Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, değiştirilmiş gen ekspresyonunun epidermal büyüme ve farklılaşma üzerindeki etkisini belirlemek için yeniden canlandırılmış insan dermisini kullanarak genetik olarak modifiye edilmiş organotipik cilt kültürleri oluşturmaktır. Bu yöntem, dermatoloji alanında, epi büyümesinden, farklılaşmasından ve hastalığın ilerlemesinden hangi genlerin sorumlu olduğunu belirlemek gibi önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik olarak değiştirilmiş insan derisinin birkaç gün içinde üretilmesidir, bu da potansiyel olarak klinik olarak ilgili insan örneklerinin incelenmesine izin verir.

Prosedürü göstermek laboratuvarımdan jingly olacak. Donmuş insan derisi alıyorsanız, dokuyu çözülmesi için üç ila beş dakika doku kültürü başlığına yerleştirin. Çözüldükten sonra, dokuyu boyutuna bağlı olarak steril 50 mililitrelik konik bir tüpe veya 125 mililitrelik şişeye aktarın.

Daha sonra, kap% 75 dolana kadar bir XPBS'ye dört x penisilin ve streptomisin ekleyin. Kabı kapatın ve beş dakika kuvvetlice çalkalayın. Antibiyotik solüsyonunu çıkarın ve bunu tekrarlayın.

Son yıkamadan sonra üç kez daha adım atın, dokuyu yeni bir kaba aktarın ve taze antibiyotik solüsyonu ekleyin. Dermisin epidermisten ayrılmasını sağlamak için bu karışımı iki hafta boyunca 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. İki hafta geçtiğinde, epidermisi dermisten çıkarmak için forseps kullanın.

Epidermisi, kurumun insan dokusuyla ilgilenme protokolüne göre atın. Dermisi bir antibiyotik solüsyonu kabına koyun ve daha önce olduğu gibi kuvvetlice çalkalayarak yıkayın. Son yıkamadan sonra, dermisi yeni bir antibiyotik çözeltisi kabına aktarın ve transfeksiyondan bir gün önce kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın, tohum anka kuşu hücrelerini tam ortamda, kuyucuk başına 800.000 hücre yoğunluğunda altı oyuklu bir plakaya koyun.

Transfeksiyon gününde, altı mikrolitre transfeksiyon reaktifini 100 mikrolitre dmm ile karıştırın. Her bir oluğun transfekte edilmesi ve oda sıcaklığında inkübe edilmesi için Beş dakika boyunca, karışımı, transfekte edilecek her bir kuyucuk için üç mikrogram retroviral vektör içeren bir tüpe ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, bu karışımın tamamını anka kuşu hücrelerinin her bir oyuğuna damla damla ekleyin ve hücreleri transfeksiyondan sonraki gün gece boyunca inkübe edin. Ortamı anka kuşu hücrelerinden çıkarın ve aynı gün içinde iki mililitre taze tam ortam ekleyin.

Primer insan keratinositlerini keratinosit serumu serbest ortamda antibiyotiklerle yeniden süspanse edin ve oyuk başına 75.000 hücre yoğunluğunda altı duvar plakasına tohumlayın. Ertesi gün, transfekte edilmiş Phoenix hücrelerinden viral parçacıklar içeren ortamı hasat edin. Kirletici hücreleri çıkarmak için ortamı bir şırınga kullanarak 0,45 mikronluk bir filtreden geçirin.

Enfeksiyon sürecine aracılık etmeye yardımcı olmak için filtrelenmiş virüs içeren ortama mililitre başına beş mikrogram hekza dimetil bromür ekleyin. Daha sonra iki mililitre virüsü önceki gün kaplanmış keratinositlerin üzerine pipetleyin. Daha sonra, altı duvar plakasını oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 Gs'de bir santrifüjde döndürün.

