Name: Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, epidermal keratinositler ve cansızlaştırılmış insan dermisi kullanarak genetiği değiştirilmiş organotipik deri kültürleri üretmeyi. Bu yöntem, dermatolojide gen fonksiyonlarını hızla incelemek için klinik olarak uygun insan örnekleri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği Araştırma Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) ve CIRM Temel Biyoloji Ödülü (RB4-05779) supportedby oldu.

Insan derisi protokolü California Üniversitesi, San Diego&#39;nun Araştırma Etik Kurulu kurallarına uygun olarak gerçekleştirildi. İnsan derisi atılır cerrahi örneklerden elde edilen ya da (cilt banka Malzeme / Ekipman Tablo listelenen) deri bankalardan satın alınabilir. Deri veya verici yaşı türetilmiştir Yer deney sürece dermişte bazal membran bölgesi proteinleri (kollajen / laminin) için kritik değildir bozulmuş değildir. Güçsüz insan derisi hazırlanması 1. <ol><li> İnsan cildi aldıktan sonra, (~ 3-5 dakika) Çözülme doku kültürü kaputu doku yerleştirin. Cilt boyutuna bağlı olarak, steril bir tek 50 ml konik bir tüp ya da 125 ml şişe çözülmüş doku yerleştirin. Cilt bankadan cildin tipik boyutu 0.75 feet kare olduğunu. </li><li> 1x PBS içinde 4x penisilin ve streptomisin (pen / strep) ile% 75 tam doldurun. Kuvvetli bir şekilde çalkalanır5 dakika ve sıvı atmayın. Bu adımı 3 kez daha tekrarlayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, yeni bir tüp / şişe doku transferi ve kabın% 75 doldurmak için taze 4x pen / strep / PBS ekleyin. 2 hafta epidermis, dermiş ayrılmasını sağlamak için, 37 ° C &#39;de, bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde, bu karışım inkübe edin. </li><li> Steril koşullar altında, epidermis, dermis uzak soymak için forseps kullanabilir. Epidermis donör (Şekil 1A) yarış bağlı renklendirme sahip olurken dermis tamamen beyaz. İnsan dokusu ile başa çıkmak için kurumun protokolüne göre epidermis atın. </li><li> Bir tüp veya şişe dermis yerleştirilir ve (4 kez 5 dakika yıkama) karışımı içinde çalkalanarak 1 x PBS içinde seyreltilmiş 4x pen / strep yıkayın. Son yıkamadan sonra, kullanıma hazır olana değin 4 ° C&#39;de 4x pen / 1x PBS içinde seyreltilmiş strep ve mağaza yeni bir tüp / şişeye dermis aktarın. Dermis bir yıla kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol&gt; 2. Genetik değiştirme İlköğretim İnsan Keratinositler Not: primer insan keratinositleri enfekte virüs üretmek için tam DMEM ortamı [DMEM +% 10 fetal bovin serumu (FBS) + pen / strep] yetiştirilen kullanımlar amfotropik Phoenix hücreleri. Bu tür gag-pol ve zarf gibi proteinleri kodlayan viral paketleme genleri sabit şekilde bir retroviral vektör ile transfekte, virüs üretimi sağlar Phoenix hücre genomu içine entegre edilir. Phoenix hücreleri yüksek verim, yüksek viral titre üretimi için izin ile transfekte edilebilir. Bu paketleme hattı üretilen virüs aynı zamanda, insan da dahil olmak üzere memeli hücreleri büyük bir çeşitlilik bulaşabilir. <ol><li> Gün 1: Transfeksiyondan bir önceki gün, tam bir DMEM ortamında oyuk başına 800,000 hücrelik bir yoğunlukta 6-çukurlu plaka içindeki tohum Phoenix hücreleri. </li><li> Gün 2: Transfeksiyon gün 3 retroviral vektörler ug oyuk başına kullanımı. 1.5 ml tüp içine retroviral vektör alikosu 3 ug. 100 mikron bir karışımını kullanınl DMEM artı vektörün her 3 ug için transfeksiyon reaktifi 6 ul. 1.5 ml bir tüp içinde 100 | il DMEM ile transfeksiyon reaktifi 6 ul karıştırın. (Kullanılan retroviral vektörler ekipman / malzeme tabloda listelenmiştir). <ol><li> 5 dakika boyunca inkübe ve retroviral vektörün 3 ug ihtiva eden ön aliquoted tüpe 106 ul karışımı ekleyin. Karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Phoenix hücrelerinin her oyuğuna, bu tüm karışım damla damla ekleyin. </li></ol></li><li> 3. Gün: Transfeksiyondan bir gün sonra, anka hücrelerinden ortamını çıkarın ve taze tam DMEM medya 2 ml ekleyin. Aynı gün, oyuk başına 75,000 hücrelik bir yoğunlukta 6-çukurlu tabak içine primer insan keratinositleri tohum. Antibiyotik, bir keratinosit, serum barındırmayan ortam (KCSFM) (pen / strep) &#39;de keratinositler tutun. NOT: Birincil insan keratinositler satın alındı. Hücreler (Malzeme / Ekipman tabloda listelenmiştir) satıcılarının çeşitli satın alınabilir. </li><li> 4. Gün: HarŞimdi viral partikülleri içeren transfekte anka hücrelerinden, medya