültür şişesi toplar. Daha sonra, kültür ortamını her bir şişeden aspire ettikten sonra, renal kortikal tübüler epitel hücrelerini şişeden 37 santigrat derecede kaldırmak için 10 mililitre uygun hücre ayrışma enzimi kullanın. 10 dakika sonra, katlama dekolmanı gözlenene kadar şişeleri her iki dakikada bir yüz kontrast mikroskobunda kontrol etmeye başlayın.

Daha sonra, sayım için küçük bir hücre alikotu aldıktan sonra, ilişkili hücre süspansiyonunu eşit hacimde önceden hazırlanmış ortamda seyreltin ve hücreleri yeniden santrifüjleyin. Mililitre başına iki kez 10 ila yedinci hücrelerin nihai konsantrasyonunu elde etmek için peleti uygun bir hacimde kültür ortamı ile askıya alın. Oturma süspansiyonunun iki mililitresini, 35 milimetrelik bir kültür kabını aktarın ve ardından iki mililitrelik hacmi steril beş mililitrelik bir şırıngaya çekin.

Perfüzyon biyoreaktörünü biyolojik bir güvenlik kabinine aktarın ve oturma portuna giden akışı kapatmak için stop musluğu valfini çevirin. Erkek yem fişini çıkarın, durdurma musluğundan takın ve şırıngayı bağlayın. Daha sonra perfüzyon devresini hızlı bir şekilde inkübatöre geri aktarın ve hücreleri oturtmak için peristaltik pompa boru segmentini pompa kafasına sabitlemek için büyük pompa kartuşunu kullanın.

Pompaya doğru bakan stop musluğu valf portunu kapatın ve hücreleri yavaşça böbrek iskelesine enjekte edin. Ardından, şırıngadan gelen akışı kapatmak için musluk valfini çevirin ve pompayı dakikada 25 mililitre ile başlatın. 15 dakika sonra, pompa akış hızını dakikada dört mililitreye düşürün, ortamı ertesi gün ve daha sonra her iki günde bir değiştirin.

Hücrelerin canlılığını ve proliferasyonunu değerlendirmek için, tam olarak bir saat sonra böbrek iskelelerinin dakikada dört mililitre perfüzyonu için kültür ortamını 10 mililitre zarin çalışma çözeltisi ile aseptik olarak değiştirin, şartlandırılmış ve kısmen azaltılmış zarin çözeltisini toplayın ve dakikada dört mililitre daha perfüzyon gerçekleştirin. 100 mililitre taze kültürle, su ve seyreltik deterjan çözeltileri ile sırayla doldurulan orta böbrekler, son deterjan perfüzyonu ile 26 saatlik bir süre içinde giderek daha şeffaf hale gelir, böbreklerin damar ağı ve özellikle loblar arası damarlar, hücrelerden arındırılmış iskelede belirgin bir şekilde görüntülenir. Tüm organ, glomerül tübüllerinin ve toplama kanallarının sağlam bazal membran ağını ve hücre dışı kan damarlarının hücre dışı matrisini geride bırakarak doğal hücrelerden arındırılır.

Daha büyük damarlara ek olarak, glomerüller içindeki mikrovasküler bazal membranlar da yapısal bütünlüklerini korurlar. Az önce gösterildiği gibi, böbrek iskelesine ekilen RCTE hücreleri, öncelikle böbrek iskelesinin kortikal bölgelerine ev sahipliği yapar ve burada tercihen pereg glomerüler tübüllerini yeniden doldururlar. Tohumlamadan sonraki birinci günde glomerüllerin içine çok az hücre gömülür ve yedinci günde, glomerüller neredeyse hücrelerden yoksundur, bu hücrelerin çoğu ise renal hücre dışı matrisin kortikal bölgelerini işgal eder.

Yedi günlük antegrad perfüzyon kültüründen sonra, RCTE hücre repopülasyonu ve bir haftalık perfüzyon kültüründen sonra dış medüller ve papiller tübüllerde ve toplama ördeklerinde birçok RCTE hattı tübülü bulunur. Bununla birlikte, decellularizasyonu takiben gözlenen şeffaflık kaybolur ve ized böbrek opak ve görünüşte doğal durumuna daha yakın görünür. Bu prosedürü takiben, bu hücrelerin metabolik veya fenotipik durumları renal hücre dışı matris içinde nasıl değişir gibi ek soruları yanıtlamak için şartlandırılmış kültür ortamının immünokimyasal analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Hücre dışı iskeleler geliştirme ve matrise geri donör satışları ekleme yeteneği, araştırmacıların doğal renal ekzo matris iskeleleri içinde büyüme ve olgunlaşmayı üç boyutta tanımlamasına olanak tanır. Nihai amaç, bu teknolojiyi böbrek onarımı ve rejenerasyonu mekanizmalarını daha iyi anlamak için bir araç olarak kullanmaktır.