Döndürme işleminden sonra, virüs içeren ortamı çıkarın ve atın. Hücreleri bir XPBS ile bir kez yıkayın ve ertesi gün taze K-C-S-F-M ekleyin. Az önce gösterilen prosedürü kullanarak aynı keratinosit grubunu virüsle enfekte edin.

Organotipik kasetler yapmak. 3,5 santimetrelik bir doku kültürü kabının kapağının ortasından bir santimetreye bir santimetre karelik bir çıkarmak için bir koter kullanın. Şeffaf oje kullanarak kasetin altına kare mandallar takın ve ojenin kuruması için beş dakika bekleyin.

Son olarak, kaseti ters çevirin ve kaseti, mandalların üzerinde bir kaset olacak şekilde altı santimetrelik bir tabağa yerleştirin. Dermisi dört santigrat derece depodan alın ve bir keratinosit büyümesi kabına aktarın. Yıkamak için orta.

Yıkamayı tekrarladıktan sonra, dermisi taze KGM'ye koyun ve iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, dermisi 1,5 santimetre x 1,5 santimetre büyüklüğünde parçalar halinde kesmek için bir neşter kullanın. Daha sonra organotipik olanın kare deliğine yerleştirin, dermisin üst kısmı yukarı bakacak şekilde ayarlanır.

Dermisi içeren tüm organotipik kaseti çevirmek için forseps kullanın. Dermisin dibine beş damla taze ough hücre dışı matris ekleyin ve dermis boyunca eşit dağılımı sağlamak için hafifçe sallayın. Hücre dışı matrisin beş dakika boyunca katılaşmasına izin verdikten sonra, kaseti ters çevirmek için forseps kullanın ve ardından altı santimetrelik tabağa dört mililitre KGM ekleyin.

Daha sonra, genetiği değiştirilmiş keratinositlerin toplanması ve sayılmasından sonra, Resus 90 mikrolitre KGM'de 0,5 ila 1 milyon hücreyi askıya alır ve hücreleri dermise dağıtır. Ko-kültürü 37 santigrat derecede inkübe edin. Kültürler üzerindeki medyayı her geçen gün değiştirin.

Epidermisin tam tabakalaşması ve farklılaşması genellikle beşinci günden sonra ortaya çıkar. Kaplamadan sonra 14 güne kadar doku toplanabilir. Bu görüntü, organopik hematin ve eozin boyamasını göstermektedir.

Cilt kültürleri yenilenen insan cildi hem epidermisi hem de dermisi içerir. Epidermis, farklılaşmamış bazal katman ve stratum, spinosum, ranum ve cornium dahil olmak üzere üç farklı katman dahil olmak üzere dört farklı katmanla tamamen tabakalaşır ve farklılaşır. Bu immünofloresan görüntüler, sağda gösterildiği gibi SNA i iki'nin aşırı ekspresyonunun, farklılaşma için sol boyamada gösterilen kontrol dokusuna kıyasla epidermal farklılaşmayı inhibe ettiğini göstermektedir.

Protein keratin bir veya K olanı yeşil renkle gösterilir ve çekirdekler mavi ile işaretlenir. Kontrolde SNAI iki, LAC Z ve S NNA I'de iki aşırı eksprese eden dokunun mRNA seviyelerini ölçmek için RTQ PCR R analizi, kontrole göre SNAI iki'nin 50 kattan fazla ekspresyonunu gösterir. Son olarak, bu RTQ PCR R analizi, SNA I iki'nin aşırı ekspresyonunun, TGM bir ve SPRR bir A gibi farklılaşmaya bağlı yapısal genlerin ekspresyon kaybına neden olduğunu göstermektedir.

Epidural büyüme ve farklılaşma mekanizmalarını belirlemek için kimyop, immünofloresan, RN, ae veya western blotlama gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, dermatoloji alanındaki araştırmacıların, gen fonksiyonunun cilt homeostazını nasıl etkilediğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, keratinositler ve dev insan dermisi kullanılarak genetiği değiştirilmiş organik insan derisi kültürlerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.