yelek. Bir şırınga kullanılarak, 0.45 um&#39;lik bir filtreden geçirin ortamı (herhangi bir kirletici Phoenix hücreleri çıkarmak için) ve keratinositler üzerinde 2 mi yer (önceki gün / oyuk 75.000 hücre yoğunluğunda kaplanmıştır: adım 2.3). Enfeksiyon sürecine aracılık yardımcı ortama heksadimetrin bromür (5 ug / ml) eklenir. Virüs titrleri ~ 1 x 10 7 TU / ml. <ol><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 xg&#39;de santrifüj 6 oyuklu plakalar dönerler. Spin sonra, virüs içeren ortamı çıkartın ve KCSFM eklemeden önce 1x kez PBS ile yıkama hücreleri. </li></ol></li><li> 5. Gün: tekrar adım 2.4 gibi keratinosit aynı toplu Infect. NOT: retroviral vektör üzerinde seçilebilir bir marker olması durumunda, bir ilaç kullanan keratinositleri seçip alt analiz veya organotipik kültürlerinin gibi uygulamalarda kullanım için genişletme. </li></ol> 3. Organotipik Cilt Kültürler Kurma <ol><li> Inşa etmekOrtak laboratuvar bulunan malzeme veya kasetlerden Organotipik kaset özel bir metal imalat dükkanı aracılığıyla yapılabilir (Şekil 2A - F). 3,5 cm doku kültür plakasının bu kasetleri yapmak için, bir 3,5 cm&#39;lik bir tabak (Şekil 2A-B), kapağın merkezi bir 1,0 cm x 1,0 cm kare kaldırmak için bir koterizasyon kullanın. Steril koşullar altında bunu yapın. <ol><li> Net oje (Şekil 2C) kullanarak kaset (3.5 cm çanak kapak) alt kare mandal takın. Oje için 5 dakika kurumasını ve kare mandal (Şekil 2B) dayanan böylece kaseti ters çevirin izin verin. 6 cm çanak içine kaseti yerleştirin. NOT: Kare sanat ve zanaat mağazalar çeşitli satın alınabilir mandal. </li></ol></li><li> Keratinosit büyüme ortamı% 66 DMEM,% 22 Ham F12, 100 birim / ml penisilin / ml streptomisin,% 10 FBS, 2.67 ug / ml adenin 100 ug, 40 n oluşan (KGM) hazırlayınug / ml hidrokortizon, 10 ng / ml, kolera toksini, 4.94 / ml insülin ug, 5 ug / ml transferrin, 1.36 ng / ml triiyodo-L-tironin, 10 ng / ml EGF ve 10 ng / ml, siprofloksasin hidroklorür. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C&#39;de 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden medyayı Filtre. </li><li> 4x pen / strep + PBS çözeltisi üzerinden dermis alın ve KGM içinde 2 kez yıkayın ve daha sonra kullanımdan önce iki gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe KGM. </li><li> 1,5 cm x 1,5 cm büyüklüğünde parçalar bir neşter kullanılarak dermis kesin ve sonra organotipik kaset üzerine yerleştirin. Yukarı bakacak şekilde dermis üst dermis yerleştirin. Dermis üst keratinositleri (Şekil 1B) ile temas durumuna gelir tarafında olacaktır. </li><li> (Şekil 3A) yukarı bakacak şekilde dermis üst tarafı ile organotipik kaset kare delikten üzerine önceden kesilmiş dermis yerleştirin. </li><li> Forseps kullanarak üzerinde dermis içeren tüm organotipik kaseti (Şekil 3B Çevir). Buz üzerinde hücre dışı matris çözümü çözülme. Kaset başına hücre dışı matriks solüsyonu 100 ul dışarı çekmek için bir iğne ve şırınga kullanın. Dermis (parlak tarafı) altına 5 damla ekleyin ve dermis (Şekil 3B) boyunca eşit dağılımını sağlamak için hafifçe sallayın. </li><li> Ticari ekstra hücresel matris çözümü için 5 dk tamamen (Şekil 3C) sağlamlaştırmak için izin verin. Katılaşma sonrasında geri üzerinde kaseti çevirmek için forseps kullanabilir. 6 cm çanak KGM 4 ml ekleyin. </li><li> Dermis (Şekil 3D) içeren organotipik kasetler üzerine 0,5-1.000.000 genetiği değiştirilmiş keratinositler yerleştirin. <ol><li> 5 dakika boyunca 10 cm plakalar üzerine% 0.05 tripsin 4 ml yerleştirilmesi ve tam bir DMEM ortamı, 4 ml ile söndürün ile Trypsinize keratinositler. </li><li> Hemasitometre kullanarak keratinositleri sayın ve sonra 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. Yeniden süspanse 0,5-1000000 hücreleri 90 μ yılında (mevcut hücre sayısına bağlı olarak)ve KGM l dermis üzerine tüm hücreleri koyun. Not: Bu, yeniden oluşturulmuş epidermisin kalınlığı görülen farklılık hücre sayısı başlangıç ​​farklılıklara bağlı olmadığından emin olmak için, aynı deney içinde deri üzerinde aynı sayıda hücre yerleştirilmesi önemlidir. Dermis üzerinde az 0,5 milyon hücre yerleştirilmesi yoksul tabakalaşma ve farklılaşma yol açabilir. </li></ol></li><li> Her geçen gün organotipik kültürleri KGM ortamı değiştirin. Hasat doku dermis üzerinde keratinosit yerleştirildikten sonra 1-14 gün. Epidermis tam tabakalaşma ve farklılaşma genellikle gün 5 sonra ortaya çıkar. </li></ol>

<ol><li>Tadeu, A. M., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells+in+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells in adult skin.</a> Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).</li>
<li>Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remembering+one%27s+identity%3A+the+epigenetic+basis+of+stem+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions.</a> FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).</li>
<li>Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+barrier+formation+and+recovery+in+skin+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders.</a> J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).</li>
<li>Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+function+in+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase function in epidermis.</a> J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).</li>
<li>Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+pathways+in+disorders+of+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation.</a> Trends Genet. 29, 31-40 (2013).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+differentiation%3A+the+bare+essentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal differentiation: the bare essentials.</a> J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).</li>
<li>Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+human+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in human skin tissue.</a> Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).</li>
<li>Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organotypic+culture+of+human+skin+keratinocytes+and+fibroblasts+to+achieve+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function.</a> Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).</li>
<li>Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Organotypic skin culture.</a> J Invest Dermatol. 133, e14(2013).</li>
<li>Sen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF750+Is+a+p63+Target+Gene+that+Induces+KLF4+to+Drive+Terminal+Epidermal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation.</a> Dev Cell. 22, 669-677 (2012).</li>
<li>Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+differentiation+in+a+self-renewing+mammalian+tissue+by+the+histone+demethylase+JMJD3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3.</a> Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAI2+controls+the+undifferentiated+state+of+human+epidermal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells.</a> Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).</li>
<li>Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+proliferation+and+differentiation+of+developmentally+mature+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes.</a> Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493, 231-235 (2013).</li>
<li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+function+in+self-renewing+human+epidermis+is+maintained+by+the+exosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome.</a> Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+progenitor+differentiation+requires+the+long+noncoding+RNA+ANCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR.</a> Genes Dev. 26, 338-343 (2012).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).</li>
<li>Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF750+interacts+with+KLF4+and+RCOR1%2C+KDM1A%2C+and+CTBP1%2F2+chromatin+regulators+to+repress+epidermal+progenitor+genes+and+induce+differentiation+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes.</a> Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).</li>
<li>Jameson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IQGAP1+scaffold-kinase+interaction+blockade+selectively+targets+RAS-MAP+kinase-driven+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors.</a> Nat Med. 19, 626-630 (2013).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+SNAI2+regulated+genes+in+primary+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+data%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes.</a> Genomics data. 4, 43-46 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Doebis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vitro+transduction+of+epithelial+cells+and+keratinocytes+with+improved+adenoviral+gene+transfer+for+the+application+in+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering.</a> Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).</li>
<li>Melo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+correction+of+junctional+epidermolysis+bullosa+by+a+highly+recombinogenic+AAV+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant.</a> Mol Ther. 22, 725-733 (2014).</li>
<li>Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+expansion+of+human+keratinocyte+stem%2Fprogenitor+cells+carrying+a+transgene+with+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res+ther%22%5BJournal%5D)">Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector.</a> Stem cell res ther. 4, 127(2013).</li>
<li>Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+maintains+progenitor+function+in+self-renewing+somatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue.</a> Nature. 463, 563-567 (2010).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).</li>
<li>Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+skin%3A+fibroblasts+facilitate+keratinocyte+growth+and+differentiation+on+acellular+reticular+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis.</a> J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).</li>
<li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+skin+models+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of skin models in drug development.</a> Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Organotipik kültürler birçok avantaj sunan insan derisinde Genetik manipülasyon yaygın 2B kültür hücreleri yanı sıra fare modelleri okudu etmek. 2B kültürleri sağlam organ ve dokularda bulunan üç boyutlu bir hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris etkileşimlerine yoksundur. Son çalışmalar da 16 tümörler birincil insan derisine çok daha fazla gen ifadesi benzerlikleri gösteren 3D kültür hücreleri ile 2D ve 3D kültür cilt kanseri hücreleri arasındaki muazzam farklar bulduk. İnsan Organotipik cilt kültürleri de f...

İnsan üst deri değil, aynı zamanda korumak için savunma bir birinci hattı olarak nem kaybını önlemek için sızdırmaz bir bariyer olarak hizmet eder bazal membran zone.The epidermis olarak bilinen hücre dışı bir matris boyunca yatan dermiş bağlanan bir tabakalı epitelyumdur yabancı ve zehirli maddelerden 1 vücut. Epidermisin derin katmanı bazal tabaka, epidermis 2 kalanını oluşturan farklılaşmış döl doğuran epidermal kök ve progenitör hücreler içerir. Epidermal progenitör hücrelerin ayırt olarak bunlar Spinoz tabakanın 3 olarak da bilinir farklılaşmış hücrelerin birinci tabakayı oluşturmak üzere yukarı doğru göç eder. Spinöz katmanda, hücreler daha sonra epidermis farklılaşmış katmanları fiziksel strese dayanma gücünü sağlayan keratinlerden 1 ve 10 ifadesi, açın. Spinöz tabaka hücreleri daha farklılaştırmak, onlar için epidermisin yukarı hareketplazma zarı altına monte edilir keratohyalin ve lameller granül oluşumunun yanı sıra, yapısal proteinlerin karakterize granüler tabaka m. Hücreler farklılaşma sürecinde devam ederken katmanlı granüller zengin koruyucu stratum corneum adı verilen bir lipidi 4 oluşturmak için hücreler ekstrüde edilirken, plazma membranı altından proteinleri birbirine çapraz bağlı bulunmaktadır. Epidermal büyüme ve farklılaşma etkisi ~ nüfusun 5% 20 değişiklikleri içeren hastalıklar. Bu durumda, bu işlemin mekanizmalarının anlaşılması önem taşımaktadır. Bu hastalıkların birçoğu tezahürü hücre-hücre veya hücre-matris temas etmesine bağlıdır, insanın epidermisin 3 boyutlu bir ortamda yeniden oluşturulur Organotipik kültürler 6-10 oluşturuldu. Bu yöntemler, tipik olarak, cansız insan gibi hücre dışı matrisin üzerine ekildi primer ya da dönüştürülmüş keratinositlerin kullanılmasını içerirDermiş, Matrigel veya kollajen. Epidermal büyüme ve farklılaşmasında önemli bir gen düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, genetik olarak keratinositler 2B kültür genleri demonte veya aşın ifade etmek üzere retroviral vektörler ile işlenmesi ve sonra 3D içinde yeniden edilebilir. Bu yöntemler, neoplazi 11-21 epidermal kök ve projenitör hücre kendini yenileme ve farklılaşma gibi ilerlemesinde rol oynayan genleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, retrovirüsler kullanımı yoluyla epidermal organotipik kültürlerinin gen ekspresyonunu değiştirmek için nasıl derinlemesine bir protokolü temin edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>İnsan</td><td>derisi New York İtfaiyeciler Cilt Bankası</td><td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amfotropik anka hücre hatları</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 transfeksiyonu reaktif</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit Ortamı (KCSFM)</td><td></td><td>DMEM</td> GIBCO 11995 Yaşam Teknolojileri 17005042 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Ham's F12 Cambrex 12-615F FBS GIBCO 10437-028 Adenin Sigma A-9795 Kolera Toksin Sigma <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp; C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td></td><td>Sigma I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>İnvitrojen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Siprofloksasin Hidroklorür</td><td>Serolojikler</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>koter</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 1 antikor</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>kare mandallar</td><td>Sanat ve el sanatları mağazaları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>insan yenidoğan keratinositleri</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>insan yenidoğan keratinositleri</td><td>Hücre Uygulamaları</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV retroviral vektör</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS retroviral vektör</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Retro.Puro Retroviral vektör</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>heksadimetrin bromür & nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

güçsüz İnsan dermis kullanma genetiği değiştirilmiş organotipik cilt kültürlerin Üretimi

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotipik kültürlerinin fonksiyonu ve in vivo doku meslektaşları fizyolojisini taklit hücre-hücre teması ve hücre-matriks etkileşimlerinin önemli bir 3 boyutlu bir ortamda tekrar oluşturulmasını sağlar. Bu sadakatle epidermal farklılaşma ve tabakalaşma programı özetlediği Organotipik cilt kültürler tarafından örneklenmiştir. Birincil insan epidermal keratinositler genleri kolayca aşırı veya aşağı çalınabilecek retrovirüslere yoluyla genetik olarak manipüle vardır. Bu genetik olarak değiştirilmiş keratinositler daha sonra genetik yollar, darbe epidermal büyüme farklılaşmasını ve hastalığın ilerlemesini araştırmak için güçlü bir model sağlanması Organotipik bir deri kültürlerinde, insan epidermisi yeniden oluşturmak için kullanılabilmektedir. Burada sunulan protokoller cansız insan dermiş hazırlanması hem de genetik olarak Organotipik bir deri kültürü oluşturmak için primer insan keratinositleri işlemek için yöntemleri tarif eder. Rejenere insan deri downstr kullanılabilirBöyle gen ifade profilleme, immün ve yüksek verimlilik sıralaması takip kromatin İmmüno olarak eam uygulamaları. Bu nedenle, bu genetik olarak değiştirilmiş organotipik cilt kültürlerin nesil cilt dengesini sağlamaya yönelik kritik genlerin belirlenmesini sağlayacaktır.

Organotipik insan cildi üreten ilk adım epidermis, dermis kaldırmaktır. 37 ° C 4x pen / strep / PBS derinin iki haftalık kuluçka epidermis (Şekil 1A), dermiş ayrılmasını sağlamak gerekir. Epidermis ve dermis ayıran zorsa o zaman bir hafta 4x kalem / strep 37 ° C / PBS de doku yerleştirin ve sonra tekrar soyulması forseps kullanarak deneyin. Devitalize dermis insan epidermis yenileyici anahtarlarından biri keratinositler dermis doğru tarafına yerleştirilir sağlamaktır. Dermiş...

Bu makalenin amacı, epidermal keratinositlerden ve devitalize insan dermisinden genetik olarak değiştirilmiş insan organotipik derisinin nasıl oluşturulacağına dair kapsamlı ve ayrıntılı bir protokol sağlamaktır.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Bu prosedürün genel amacı, değiştirilmiş gen ekspresyonunun epidermal büyüme ve farklılaşma üzerindeki etkisini belirlemek için canlandırılmış insan dermisi kullanılarak genetiği değiştirilmiş organotipik deri kültürleri üretmektir. Bu yöntem, hangi genlerin epidermal büyüme, farklılaşma ve hastalığa ilerlemeden sorumlu olduğunu belirlemek gibi dermatoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetiği değiştirilmiş insan derisinin birkaç gün içinde üretilmesidir; bu da potansiyel olarak klinik olarak ilgili olan insan örneklerinin incelenmesine olanak tanır.Prosedürün gösterimi laboratuvarımdan gerçekleştirilecektir. Dondurulmuş insan derisi alındığında, dokuyu çözünmesi için doku kültürü ön ısıtıcısında (hood) üç ila beş dakika bekletin. Çözündükten sonra dokuyu, boyutuna bağlı olarak steril bir 50 mililitre konik tüpe veya 125 mililitre şişeye aktarın.Ardından, kap %75 dolana kadar bir XPBS içerisine dört x penisilin ve streptomisin ekleyin. Kabın kapağını kapatın ve beş dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Antibiyotik solüsyonunu uzaklaştırın ve bu işlemi tekrarlayın.Son yıkamadan sonra üç kez daha basıp çekme işlemi yapın, dokuyu yeni bir kaba aktarın ve taze antibiyotik çözeltisi ekleyin. Dermisin epidermisten ayrılmasını sağlamak için bu karışımı bir doku kültürü inkübasyon cihazında 37 °C'de iki hafta boyunca inkübe edin. İki hafta geçtikten sonra, epidermisi dermisten soymak için pens kullanın.Epidermisi, insan dokularıyla çalışma konusundaki kurum protokolüne uygun olarak atın. Dermisi antibiyotik çözeltisi içeren bir kaba yerleştirin ve daha önce yapıldığı gibi güçlü şekilde çalkalayarak yıkayın. Son yıkamadan sonra, dermisi yeni bir antibiyotik çözeltisi kabına aktarın ve transfeksiyondan bir gün önce kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın; transfeksiyondan bir gün önce Phoenix hücrelerini, kuyuk başına 800.000 hücre yoğunluğunda, komple medyada altı kuyucuklu bir plakaya ekleyin.Transfeksiyon gününde, altı µL transfeksiyon reaktifini 100 µL dmm ile karıştırın. Transfekte edilecek her kuyu için, her bir kuyuya karşılık gelen üç µg retroviral vektör içeren bir tüpe bu karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu karışımın tamamını Phoenix hücrelerinin bulunduğu her bir kuyuya damla damla ekleyin ve hücreleri gece boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan bir gün sonra Phoenix hücrelerinden medyumu uzaklaştırın ve aynı gün iki mL taze complete medyum ekleyin.Primer insan keratinositlerini, antibiyotikli keratinosit serumsuz ortamda yeniden süspanse edin ve kuyuk başına 75, 000 hücre yoğunluğunda altı kuyucuklu plakalara ekleyin. Ertesi gün, transfekte edilmiş Phoenix hücrelerinden kaynaklanan viral partikülleri içeren medyumu toplayın. Kontamine hücreleri uzaklaştırmak için medyumu bir şırınga yardımıyla 0.45 mikronluk bir filtreden geçirin.Enfeksiyon sürecini kolaylaştırmak için, filtrelenmiş virüs içeren ortama mililitrede beş mikrogram heksadimetil bromür ekleyin. Ardından, virüsten iki mililitreyi bir önceki gün ekilen keratinositlerin üzerine pipetle aktarın. Sonrasında, altı kuyucuklu plakaları oda sıcaklığında, bir saat boyunca 200 G'de santrifüjleyin.Santrifüj işleminden sonra, virüs içeren medyumu uzaklaştırın ve atın. Hücreleri bir kez XPBS ile yıkayın ve ertesi gün taze K-C-S-F-M ekleyin. Aynı keratinosit grubunu, az önce gösterilen prosedürü kullanarak virüsle enfekte edin.Organotipik kasetlerin hazırlanması için. 3,5 cm'lik bir doku kültürü kabının kapağının merkezinden bir santimetreye bir santimetre boyutunda kare bir parça çıkarmak için koter kullanın. Kare destekleri şeffaf oje kullanarak kasetin altına sabitleyin ve ojenin kuruması için beş dakika bekleyin.Son olarak, kaseti ters çevirin ve kaseti, destek çubukları üzerinde duracak şekilde altı santimetrelik bir kaba yerleştirin. Dermisi dört derece Celsius depolama alanından çıkarın ve yıkamak için keratinosit büyüme ortamı içeren bir kaba aktarın.Yıkama işlemini tekrarladıktan sonra, dermisi taze KGM içine yerleştirin ve 37 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir bistüri kullanarak dermisi 1,5 cm x 1,5 cm boyutlarında parçalara bölün. Daha sonra, dermisin üst yüzeyi yukarı bakacak şekilde organotipik düzeneğin kare deliğine yerleştirin.Dermisi içeren organotipik kasetin tamamını ters çevirmek için pens kullanın. Dermisin altına beş damla taze hücre dışı matris ekleyin ve dermis boyunca eşit dağılımı sağlamak için hafifçe sallayın. Hücre dışı matrisin beş dakika boyunca katılaşmasını bekledikten sonra, pens kullanarak kaseti tekrar eski konumuna çevirin ve ardından altı santimetrelik kaba dört mililitre KGM ekleyin.Ardından, genetiği değiştirilmiş keratinositler hasat edilip sayıldıktan sonra, 0,5 ila 1 milyon hücre 90 µL KGM içinde süspanse edilir ve hücreler dermis üzerine dağıtılır. Ko-kültür 37 °C'de inkübe edilir. Kültürlerin besiyeri gün aşırı değiştirilir.Epidermisin tam tabakalaşması ve farklılaşması genellikle beşinci günden sonra gerçekleşir. Doku, ekimden sonra 14 güne kadar hasat edilebilir. Bu görüntü, organotipik dokunun hematoksilin ve eozin boyamasını göstermektedir.Yenilenmiş insan derisi içeren deri kültürleri, hem epidermisi hem de dermisi içerir. Epidermis, farklılaşmamış bazal tabaka ile stratum spinosum, granulosum ve corneum'u içeren üç farklılaşmış tabaka olmak üzere dört belirgin tabaka ile tamamen tabakalı ve farklılaşmıştır. Bu immünofloresan görüntüler, sağda gösterilen SNAi2 aşırı ekspresyonunun, solda gösterilen ve farklılaşma için boyanmış kontrol dokusuna kıyasla epidermal farklılaşmayı inhibe ettiğini göstermektedir.Protein keratin one veya K one yeşil renkte, çekirdekler ise mavi renkte işaretlenmiştir. Kontrol LAC Z ve S NNA I two aşırı ifade eden dokularda SNAI two mRNA seviyelerini ölçmek için yapılan RTQ PCR R analizi, kontrolle karşılaştırıldığında SNAI two'nun 50 katından fazla ifade edildiğini göstermektedir. Son olarak, bu RTQ PCR R analizi, SNA I two'nun aşırı ifadesinin TGM one ve SPRR one A gibi farklılaşma kaynaklı yapısal genlerin ifadesinde kayba yol açtığını kanıtlamaktadır. Bu prosedürü takip edin.Epidermal büyüme ve farklılaşma mekanizmalarını belirlemek için chip-seq, immünofloresan, RNA-seq veya western blotting gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, dermatoloji alanındaki araştırmacıların, gen fonksiyonundaki değişikliklerin cilt homeostazını nasıl etkilediğini keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, keratinositler ve türevi insan dermisi kullanarak genetiği değiştirilmiş organik insan cilt kültürlerinin nasıl oluşturulacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, melanom ilerlemesini incelemek için in vitro 3D organotipik cilt rekonstrüksiyonları oluşturmak için ayrıntılı protokol açıklanmaktadır. Bu cilt modeli, in vivo organların hem mimarisini hem de çok hücreli karmaşıklığını taklit eder.

Organotipik Tam Cilt Rekonstrüksiyonlarının Oluşturulması: İnsan Derisi Örneklerini Kullanarak 3D Cilt Modeli Oluşturma Prosedürü

Bu videoda, genetik olarak değiştirilmiş primer insan keratinositleri rekombinant retrovirüs üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yöntem, keratinositlerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için kullanılabilir.

Primer İnsan Keratinositlerinin Genetik Modifikasyonu: Rekombinant Retrovirüsler Kullanılarak Keratinositlerin Genetik Olarak Manipüle Edilmesi İçin Bir Yöntem

Bu video protokolü, epidermal keratinositler ve cansızlaştırılmış insan dermisi kullanarak insan organotipik cildi oluşturmak için kaset tabanlı bir in vitro kültür tekniğini açıklar. İn vivo doku muadillerinin işlevini ve fizyolojisini taklit ederler.

Organotipik 3D Cilt Kültürü: Aselüler Dermiste İnsan Epidermisini Yeniden Oluşturmak İçin Kaset Tabanlı İn Vitro Kültür Tekniği

Bu protokolün amacı, doğal cilde benzeyen üç boyutlu tam kalınlıkta bir cilt eşdeğeri oluşturmaktır. Özel olarak yapılmış bir otomatik yaralama cihazı ile, sterilitenin korunması altında hassas ve tekrarlanabilir yaralar oluşturulabilir.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Bu makromoleküler Crowders (MMC) kullanarak, hücre dışı matris protein açısından zengin hücre-türevi matrisleri elde etmek için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, yapının vadesinin korurken kültür süresini azaltır 3D Organotipik bir deri ko-kültür üretimi bölgesi MMC içeren bir protokol mevcut.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model...

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

Burada, biz mevcut her iki mimari beyannamedir bir 3D organotypic Melanom küresel Cilt modeli oluşturmak için bir protokol ve bir organ/tümör vivo içinde ama aynı zamanda çok hücreli karmaşıklık barındırır sistematik deneysel müdahale.

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Biz İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı lenfositi ve fibroblastlar ayırt etmek ve bir 3B cilt organoid oluşturmak gösterilmiştir bir protokol bu lenfositi ve fibroblastlar kullanarak öneriyoruz. Bu iletişim kuralı insanlaşmış fareler model oluşturma ek bir adım içerir. Burada sunulan teknik dermatolojik araştırma artıracaktır.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Bu protokolün amacı, uzun vadeli kültür için erişilebilir ve basit teknikler kullanarak damarlı insan derisi eşdeğerlerinin neslini ve hacimsel analizini tanımlamaktır. Mümkün olduğu ölçüde, adımların gerekçesi, araştırmacılara araştırma ihtiyaçlarına göre özelleştirme olanağı sağlamak için açıklanmıştır.

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Bu protokol, cilt mimarisini ve işlevini çoğaltmak için düzlemsel, fizyolojik olarak ilgili bir hava-sıvı arayüz kültür sistemi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden saç folikülleri içeren cilt organoidleri üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir.

Hava-Sıvı Arayüz Kültür Sistemi Kullanılarak İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Düzlemsel Saç Taşıyan Cilt Organoidlerinin Üretimi

Öğrenin, epidermal keratinositler ve cansızlaştırılmış insan dermisi kullanarak genetiği değiştirilmiş organotipik deri kültürleri üretmeyi. Bu yöntem, dermatolojide gen fonksiyonlarını hızla incelemek için klinik olarak uygun insan örnekleri sunar.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Daha fazla video keşfet